バングラデシュの養鶏場と生きた鳥の市場における鳥インフルエンザ A ウイルス H5N1 および H3N8 サブタイプの疫学と分子的特徴付け

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7912 (2023) この記事を引用

955 アクセス

11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

鳥インフルエンザウイルス（AIV）は依然として世界的な脅威であり、水鳥はウイルスが他の宿主に広がる主な感染源となっています。高病原性鳥インフルエンザ (HPAI) H5 ウイルスは、引き続き養鶏産業にとって壊滅的な脅威であり、人間にとっての初期の脅威でもあります。家禽におけるAIVの有病率とサブタイプ（H3、H5、H9）を推定し、潜在的な危険因子とAIVサブタイプH5N1およびH3N8の系統解析を特定するために、バングラデシュの7つの地区で横断研究が実施された。総排泄腔および中咽頭の綿棒サンプルを、生きた鳥市場 (LBM) および養鶏場で 500 羽の鳥から収集しました。各鳥から総排泄腔および中咽頭の綿棒採取によってサンプルが採取され、綿棒はさらなる分析のためにプールされました。プールされたサンプルは、インフルエンザ A ウイルス (IAV) マトリックス (M) 遺伝子について分析され、続いてリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (rRT-PCR) を使用して H5 および H9 分子サブタイピングが行われました。非 H5 および非 H9 インフルエンザ A ウイルス陽性サンプルの配列を決定して、可能性のあるサブタイプを特定しました。選択された H5 陽性サンプルをヘマグルチニン (HA) およびノイラミニダーゼ (NA) 遺伝子配列決定に供しました。リスク因子分析には多変量ロジスティック回帰が使用されました。 IAV M 遺伝子の有病率は 40.20% (95% CI 35.98-44.57) で、ニワトリ、水鳥、七面鳥ではそれぞれ 52.38%、46.96%、31.11% が検出されたことがわかりました。 H5、H3、H9 の有病率はそれぞれ 22%、3.4%、6.9% に達しました。水鳥は鶏と比較して、AIV (AOR: 4.75) および H5 (AOR: 5.71) に感染するリスクが高かった。夏よりも冬に多くのウイルスが検出されました（AOR: 4.93）。死んだ鳥は健康な鳥よりも AIV および H5 検出のリスクが高く、LBM では H5 検出の確率が増加しました。配列決定された6つのH5N1ウイルスはすべて、2015年以来バングラデシュの家禽や野鳥で流行しているクレード2.3.2.1a-R1ウイルスでした。私たちの研究で使用された 12 個の H3N8 ウイルスは、バングラデシュで発生した以前の H3N8 ウイルスよりも、モンゴルと中国の野鳥から発生したインフルエンザウイルスとの類似性が高い 2 つの遺伝子グループを形成しました。この研究の結果は、AIV の蔓延に影響を与える特定された危険因子を考慮して、AIV の管理と予防に関するガイドラインを修正するために使用される可能性があります。

Influenza A virus is a negative-strand RNA virus belonging to Orthomyxoviridae family, and the virion carries surface proteins known as hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA)1. Based on their potential to cause disease in chickens, avian influenza viruses (AIVs) are grouped into two categories: highly pathogenic avian influenza virus (HPAIV) and low pathogenic avian influenza virus (LPAIV)2,3,4. AIVs infect chickens, turkeys, and other gallinaceous birds and inflict significant economic losses worldwide5,6,7. In terms of humans and poultry, Bangladesh is one of the world's most densely populated countries. The poultry industry in Bangladesh supports economic growth and poverty reduction in rural and urban areas by creating employment opportunities and food products8. LPAIVs and HPAIVs, including the highly pathogenic H5N1 viruses, have been found in waterfowl, pet birds, wild birds, and chickens in Bangladesh9,10,11,12,13. In Bangladesh, over 580 outbreaks of HPAI H5N1 have been reported in poultry and wild birds since 200714,15,16. Because the poultry industry accounts for 20% of the livestock sector in Bangladesh, the culling of an estimated 250 million diseased animals to date in response to these outbreaks causes food insecurity and negatively impacted the economic growth17. In addition, eight human cases of H5N1 have been reported in Bangladesh, with one fatality (2020)." href="/articles/s41598-023-33814-8#ref-CR18" id="ref-link-section-d43931893e656"> 18. ヒトの H5N1 感染は、ベトナム、タイ、インドネシア、香港、中国、カンボジアで報告されており、いずれも LBM および商業農場および放し飼い農場で家禽の曝露歴があり、LBM と農場の両方が寄与する可能性があることを示唆している。家禽間および家禽から人間への AIV の蔓延に影響を及ぼします 19、20、21、22。さらに、LPAIV の同時循環も懸念の原因です。

バングラデシュでは、AIV亜型H5による家禽の発生報告例の年間平均数は減少しており、2007年から2012年には商業家禽と裏庭家禽でそれぞれ83件と10件の発生があったが、2013年から2019年には2件と0件に減少した。補償政策が段階的に廃止されるにつれ、過小報告と商業家禽における AIV サブタイプ H5 ワクチン接種が鳥インフルエンザの発生数減少の原因の 1 つである可能性があります 23。 LBM はバングラデシュの家禽貿易の根幹です。異なる種や地理的起源の鳥が毎日 LBM に導入されており、これらの鳥を一緒に飼育することで、いくつかのウイルスサブタイプの局所感染や再集合の可能性が可能になる可能性があります 20、22、24。一方、商業および裏庭養鶏はバングラデシュの養鶏産業の発展に貢献している25。水鳥は、野生であるか、裏庭、遊牧民、放し飼いなどのさまざまな環境で飼育されている場合でも、商業鳥および野鳥個体群の間でのウイルス伝播において追加の役割を果たしています 26,27。家禽におけるウイルス循環レベルを決定することを目的としたほとんどの研究は LBM で実施されており、養鶏場で実施されているのはわずか 24、28、29、30 です。このギャップに対処し、LBM と農場の両方の家禽における AIV 制御について情報を提供するには、感染パターンとリスク管理についての十分な知識が不可欠です。ここで発表された研究は、バングラデシュの代表的な7つの地区におけるH5、H9、およびH3ウイルスの循環範囲、AIVの蔓延に影響を与える要因、アヒルおよび七面鳥の農場およびLBMにおけるウイルスの系統解析を定量化したものである。

IAV M 遺伝子の有病率は 40% (95% CI 35.98 ～ 44.57) でした。私たちのサンプルでは、ハトの IAV/M 遺伝子の有病率が最も高かった (75%、95% CI 23.68 ～ 96.67)。さらに、ニワトリの 52% (95% CI 31.78-72.19) が M 遺伝子陽性であり、水鳥の 47% (95% CI 40.80-53.21) が M 遺伝子陽性でした。さらに、IAV M 遺伝子が七面鳥の綿棒の 31% で検出されました (図 1)。

バングラデシュの 7 つの地区における鳥インフルエンザ監視サイトを示す、生きた鳥の市場と養鶏場のサンプル位置。マップは ArcGIS バージョン 10.4 (http://arcgis.com/) を使用して生成されました。

図 2 は、A 型インフルエンザウイルスのサブタイプの蔓延を示しています。 IAV サブタイプ H5 の有病率が最も高かった (22%、95% CI 18.58 ～ 25.85)。 IAV サブタイプ H3 と IAV サブタイプ H9 の有病率は、それぞれ 3.4% と 6.9% でした。

AIV サブタイプ H3、H5、H9、および型指定されていない (他のサブタイプ) AIV の有病率 (95% 二項信頼区間を含む)。

IAV サブタイプ H3 は水鳥でのみ検出されました (6.88%、95% CI 4.31-10.80)。一方、IAV サブタイプ H5 はすべての種で検出されました。サブタイプ H5 の有病率はニワトリで最も高く (38.09%、95% CI 20.29 ～ 59.81)、水鳥の 25.51% (95% CI 20.45 ～ 31.32) が IAV サブタイプ H5 の陽性反応を示しました。さらに、ハトの 25% と七面鳥の 16% が IAV サブタイプ H5 を持っていることが判明しました。しかし、IAV サブタイプ H9 は水鳥では検出されませんでした。図 3 に示すように、七面鳥サンプルの 12.71% とニワトリサンプルの 4.76% のみが IAV サブタイプ H9 に対して陽性でした。

さまざまな家禽種および水鳥にわたる、AIV サブタイプ H3、H5、H9 および型分類されていない IAV の有病率 (95% 二項信頼区間を含む)。

IAV サブタイプ H5 の有病率は、農場 (10.3%、95% CI 7.30 ～ 14.28) よりも LBM (39.9%、95% CI 33.29 ～ 46.89) の方がはるかに高かった。ただし、図 4 に示すように、農場では H3 (農場: 4.97%、LBM: 1.01%) ウイルスと H9 (農場: 6.95%、LBM: 5.05%) ウイルスの両方の感染率が LBM よりも高かった。

養鶏場および LBM インターフェースにおける AIV サブタイプ H3、H5、および H9 の蔓延。

IAV M 遺伝子の有病率はタクルガオンで最も高かった。タクルガオンから収集されたすべてのサンプルは、IAV M およびサブタイプ H9 に対して陽性でした (図 5)。 IAV M 遺伝子の有病率は、ダッカとシラジガンジでそれぞれ 55% と 49% でした。 IAV サブタイプ H5 は、ダッカとシラジガンジのサンプルのそれぞれ 39% と 38% で検出されました。ダッカでは IAV サブタイプ H9 の有病率が 7% でしたが、ダッカとシラジガンジではサンプルのそれぞれ 0.99% と 1.41% が IAV サブタイプ H3 陽性でした。クシュティアにおける IAV M 遺伝子の有病率は 38%、IAV サブタイプ H3 の有病率は 17.57% でした。ただし、IAV サブタイプ H5 (4%) および H9 (1%) については、非常に低い有病率が記録されました。 IAV M 遺伝子の有病率は、メヘルプール (4%) とラジシャヒ (5%) では非常に低かった。さらに、ラジシャヒとメヘルプールのサンプルでは H5 陽性として検出されませんでした。ナオガオンのサンプルはすべて、M 遺伝子検査で陰性でした。

さまざまな地区のサンプルから特定された鳥インフルエンザ A ウイルス M 遺伝子、H5、および H9 サブタイプの有病率を示すコロプレスマップ。マップは RStudio バージョン 4.1.2 を使用して生成されました。

M 遺伝子と H5 陽性に関連する因子を決定するために、二変量解析を実施しました。二変量解析の結果を表 1 に示します。季節、寄主分類群、健康状態、およびインターフェースが考慮されました。カイ二乗検定の結果は、すべての変数が M 遺伝子およびサブタイプ H5 の有意な危険因子であることを示唆しています (有意水準 5%)。 M 遺伝子 (71.11%、95% CI 60.92 ～ 79.54) およびサブタイプ H5 (41.11%、95% CI 31.43 ～ 51.54) の有病率は夏よりも冬の方が高かった。インターフェースに基づくと、M 遺伝子の普及率は農場 (31.46%) よりも LBM (53.54%) の方が高かった。サブタイプ H5 についても同様でした。

M 遺伝子の多変数ロジスティック回帰モデリングは、季節、宿主分類群、および健康状態が M 遺伝子の有病率に大きく影響することを示唆しています。ただし、季節はサブタイプ H5 にとって重要な要素ではありませんが、寄主分類群、健康状態、界面が重要な要素です。多変量ロジスティック回帰分析の結果を表 2 に示します。冬には、M 遺伝子陽性の確率が夏よりも 4.93 倍高く、水鳥では M 遺伝子陽性の確率が 4.75 倍、夏よりも 5.71 倍でした。サブタイプ H5 陽性の確率は鶏肉の 2 倍です。

健康に関しては、死亡した鳥は健康な鳥よりも M 遺伝子陽性およびサブタイプ H5 陽性である可能性が大幅に高かった。さらに、LBM からの鳥は、農場からの鳥よりもサブタイプ H5 陽性である可能性が 3.28 倍高かった (表 2)。

6 つすべての H5N1 ウイルスの HA および NA 遺伝子の系統解析を実行しました。 H5N1 ウイルスは、2.2.2、2.3.4.2、2.3.2.1c、2.3.2.1a などの複数のクレードに進化しました。本研究で特徴付けられた6つのウイルスはすべて2019年に収集され（ダッカから2ウイルス、クシュティアから3ウイルス、シラジガンジから1ウイルス）、同一のHA配列とNA配列を共有し、バングラデシュから新たに再分類されたクレード2.3.2.1a配列とクラスター化された（図）。 .6および補足図1)。 α-2,6 シアル酸受容体結合の増加に関与することが知られている 4 つの置換が、今回の研究で単離された H5N1 株の HA 配列で同定されています: D94N、S155N、T156A、および K189R (H5 番号付け)。古典的なノイラミニダーゼ阻害剤耐性マーカーは検出されませんでした 31。

H5N1 ウイルスの HA 遺伝子の系統解析。 500 ブースストラップを備えた最尤ツリー (HKY + G モデル) (値 > 50 はブランチのみに表示)。本研究のシーケンスは赤い黒丸で強調表示されています。本研究のすべての H5 配列は同一であるため、A/turkey/Bangladesh/BDADAI-2184/2019 のみを代表株として保持しました。 H5 クレードはツリーの右側に示されています。

特徴付けられた 12 種類の H3N8 ウイルス (クシュティア由来 8 種類、ダッカ由来 2 種類、ラジシャヒ由来 1 種類、およびシラジガンジ由来 1 種類) 間の進化的関係をより深く理解するために、HA および NA セグメントの系統解析も実施されました。 12 種類の H3 ウイルスの HA セグメントはユーラシア系統に分類されました (図 7)。 10 個の H3 ウイルスは同一であり、1 つのグループにクラスター化されていました。他の 2 つのウイルスは同一であり、別のグループにクラスター化されていました。 12 種類の H3 ウイルスの HA 配列は、以前に報告されたバングラデシュの H3 ウイルスよりも、モンゴル、中国、および日本のウイルスの配列により遺伝的に類似していました。 12 個の N8 ノイラミニダーゼ遺伝子はユーラシア系統に分類されます。 N8 配列は、モンゴルおよび中国のウイルスの配列と密接に関連していました (補足図 2)。

H3N8 ウイルスの HA 遺伝子の系統解析。 500 ブースストラップを備えた最尤ツリー (HKY + G モデル) (値 > 50 はブランチのみに表示)。本研究の配列は赤い黒丸で強調表示されています。本研究の 4 つの H3 配列は同一であるため、A/アヒル/バングラデシュ/BDADAI-2204/2019 のみが A/アヒル/バングラデシュ/BDADAI-2561/2019 の代表として保持され、A/アヒル/バングラデシュ/BDADAI-3147/ 2019、および A/アヒル/バングラデシュ/BDADAI-3237/2019。 H3 遺伝子型 (参考文献 53 で定義) はツリーの右側に示されています。参照配列は青色のテキストで示されています。

高病原性株を含む AIV は人獣共通感染症を引き起こす可能性があり、多くの場合、経済的、動物的、公衆衛生上の深刻な影響を伴います 32。インフルエンザ A ウイルス (IAV) サブタイプ H5 は、その高い病原性と人獣共通感染症の可能性により、世界中で重大な懸念を引き起こしています。さらに懸念されるのは、2023 年 4 月の時点で、鳥インフルエンザ A (H3N8) ウイルスによる 3 件の人への感染が中国から報告されている 33。その結果、インフルエンザウイルスの蔓延に影響を与える変数を決定することが不可欠です。この研究では、インフルエンザ A に関連する危険因子、特に H5 サブタイプの有病率を調査しました。本研究では、以前に報告されたデータと同様に、水鳥、鶏、七面鳥、ハトからインフルエンザ A ウイルスが検出されました 34、35、36。私たちは鳥類のサンプルをスクリーニングしたところ、特定のパターンではあるものの、検査されたサンプル中に H3、H5、および H9 ウイルスの証拠が見つかりました。テストしたサンプルでは H7 サブタイプのウイルスは検出されませんでした。 IAV サブタイプ H9 は七面鳥と鶏のサンプルでのみ検出され、水鳥のサンプルでは検出されませんでした。本研究と同様に、LBM では水鳥よりも鶏の方が H9 の有病率が高いことが以前に報告されています 37,38。本研究における IAV サブタイプ H3 の有病率は、他の南アジア諸国で報告されている有病率よりも低かった 39。我々は、水鳥でのみ IAV H3 サブタイプを検出しました。これは、H3 ウイルスがアヒルで最も一般的に同定されるサブタイプの 1 つである (最大 91.76% の割合) という発見と一致しています 38,39。さらに、バングラデシュ産の以前の IAV H3 サブタイプは主にアヒルで検出されました 41,42。本研究では、IAVサブタイプH3がクシュティア、シラジガンジ、ラジシャヒ、ダッカで検出され、LBMよりも農場でより頻繁に検出されたことから、放し飼いで飼育されているアヒルとの相互作用を通じた野鳥の関与が示唆されている。

本研究では、IAV サブタイプ H5 の有病率が最も高かった。 IAV サブタイプ H5 は 2007 年以来バングラデシュで蔓延しており、鶏での発生が 500 件以上報告されています。分析の結果、試験サンプル中のすべての IAV サブタイプ H5 が 2.3.2.1a クレードに属していることが示されました。また、インフルエンザ A M 遺伝子とインフルエンザ A サブタイプ H5 の有病率は水鳥よりも鶏の方が高いことも判明しましたが、ロジスティック回帰モデルでは、水鳥では IAV M 遺伝子と IAV サブタイプ H5 のリスクが増加していることが示されました。前回のレポート43。

現在の研究の結果は、AIV感染リスクは夏よりも冬に高いことを示しており、これはバングラデシュや他の国々で同じ季節に多くの流行が発生していることと一致している35、44、45、46。これは、AIV の持続性に有利な低温と低湿度によって説明される可能性があります 47。本研究では、IAV H5 サブタイプが検出される確率は、農場よりも LBM の方が高かった。バングラデシュにおける LBM のバイオセキュリティは、最低許容基準を下回っていると広く認識されており、新たな出現株の生成を促進するウイルス進化の推進力として機能する LBM の能力は重要です 48。

インフルエンザ HA および NA の分子マーカーは、毒性の増加、哺乳類への適応、または抗ウイルス剤に対する耐性と関連しています。残念ながら、HA の W222L 変異がインフルエンザ A型 H3N849 に対するウマからイヌへの適応を可能にすることが示されたことを除いて、鳥 H3N8 ウイルスの分子マーカーに関する情報は文献にありません。ただし、多くの分子マーカー HA および NA は、H5N1 についてよく特徴付けられています。本研究では、α -2,6 SA 受容体結合の増加に役割を果たすことが以前に報告されていた 4 つの置換 D94N、S155N、T156A および K189R (H5 番号付け) が、バングラデシュのインフルエンザ A H5N1 の HA で同定されました。 NA 配列では古典的なノイラミニダーゼ阻害剤耐性マーカーは検出されませんでした。

本研究の制限の中には、配列決定のために 6 つの H5N1 ウイルスと 12 つの H3N8 ウイルスのみが選択され、HA と NA のみが配列決定されたことが挙げられます。これにより、データの正確な空間的および時間的分析を行う能力が制限されました。試験された H5 ウイルスの内部遺伝子セグメントの詳細な配列分析により、これらのウイルスが亜大陸で以前に流行していた AIV と類似しているかどうか、またはこれらのウイルスが他のサブタイプとの再集合によってさらに進化しているかどうかに関する重要なデータが追加される可能性があります。しかし、本研究で試験したインフルエンザウイルスの内部遺伝子セグメントの配列決定は、リソース不足のため不可能でした。

本研究の結果は、死んだ鳥の処理、病気の鳥の扱い、AIV の感染率や蔓延に影響を与えるその他の要因などのバイオセキュリティの実践にも拡張できる可能性があります。

結論として、本研究の結果は、バングラデシュの LBM と農場の両方で AIV の複数のサブタイプ (H5、H3、および H9) が循環していることを強調しています。私たちは、選択した調査地域における AIV 流行に影響を与える危険因子として、季節、宿主の種類、鳥の健康状態を特定しました。農家と養鶏場の労働者は、AIVの人獣共通感染症の感染を防ぐために定期的に訓練を受けることが強く推奨されています。本研究は、鳥インフルエンザウイルスがバングラデシュのLBMの家禽集団内で循環していることを示しており、鳥インフルエンザの遺伝子プールを決定し、人獣共通感染症の可能性のある新たなウイルスの出現の可能性を監視し、追跡するためのより広範なゲノム監視研究の必要性を強調している。彼らの発信。定期的かつ計画的な監視は、AI の発生の可能性を防ぐための早期発見と迅速な対応に役立ちます。多くの発展途上国では、バングラデシュと同様の LBM や農場で家禽の飼育が行われています。結果として、私たちのデータと調査結果に基づくこのような推奨事項は、世界的な重要性と影響を及ぼします。

私たちは、LBM と農場のインターフェースで横断的な研究を実施しました。 LBM の例では、LBM の数が多く、集中していること、および AIV 遺伝子プールが存在するため、バングラデシュの首都であり最大の都市であるダッカの LBM のみがサンプリングされました。一方、農場では、ダッカに生息する生きている鳥の大部分が国の北東部に生息しています。この事実を踏まえ、私たちは国の北東部の 7 つの主要地区の農場からアヒルと七面鳥のサンプルを収集しました。図に示すように、2018年9月から2019年11月にかけて、ニワトリ（Gallus gallusdomesticus）、アヒル（Anas platyrhynchosdomestica）、ハト（Columba liviadomestica）、および七面鳥（Meleagris gallopavo）の鳥から総排泄腔および中咽頭スワブサンプルが収集されました。 1、前述したように、1 mL のウイルス輸送培地 (VTM) を含む 1.8 mL の滅菌クリオバイアルに入れられた滅菌スワブを使用します 49。

プールされた総排泄腔および中咽頭サンプル (n = 500) は、ウイルスの分離と特性評価のために、セントジュード小児研究病院 (米国テネシー州メンフィス) の感染症科ウイルス部門に送られました。 RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) を使用してウイルス RNA を抽出し、SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA) を使用して cDNA を合成しました。前述のように、ユニバーサル M 遺伝子と H5、H3、H7、および H9 HA 特異的プライマーを使用したリアルタイム逆転写 PCR (rRT-PCR) を使用して、すべての綿棒サンプルをテストしました 51,52。 Ct (サイクル閾値) が 35 未満であり、特徴的な増幅曲線を示している場合、テストした遺伝子は陽性であると考えられます。

インフルエンザ A ウイルス M 遺伝子陽性サンプルは、以前に記載されているように発育鶏卵 (ECE) に接種することによりウイルス分離のために培養されました 32。各スワブサンプルからの体積100μlを、サンプル当たり3つの10日齢ECEの尿膜腔液(AF)に注入し、35℃でインキュベートした。 72 時間後、AF を収集し、0.5% 七面鳥赤血球を使用して血球凝集を検査しました。 ECE (E1) の最初の継代すべての AF サンプルを Flu Detect® (Zoetis Inc.) を使用して検査し、AF サンプルから RNA を抽出し、M 遺伝子 rRT-PCR によって AIV について再検査しました。 AIV 陽性 RNA は配列決定のために提出されました。

インフルエンザ A ウイルス陽性サンプルは、Illumina Techniques (イルミナ、カリフォルニア州、米国) を使用して配列決定するために、セントジュード小児研究病院のハートウェル配列決定センター施設に提出されました。 M 遺伝子陽性、H5/H9 陰性サンプルは、DNA シークエンシングを使用した分子的手法を使用してサブタイプ分けされました。以前に公開されたプロトコールに従って遺伝子特異的プライマーを使用してマルチセグメント RT-PCR を実行し、インフルエンザウイルスゲノム全体を増幅しました 53。次に、PCR 産物をゲル抽出し、GE Healthcare illustra™ GFX PCR DNA およびゲルバンド精製キット (Sigma Aldrich、ミズーリ州、米国) を使用して精製しました。サンプルのライブラリー調製は、製造業者のプロトコールに従って、Illumina の Nextera XT DNA サンプル調製キット (Illumina、CA、USA) を使用して実行されました。アンプリコンは、ペアエンドアプローチを使用してイルミナの MiSeq プラットフォームで配列決定されました。シーケンシングリードは、セントジュード小児研究病院のハートウェルゲノミクスセンターによって開発されたパラスパイプラインを使用してコンセンサスシーケンスを生成する前に、逆多重化、品質トリミング、およびフィルタリングされました。最終解析とコンセンサス配列の生成は、CLC Genomics Workbench (v.11.0.1) を使用して完了しました。

MUSCLE アルゴリズムによる多重配列アライメントと系統発生および進化解析は、IQ-Tree54 および MEGA1155 を使用して実施されました。簡単に言うと、6 つの H5N1 ウイルスと 12 の H3N8 ウイルスの全長 HA および NA 遺伝子セグメントの系統樹を、田村-Nei モデルと 1000 回のブートストラップ反復による最尤法を使用して生成しました。バングラデシュ産の AIV サブタイプ H5N1 の遺伝子セグメントのすべての HA および NA 配列は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ および Global Initiative on Sharing All Influenza Data の EpiFlu データベース https:/ で入手できます。 /gisaid.org/ が検索され、各遺伝子セグメントおよびサブタイプの最初の 50 個の blast ヒットとともに参照として使用され、H3 および N8 ツリーについては前述の既知の遺伝子型からの参照配列とともに使用されました 56。系統解析には、バングラデシュの H5N1 ウイルスに加えて、BLAST 検索で示されたように、遺伝的類似性が最も近い他の国の H5N1 ウイルスも含まれていました。 BLAST検索によると、系統解析にはバングラデシュおよびその他の国からの12種類のH3N8ウイルスが含まれており、これらはHAについてはH3ウイルス、NAについてはN8ウイルスに最も近縁であった。 HA および NA 遺伝子ツリーには、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ および https://gisaid.org/ データベースからの代表的なユーラシアおよび北アメリカの H3 サブタイプウイルスの配列が含まれていました。

Microsoft Excel 2016 で現場データと実験室データの両方を記録しました。データセットは、データ分析のために R (バージョン 4.1.1、RStudio) にエクスポートする前に、Microsoft Excel でクリーンアップ、コード化、記録、整合性チェックが行われました。

rRT-PCRおよびシーケンス結果に基づいて、記述的分析を実行して、M遺伝子、H3、H5、およびH9の有病率を計算しました。 M 遺伝子、H3、H5、および H9 の有病率も、各宿主分類群ごとに計算されました。有病率を視覚化するために、エラーバーと信頼区間を含むグラフが使用されました。ソフトウェア R バージョン 4.1.2 および R Studio プログラム (バージョン 4.1106、Integrated Development for R. RStudio、PBC、マサチューセッツ州、米国) および GraphPad Prism (バージョン 8.0.2) (GraphPad Software, Inc.、カリフォルニア州、米国) を使用しました。。 R (バージョン 4.1.1、RStudio) を使用して、地区ごとの IAV H5、H9、および H3 サブタイプの有病率を示すコロプレスマップを作成しました。

研究地域における IAV M 遺伝子および H5 に関連するさまざまな因子について二変量解析を実施しました。季節は時間的パターン（冬と夏）に分類されました。宿主分類群は、ハト、七面鳥、鶏、水鳥に分類されました。健康状態は、健康な鳥と死亡した鳥に基づいて分類されました。インターフェイスは LBM とファームに分割されました。 R を使用して「カイ二乗検定」を実行し、因子と IAV M 遺伝子および H5 の有病率との関連を特定しました。 p 値 < 0.05 の変数は、さらなる統計モデリングのために考慮されました。統計モデリングでは、二変量解析で有意な変数を利用しました。 IAV M 遺伝子および IAV サブタイプ H5 に関する結果変数は 2 値であるため、各結果について多変数ロジスティック回帰を考慮しました。

すべての手順と方法は、関連するガイドラインと規制に従って実行され、ARRIVE ガイドラインに従って報告されました。すべての手順は、バングラデシュのチャットグラム獣医動物科学大学の倫理委員会によって、参照番号 CVASU/Dir (R&E) EC/2019/126/(1) で承認されました。

本研究で生成された配列データは、GenBank、国立医学図書館、NCBI にアクセッション番号 OK081811、OK081812、OK087622、OK087623、OK087625、OK087624、OK087633、OK087634、OK087635、OK087636、OL375219、OL375 で寄託されました。 220、OL375221、OL375222、OL375223 、OL375224、OL375226、OL375227、OL375234、OL375236、OL375237、OL375238、OL376360、OL376361、OL376362、OL376424、OL376425、ON755037、ON755 038、ON755058、ON755123、ON755190、および ON755191。さらに、配列は、受託番号 EPI1887774、EPI1887775、EPI1888008、EPI1888009、EPI1888010、EPI1888011、EPI1888012、EPI1888013、EPI1888 で Global Initiative on Sharing All Influenza Data https://www.gisaid.org/ に寄託されました。 014、EPI1888015、EPI1888336、 EPI1888337、EPI1888338、EPI1888339、EPI1888340、EPI1888341、EPI1888342、EPI1888343、EPI1889089、EPI1889090、EPI1889091、EPI1889092、EPI1889093、EPI 1889094、EPI1889095、EPI1889096、EPI1889097、EPI1889098、EPI1889099、EPI1889100、EPI1889101、EPI1889102、EPI1889103、EPI1889104、EPI1889105、およびEPI18 89106 。

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私たちは、チャットグラム獣医動物科学大学、バングラデシュ疫学・疾病管理研究研究所（IEDCR）、米国ニューヨークのエコヘルス・アライアンス、およびオーストラリアのディーキン大学統合生態学センターの支援に感謝します。研究。著者らは、原稿を読んで管理上の援助を提供してくださった、米国テネシー州セントジュード小児研究病院感染症科ウイルス科の James P. Knowles に感謝の意を表します。著者らは、セントジュードインフルエンザ研究監視センター（CEIRS）プログラム（現在はセントジュードインフルエンザ研究監視センター（SJCEIRR））のリサ・カーチャー氏の支援に感謝している。著者らは、原稿を大幅に改善するための有益なコメントと提案をくれた 2 人の匿名の査読者に感謝します。

このプロジェクトは、チャットグラム獣医動物科学大学 (CVASU) (助成金番号 UGC/CVASU#06) を通じたバングラデシュ大学助成金委員会 (UGC) からの資金と、米国 NIH/NIAID Centers of Excellence からの資金によって一部支援されました。インフルエンザの研究と監視（契約番号 HHSN272201400008C）、および米国セント・ジュード小児研究病院のアメリカ・レバノン・シリア協会慈善団体（ALSAC）からの資金によって行われています。 MEZ は、米国テネシー州メンフィスのセントジュード小児研究病院、セントジュード CEIRS への NIH/NIAID/CEIRS (契約番号 HHSN272201400008C) 旅行および研究プログラムの受賞者です。

ディーキン大学生命環境科学部統合生態学センター、ジーロング、ビクトリア州、3216、オーストラリア

アリフル・イスラム

EcoHealth Alliance、ニューヨーク市、ニューヨーク、10018、米国

アリフル・イスラム＆シャリフル・イスラム

疫学・疾病管理・研究研究所、ダッカ、1212、バングラデシュ

シャリフル・イスラム、メルジャディ・S・フローラ、エママ・アミン

米国テネシー州メンフィス、セントジュード小児研究病院、感染症科ウイルス科

カーリー・ウッダード、アシュリー・ウェッブ、ロバート・G・ウェブスター、リチャード・J・ウェビー、モハメド・E・エル・ゾワラティ

宿主-病原体相互作用、国立農業・食品・環境研究所、トゥールーズ国立獣医学部、トゥールーズ大学、トゥールーズ、フランス

マリエット・F・ドゥカテス

Queensland Alliance for One Health Sciences、クイーンズランド大学獣医学部、セントルシア、クイーンズランド、4343、オーストラリア

モハマド・M・ハッサン

チャットグラム獣医動物科学大学獣医学部、チャットグラム、4225、バングラデシュ

モハマド・M・ハッサン

獣医学および食品安全保障研究グループ、医療検査科学プログラム、健康科学部、アブダビ女子キャンパス、高等工科大学、41012、アブダビ、アラブ首長国連邦

モハメド・E・エル・ゾワラティ

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AI、SI、MSF、EA、KW、AW が実験を実施し、AI、MFD、MMH、RGW、RJW、MEZ が主稿テキストを執筆し、解析を実施し、MFD、AI、MEZ が図を作成しました。 MFD、AI、RGW、RJW、MEZ が原稿を改訂しました。 RJW、MMH、MEZ が研究を監督しました。 MEZ、MFD、RJW は重要な改訂を実施しました。著者全員が原稿をレビューしました。

モハメド・M・ハッサンまたはモハメド・E・エル・ゾワラティへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

イスラム A.、イスラム S.、フローラ MS 他バングラデシュの養鶏場と生きた鳥の市場における鳥インフルエンザ A ウイルス H5N1 および H3N8 サブタイプの疫学と分子的特徴付け。 Sci Rep 13、7912 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-33814-8

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受信日: 2022 年 10 月 29 日

受理日: 2023 年 4 月 19 日

公開日: 2023 年 5 月 16 日

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