マウスの後肢除荷と放射線曝露を組み合わせた後の骨格筋における骨髄細胞浸潤

npj 微小重力 9 巻、記事番号: 40 (2023) この記事を引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

骨格筋と免疫系は宇宙環境から大きな影響を受けます。これらの器官間のクロストークは確立されていますが、完全には理解されていません。この研究は、急性照射セッション (HLUR) と組み合わせた (後肢) 除荷後のマウス骨格筋における免疫細胞の変化の性質を決定しました。我々の発見は、14日間のHLURが骨格筋における骨髄性免疫細胞浸潤の有意な増加を誘導することを示しています。

宇宙飛行は生物に複数の課題をもたらし、主に微小重力や電離放射線といった環境ストレス要因に適応しようと努めなければなりません。地球低軌道（国際宇宙ステーションなど）でのミッション中の放射線は宇宙飛行士の健康に影響を及ぼします2。また、深宇宙でのミッションでは、放射線の性質と線量のため、これらの影響はさらに大きくなり、より危険になります3,4。宇宙旅行中に最も影響を受ける臓器の 2 つは、骨格筋と免疫系です 5,6。一例として、後肢の除荷によって微小重力と放射線にさらされたマウスの骨格筋（HLU、検証済みの宇宙飛行動物類似体7）は、筋肉量の急速な減少を示し、筋肉の成長と代謝の重要な分子調節因子の調節不全を示します8。興味深いことに、骨格筋の成長、代謝、炎症の間に強い関連があるという証拠が増えています9,10。つまり、宇宙ストレス要因による免疫系の変化が筋肉内の分子基盤を変化させ、微小重力や放射線によるこの臓器への悪影響を悪化させる可能性があるということになります。しかし、宇宙のような条件下での骨格筋と免疫系の間のクロストークを説明するメカニズムは、理解には程遠いです。通常の重力および電離放射線条件下での筋肉の再生プロセス中、このようなクロストークは、筋肉への骨髄性免疫細胞およびリンパ性免疫細胞の浸潤によって媒介されると考えられます11、12、13。しかし、宇宙環境が骨格筋に存在する骨髄系および/またはリンパ系の免疫細胞集団に何らかの反応を引き起こすかどうかは不明です。

免疫系と骨格筋のクロストークと完全性に対する宇宙飛行の影響に関する情報が不足していることを考慮して、一定期間の荷降ろしと放射線（HLUR）曝露後に骨格筋内で起こる潜在的な免疫細胞の変化を調査する研究を計画しました。マウスで。私たちは、遺伝子発現の観点から骨格筋における免疫細胞の変化の性質を解明し、免疫組織化学的アプローチを使用して発見を確認することに重点を置きました。上記のことから、我々は、HLUR が骨格筋における骨髄細胞およびリンパ細胞の浸潤を誘導すると仮説を立てました。

14 日間の後肢の除荷と急性放射線照射 (7 日目) の後、湿性ヒラメ筋の総重量の有意な減少が見られましたが、腓腹筋の重量は減少しませんでした。 (図1a、b)。 M.ヒラメ筋の体重の減少は、筋肉量のよく知られた阻害剤9であるミオスタチンの遺伝子発現の増加と同時に起こりましたが、これはM.腓腹筋には見られませんでした（図1c、d）。ミオスタチンは、萎縮関連遺伝子を上方制御し、Akt/mTOR シグナル伝達経路を阻害することによって筋萎縮を誘導します9。 Akt/mTOR シグナル伝達経路は、アンロードおよび放射線照射後に調節不全になることが最近判明しました 8。さらに、TNF-α9 などの抑制性サイトカインのレベルが増加すると、同じ経路が下方制御されることが示唆されており、萎縮刺激条件下での潜在的な免疫-骨格筋クロストークが示されています。

M. ヒラメ筋の a、b の体重および MSTN レベル。 c、d 腓腹筋の体重および MSTN レベル。 HLUR 後肢除荷および放射線照射グループ、CTRL 対照グループ。 *CTRL グループとは有意に異なります (対応のない t 検定; p < 0.05)。エラーバーは標準偏差を表します。

HLUR 後のこのクロストークの背後にあるメカニズムを理解するために、既知の免疫マーカーの遺伝子発現解析が M. ヒラメ筋で行われました。 HLUR は骨髄系マーカー CD11b の発現を増加させ (p = 0.05)、炎症誘発性サイトカイン TNF-α の増加傾向が観察されました (p = 0.07)。一方、CD4 などのリンパ系マーカーでは HLUR と CTRL の間に差は見つかりませんでした。 CD8、CD20。さらに、INF-γまたはIL-6レベルの違いは見つかりませんでした（図2a）。これらの炎症マーカーの増加を引き起こす骨髄性免疫細胞の種類をより深く理解するために、骨格筋組織に存在する免疫細胞の追加マーカーを分析しました。 ICAM-1、H2-Ab、CD11c、CD86、およびMMP-12の発現の有意な増加（p < 0.05）が見つかり、HLUR後の骨髄細胞浸潤の誘導ではなく、リンパ系細胞浸潤の誘導は支持されませんでした（図2b、c）。これらの炎症マーカーの遺伝子発現の増加は、進行中の萎縮および/または放射線誘発性の免疫反応に対する代償機構を反映している可能性があります。実際、過去の研究では、マクロファージ枯渇マウスにおける骨格筋損傷後の治癒過程の障害が示されています14。

a-c M. ヒラメ筋における炎症性、骨髄性免疫細胞、およびリンパ性免疫細胞マーカーの遺伝子発現。 d 腓腹筋における炎症性、骨髄性免疫細胞、およびリンパ性免疫細胞マーカーの遺伝子発現（X軸はlog^-2スケール）。 e.腓腹筋におけるCD11b陽性細胞の数。 f CD11b 陽性細胞の検出に使用される断面の例。 HLUR 後肢除荷および放射線照射グループ、CTRL 対照グループ。 *CTRL グループとは有意に異なります (対応のない t 検定; p < 0.05)。エラーバーは標準偏差を表します。

次のステップとして、HLUR 後の炎症マーカーの増加が腓腹筋でも起こったかどうかを評価しました。 CD11c (p = 0.02) および CD11b (p = 0.048) の有意な増加、TNF-α 発現の増加傾向 (p = 0.06) が見られましたが、H2-Ab および CD86 は変化しませんでした (図 2d)。したがって、M.ヒラメ筋で見出された結果と同様に、HLURはM.腓腹筋における骨髄細胞の誘導を誘発すると思われる。これらの所見、特に腓腹筋における所見は、炎症の増加が筋萎縮に先行することを示唆している。この仮説は、負荷のないラットにおける筋萎縮前の炎症反応の増加に関連する KEGG 経路および遺伝子オントロジー用語の充実を示した以前の研究と一致しています 15。

HLUR後の炎症マーカーの遺伝子発現の増加を検証するために、CD11bの免疫組織化学的染色を実施しました。 CD11b の遺伝子発現の増加と一致して、CTRL と比較して HLUR の骨格筋では面積当たりの CD11b 陽性細胞の数が有意に多く見つかりました（P = 0.043;図 2e、f）。この結果は、放射線照射と除荷を組み合わせた後に骨格筋に骨髄細胞の浸潤が存在することを裏付けており、これは筋萎縮を軽減しようとする修復機構に関連している可能性があります 16。ただし、宇宙飛行条件後の免疫-骨格筋クロストークに関与する特定の免疫細胞集団の特異性を判断するには、追加の研究が必要です。さらに、現在の結果を実際の宇宙条件に推定するには、ここで使用される X 線よりも宇宙線や太陽粒子事象に類似した放射線プロトコルの使用を考慮する必要があります。

要約すると、我々の調査結果は、14 日間の除荷と放射線照射により、骨格筋の炎症マーカーと免疫細胞マーカーの有意な増加が誘導されることを示しています。これは、骨格筋萎縮を遅らせる代償機構として起こる可能性があります。重要なことは、除荷と放射線プロトコルを組み合わせた場合、骨格筋組織への骨髄系免疫細胞の浸潤が誘発されたが、リンパ系免疫細胞の浸潤は誘発されなかったことである。これらの発見は、宇宙飛行状態における骨格筋と免疫系の間のクロストークを浮き彫りにしています。免疫-骨格筋クロストークに関与する免疫細胞の動態と特異性についての理解を深めるには、今後の研究が必要です。単一細胞技術とオミクスアプローチを組み合わせた研究は、宇宙飛行中の筋肉と免疫のクロストークに関する知識を前進させるための特に興味深い戦略であると思われます。

10匹のマウスに、尾吊りによる14日間の後肢除荷(HLU)を行い、除荷7日目に急性放射線セッション(線量=25mGy、X線)を行った(HLUR群)。 10匹のマウスを対照として使用した(同様のケージ、偽放射線)。マウスを屠殺し、Mm. ヒラメ筋と腓腹筋が得られました。筋肉サンプルは、炎症および特定の免疫細胞の遺伝子マーカーを分析するために使用されました。最後に、筋肉サンプルを免疫組織化学分析して、遺伝子発現レベルで見つかった所見を確認しました。この方法は、国際 (欧州連合) および国内 (ベルギー) のガイドラインおよび規制に従って実施され、Medanex Clinic (EC MxCl 2018–100) によって承認されました。

20 匹の成体 (14 週間) 雄 C57/BL6J マウスを、対照群 (CTRL; n = 10) と除荷および放射線照射群 (HLUR; n = 10) に無作為に割り付けました。マウスは単独で飼育され、12:12 時間の明暗サイクルで維持されました。マウスは食餌ペアリングされ、すなわち、ペアリングされたHLURマウスが前日に食べたものをCTRLマウスが食べた。

無負荷（つまり、後肢への微小重力）は、尾部サスペンション技術によって達成されました。簡単に言うと、鎮静下で、尾をケージの長さに沿った 3 点でケージの吊り下げ装置に取り付けました。マウスを装置内に吊り下げた後は、後肢がケージの床上の金属グリッドに触れないようにした。動物と床の間の吊り下げ角度は平均 30°でした。荷降ろし介入は 14 日間継続された。この期間後（またはＣＴＲＬ動物については同様のケージおよび条件で１４日間）マウスを屠殺し、Ｍｍ．両後肢のヒラメ筋と腓腹筋を解剖し、重量を量り、液体窒素で予冷したイソペンタン中で凍結し、さらなる分析まで-80℃で保存しました。

合計 25 mGy の X 線量が照射されました (HLUR マウス)。この線量は、宇宙飛行士が 2 週間の深宇宙ミッション中に遭遇する実効線量の総量に匹敵します 17。照射中、特定の病原体が存在しない状態を維持するために、マウスは通気性のあるオートクレーブバッグに包まれたそれぞれのケージ内に保管された。 CTRL マウスは偽放射線照射、つまり袋詰めされ、ケージに入れて車で放射線施設に移送され、その後動物施設に戻され、HLUR と同じ温度条件と潜在的な輸送誘発ストレスを経験しました。

すべてのマウスの後肢からの M. ヒラメ筋の 1 つと腓腹筋の 1 つ約 20 mg を TRIzol でホモジナイズし、全 RNA を抽出して cDNA に逆転写しました。遺伝子発現 (mRNA) は、定量的リアルタイム PCR 手順を使用して決定されました。免疫/炎症プロセスのマーカーに対する遺伝子特異的プライマーが使用されました。テストした転写パネルは次のとおりです: CD4、CD8、CD20、IFN-γ、CD11b、CD11c、MHCII、TNF-α、IL-6、CD206、iNOS、Arginase、CD86、CD80、PTGS、iCam、および HPRT (コントロール) /参照遺伝子)。

すべてのマウスからの M. 腓腹筋の 1 つを横断面切片に向けて配向し、-22 °C のクライオスタット内で 5 μm の断面を切り出し、スライドガラスに貼り付けました。 Cd11b に対するモノクローナル抗体 (BioLegend、ラット IgG2b、クローン M1/70) を使用して切片を染色し、骨髄細胞浸潤を分析しました。次に、倍率 20 倍の明視野顕微鏡 (Leica DMLA、Leica application suite X ソフトウェア) を使用して、染色された断面を捕捉しました。各断面で、1 枚の写真あたり 1.96 mm2 の固定領域を表す 3 ～ 4 枚の写真が撮影されました (サンプルあたりの平均断面積は 3.5)。 Cd11b 特異的染色の検出に使用される半自動パイプラインは、Mac OS X 用の ImageJ ソフトウェアを使用して使用されました。その後、陽性細胞の数をすべての断面にわたって平均しました。

対応のない t 検定を使用して、HLUR グループと CTRL グループの間で筋肉重量、遺伝子発現、および細胞浸潤を比較しました。有意水準は 5% に設定されました (p < 0.05)。すべての統計分析は、Mac OS X 用の Prism 9 (GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実行されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この記事の結論を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて著者によって提供されます。

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この原稿で説明されている実験は、ESA/BELSPO/Prodex、IMPULSE契約CO-90-11-2801-04、および欧州低重力研究協会から研究賞2020-2021の形で部分的に資金提供されました。 RFG は、スウェーデン国立宇宙庁からのキャリア助成金 (2021-00159) によってサポートされています。

カロリンスカ研究所が提供するオープンアクセス資金。

スウェーデン、ストックホルムのカロリンスカ研究所生理学および薬理学部門

エリック・B・エマヌエルソン & カール・ヨハン・サンドバーグ

放射線生物学ユニット、SCK CEN、ベルギー核研究センター、モル、ベルギー

ビョルン・バセレット、ミーケ・ニーフス、サラ・バートゥ、ブリット・プロエスマンス、リサ・デーネン

カロリンスカ研究所、学習、情報学、管理および倫理学部、ストックホルム、スウェーデン

カール・ヨハン・サンドバーグ

カロリンスカ研究所、臨床生理学部門、検査医学部門、ストックホルム、スウェーデン

ヘレン・ランドクヴィスト & ロドリゴ・フェルナンデス・ゴンサロ

カロリンスカ大学病院、臨床生理学部門、ストックホルム、スウェーデン

ヘレン・ランドクヴィスト & ロドリゴ・フェルナンデス・ゴンサロ

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Emanuelsson、EB、Baselet、B.、Neefs、M. 他。マウスの後肢除荷と放射線曝露を組み合わせた後の骨格筋における骨髄細胞浸潤。 npj 微小重力 9、40 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41526-023-00289-w

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受信日: 2022 年 9 月 8 日

受理日: 2023 年 5 月 25 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41526-023-00289-w

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