イジョン

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 32 (2023) この記事を引用

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

現在、現代のシステム生物学において、人間の健康の重要な側面である体温調節の観点から、漢方薬（HM）と腸内微生物叢との間の潜在的な関係を探索することにかなりの注目が集まっています。しかし、体温調節における HM のメカニズムに関する我々の知識は不十分です。今回我々は、標準的なハーブ処方である易中湯（YJT）が、PTU誘発性甲状腺機能低下ラットの低体温、過剰炎症、腸内細菌叢の異常を防ぐことを実証する。注目すべきことに、これらの特性は、腸内微生物叢の変化と、小腸と褐色脂肪組織（BAT）の体温調節メディエーターと炎症メディエーターの間のシグナル伝達クロストークと関連していました。甲状腺機能低下症を治療するための従来の薬剤L-チロキシンとは対照的に、YJTは、腸のTLR4およびNod2/Pglyrp1シグナル伝達経路の抑制に関連する系統的な炎症反応を軽減する効果があります。我々の研究結果は、YJTがPTU誘発性甲状腺機能低下ラットにおいてBAT熱産生を促進し、全身性炎症を予防する可能性があることを示唆しており、これは腸内分泌機能と自然免疫系に関連する腸内細菌叢および遺伝子発現の調節に対するYJTのプレバイオティクス効果と関連している。これらの発見は、ホロビオント中心の医療を可能にするパラダイムシフトに対する微生物叢 - 腸 - BAT 軸の理論的根拠を強化する可能性があります。

体温調節は、臓器のプロセスが効果的に機能することを可能にする恒常性の維持における重要な機能であり、甲状腺ホルモンとの密接な関係については十分に証明されています 1,2。近年の代謝性疾患の増加に伴い、甲状腺機能不全、特に甲状腺機能低下症は最も一般的な内分泌疾患であり、世界中の人口の約 4 ～ 10% が罹患している主要な医療問題となっています 3,4。甲状腺機能低下症の従来の治療では、薬物有害事象、高額な治療費、コンプライアンスの問題が発生するため、科学者は慢性生理学的障害を治療するための代替となる可能性のある戦略を特定するよう求められています。これに関連して、伝統的な中国医学や韓国医学などの漢方薬（HM）は、さまざまな独自の理論と重要な臨床経験に基づいて、甲状腺機能低下症の治療における可能性について広く研究されてきました5、6、7。

甲状腺機能低下症ではエネルギー代謝の低下が見られるため、エネルギー代謝の増加に潜在的な影響を与える温熱特性を持つ薬剤が治療に使用されてきました5。李中湯としても知られる易中湯 (YJT) は、1800 年前に張中京の『発熱性およびその他の病気に関する論文』に初めて記載された、温熱特性を持つ標準的な漢方薬です。甲状腺機能低下症の症状を緩和するためによく使用され、抗酸化作用と免疫調節作用を示します8。ＹＪＴは以下のハーブを含む：ショウガ科ローズ（科：ショウガ科）根茎（９ｇ）、Atractylodes Macrocephala Koidz（科：キク科）根茎（９g）、Codonopsis pilosula（フランス）Nannf。（科：キキョウ科）の根（９ｇ）、およびＧｌｙｃｙｒｒｈｉｚａｕｒａｌｅｎｓｉｓＦｉｓｃｈ．元DC。（科：マメ科）根茎（９ｇ）８．しかし、その温感の薬理やメカニズムはまだ研究されていません。

哺乳類の生理機能における重要な要素であるマイクロバイオームは、健康の不可欠な部分を構成する新しい研究分野として浮上しています。ヒトの腸内マイクロバイオームに関するさまざまな国際プロジェクトの立ち上げによる最近の技術の進歩により、人間の健康に関連する慢性疾患と腸内マイクロバイオームの間の広範な研究とホットスポット研究が可能になりました9,10。これまでの研究では、腸内細菌叢と甲状腺の病態生理学との関連性が特定され、腸内細菌の組成の変化やヨードチロニンデイヨージナーゼ (Dios) への影響など、さまざまな方法による甲状腺ホルモン濃度の変化が実証されています 11,12。さらに、甲状腺 - 腸軸は、甲状腺ホルモンのリサイクルによって代謝全体に影響を与えると提案されています13。一方、腸内細菌叢は時間の経過とともに構造的に動的であり、さまざまな条件下で可塑的であるため、HM の特徴の 1 つは経口投与できるため、HM は必然的に腸内細菌叢と相互作用し、腸内細菌の恒常性をサポートします。腸内微生物叢。したがって、チャネルとしての腸内微生物叢は、宿主に対して HM の薬理学的効果を発揮する可能性があります 14,15。 YJT には、腸内で有益な細菌の成長と活動を選択的に刺激できるプレバイオティック多糖類が含まれており、これらの細菌の栄養源として短鎖脂肪酸 (SCFA) の生成を促進して腸の健康と全体的な健康をサポートします 16,17。この証拠により、YJZ は腸内微生物叢と複数のシグナル伝達経路の再プログラミングを通じて熱産生と炎症を調節し、甲状腺機能低下症の症状を軽減する可能性があるという仮説が導き出されました。

甲状腺機能低下症モデルを確立し、16 S rRNA 遺伝子配列決定を行うことで、YJT が体温 (Tb) を上昇させ、全身性炎症を軽減し、甲状腺機能低下症に関連する腸内細菌叢の異常を逆転させることを実証することを目的としました。甲状腺機能低下症の症状は、抗生物質治療を受けた野生型ラットにおいて、甲状腺機能低下個体からの盲腸微生物叢移入（CMT）によって誘発される可能性があるが、これらの症状は、YJT治療を受けた甲状腺機能低下症からのCMTによるレシピエントには見られない。さらに、YJT が褐色脂肪組織 (BAT) の熱産生を刺激し、腸内細菌叢および関連する複数のシグナル伝達経路の再プログラミングを通じて全身性炎症を予防することを実証しました。

YJTが結核を改善し、全身性炎症を予防できるかどうかを、プロピルチオウラシル（PTU）誘発甲状腺機能低下症ラットモデルで、L-チロキシン（T4）を参照薬物として用いてテストしました（図1a）。 PTU治療は体重の増加を減少させ（図1b）、以前と比較して食物摂取量の50％の減少（図1c）、平均Tbの> 1℃の低下（図1d、補足図1a）を誘発しました。制御。 YJT と T4 は両方とも、投与後約 9 日以降、PTU による体重、食物摂取、および Tb の減少を阻害しました（図 1b-d）。さらに、YJT 治療はこれらの代謝パラメーターの回復をもたらしましたが、長期にわたる T4 治療は過食症と高体温を誘発しました。 YJTとT4は両方とも、PTUによって破壊された耐糖能を回復しました（図1e）。予測どおり、PTU誘発性甲状腺機能低下症のラットでは、対照と比較して、血清甲状腺刺激ホルモン（TSH）レベルの有意な増加と、T4およびトリヨードチロニン（T3）レベルの減少が検出されました（図1f-h）。 YJTは、血清T4およびT3レベルを対照レベルに逆転させました（図1f–h）。 PTUは血清グレリンレベルには影響を与えませんでしたが（食欲不振ホルモン、図1i）、グルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）（食欲不振ホルモン、図1j）の分泌を増加させ、その結果、食物摂取量が減少しました。 PTU処理したラット。 YJTとT4の両方の治療はグレリン分泌を刺激し、T4ではなくYJTがPTUによる血清GLP-1レベルの増加を防止しました（図1i、j）。腫瘍壊死因子α（TNF-α）やリポ多糖類（LPS）などの循環炎症マーカーは、PTU治療群とT4 + PTU治療群の両方で増強されましたが、YJTはPTU誘発性の全身性炎症を予防しました（図1k、図1k、 l）。さらに、回腸の組織学では、甲状腺機能低下症が腸の障壁と吸収を乱し、絨毛の長さと陰窩の深さの減少によって示されることが示されましたが、YJTとT4の両方の治療はこれらの変数を逆転させました（図1m）。 T4 治療により、小腸の長さと肝臓、心臓、脾臓を含む一部の臓器の質量が大幅に増加しました (補足図 1b、c)。

実験計画の概略図。 b 体重。 c 食物摂取。 d 実験中の平均深部体温 (Tb) (グループあたり n = 5)。 e グルコース代謝は、経口ブドウ糖負荷試験によって評価されました。 f ～ h 甲状腺刺激ホルモン (TSH)、チロキシン (T4)、およびトリヨードチロニン (T3) のレベル。 i–l 血清グレリン、グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)、腫瘍壊死因子-α (TNF-α)、およびリポ多糖類 (LPS)。 m 4 つの実験グループに対するヘマトキシリンとエオシンによる回腸の組織学アッセイ。データは平均値 ± SEM (グループあたり n = 7 ～ 8) として表示されます。一元配置 ANOVA または ANCOVA (食物摂取量) とそれに続く事後 LSD テスト。 *P < 0.05、対照に対して、#P < 0.05、PTU に対して。列の上の異なる文字は、大きな違いを示します。 Con、生理食塩水のみを投与した対照群。 PTU、10 mg/kg/body プロピルチオウラシル (PTU) を投与されたラット。 YJT + PTU、2.1 g/kg YJT および 10 mg/kg/body PTU を投与されたラット。 T4 + PTU、0.5 mg/kg L-チロキシンおよび 10 mg/kg PTU で治療されたラット。

YJT によって調節される腸関門、腸シグナル伝達、炎症性サイトカインの維持に関連する遺伝子をさらに検出するために、いくつかの重要なマーカーの mRNA 発現をリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-qPCR) によって定量しました。小腸の回腸。回腸の組織学と一致して、クローディン-2および閉塞小帯-1（ZO-1、上皮密着結合分子）の発現は、対照と比較してPTU処置ラットで減少または著しく減少する傾向があった。さらに、これらの変化はYJTおよびT4処理によって部分的または完全に回復しました（図2a）。 YJTとは対照的に、T4処理は増殖細胞核抗原（PCNA、細胞増殖のマーカー、図2a）およびヒストンデアセチラーゼ4（HDAC4、図2a）の発現を増加させた。 YJT 治療は、活性化 B 細胞の核因子カッパ軽鎖エンハンサー (NF-κB)、TNF-α、インターロイキン 6 (IL-6)、およびIL-15に対して、T4治療は腸炎症に対するこの予防効果を示さなかった（図2a）。さらに、T4処理はNF-κB発現を誘導し（図2a）、Trpv3やTrpv4ではなくバニロイド1型の一過性受容体電位チャネル（Trpv1）の発現を刺激しました（熱、炎症、痛みの感覚、図2b）。さらに、YJTとT4の両方の処理は、PTUによるDio1発現の減少を逆転させ、YJTはDio2発現の4.5倍の増加さえも誘導し（図2b）、不活性なT4から生物学的に活性なT3への変換を促進しました。 PTU処理群では、チロシンヒドロキシラーゼ（Th、ノルエピネフリン（NE）合成の律速酵素）の発現が減少し、トリプトファンヒドロキシラーゼ2（Tph2、5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）合成の律速酵素）の発現が増加した。ラットでは、YJTおよびT4治療で逆転しました（図2b）。しかし、5-HT受容体HTR1Fの発現には差異は観察されませんでした（図2b）。 PTU処置ラットと比較して、YJT処置は血清GLP-1レベルの低下とともにGLP-1R発現を阻害し（図2b）、甲状腺機能低下症における嚥下障害を軽減した。さらに、YJT 治療は遊離脂肪酸受容体 3 (FFAR3) の発現を増加させましたが、FFAR2 (どちらも細菌代謝産物の短鎖脂肪酸、SCFA の受容体です) の発現は増加させましたが、武田 G タンパク質共役型受容体 5 (TGR5) の発現は増加させましたが、増加させませんでした。ファルネソイドX受容体（FXR）（後の2つは胆汁酸、BAの受容体）をPTU治療群と比較した（図2c）。さらに、pH 感知 G タンパク質共役受容体 (GPR65)、トール様受容体 4 (TLR-4、細菌 LPS を検出)、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン 2 (Nod2、結合細菌ペプチドグリカン）およびペプチドグリカン認識タンパク質 1（Pglyrp1）は、PTU 治療ラットと比較して YJT 治療グループで観察されましたが、他のすべてのグループと比較して T4 治療グループにおける Pglyrp2 発現の上方制御は注目に値します（図.2c)。これらのデータは、YJT が腸内分泌機能、甲状腺ホルモン変換および複数のシグナル伝達経路に広く関連する腸の遺伝子発現を促進し、甲状腺機能低下症に関連する腸の炎症を阻害することを示しています。

a 腸の密着結合マーカーであるクローディン-2および閉塞帯-1 (ZO-1)、増殖細胞核抗原 (PCNA)、ヒストン脱アセチル化酵素 4 (HDAC4)、および炎症マーカーの核因子κ軽鎖エンハンサーの遺伝子活性化 B 細胞 (NF-κB)、腫瘍壊死因子 α (TNF-α)、インターロイキン 6 および 15 (IL-6 および IL-15) の分析。 b バニロイド 1、3、および 4 型 (Trpv1、Trpv3、および Trpv4)、1 型および 2 型ヨードチロニンデイヨージナーゼ (Dio1 および Dio2)、チロシンヒドロキシラーゼ (Th)、トリプトファンヒドロキシラーゼ 2 (Tph2)、5-の一過性受容体電位チャネルヒドロキシトリプタミン受容体 1 F (HTR1F) およびグルカゴン様ペプチド 1 受容体 (GLP-1R)。 c 遊離脂肪酸受容体 2 および 3 (FFAR2 および FFAR3)、G タンパク質共役胆汁酸受容体 5 (TGR5)、ファルネソイド X 受容体 (FXR)、G タンパク質共役受容体 65 (GPR65)、Toll 様受容体 4 ( TLR4)、Nod 様受容体 2 (Nod2)、ペプチドグリカン認識タンパク質 1 および 2 (Pglyrp1 および Pglyrp2)。データは平均値 ± SEM (グループあたり n = 7 ～ 8) として表示されます。一元配置分散分析とその後の事後 LSD 検定。 *P < 0.05、および **P < 0.01。列の上の異なる文字は、大きな違いを示します。 Con、生理食塩水のみを投与した対照群。 PTU、10 mg/kg プロピルチオウラシル (PTU) を投与されたラット。 YJT + PTU、2.1 g/kg YJT および 10 mg/kg PTU を投与されたラット。 T4 + PTU、0.5 mg/kg L-チロキシンおよび 10 mg/kg PTU で治療されたラット。

甲状腺機能低下症が腸内細菌群集を乱すかどうか、そしてこの乱れがYJT治療によって防止できるかどうかを判断するために、4つの実験グループの26の糞便サンプルからの16 S rRNA遺伝子配列を分析しました。サンプルの物品被覆指数の希薄化曲線は飽和に達し（補足図 2a）、サンプル内で多数の細菌がすべて特定されたことを反映しています。サンプル内の種の多様性（α多様性）は処理間の違いを示さなかったが（補足表1）、ブレイ・カーティスに基づく主座標分析（PCoA）によって示されるように、β多様性は微生物群集構造の分離を示した。非類似性指数 (図 3a)。各グループは、各グループのサンプルの 85% にわたって特定のコアアンプリコン配列バリアント (ASV) を示しました (補足図 2b)。円プロットには、未培養分類群を除く上位 10 属が表示されました (図 3b)。さまざまなグループのバイオマーカーは、LDA エフェクトサイズ (LEfSe) と組み合わせた線形判別分析 (LDA) を通じて特定されました (補足図 2c)。 PTUで治療したラットは、プレボテラ科、パラバクテロイデス科、リケネラ科、ルミノコッカス科などの属の影響をより高い割合で受けたが、ルミニクロストリジウム属とムシスピリルム属の割合は低く、これらの変化はYJTまたはT4治療により対照レベルに回復した。

a サンプル間の類似性と差異を分析および視覚化するための、アンプリコン配列バリアント (ASV) 存在量におけるブレイとカーティスの非類似性に基づく主座標分析 (PCoA) によって示される β 多様性。上部と右側の箱ひげ図は、各グループの被験者の PCo1 軸および PCo2 軸に沿ったブレイ・カーティス非類似性の指数を表示し、統計的差異は順列多変量分散分析 (PERMANOVA) によって決定されました。 b 未培養分類群を除く上位 10 属を表示する円プロット。 c 属レベルでのさまざまな細菌の相対存在量 (中心線はデータの中央値を表し、ボックスの境界はデータの中央の 50% の範囲を表し、ひげはボックスを超えたデータの広がりを表します)。 d 特定の属と、さまざまな腸マーカーおよび受容体のmRNA発現の間の相関係数のヒートマップ。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、および NS、有意差なし。列の上の異なる文字は、大きな違いを示します。 Con、生理食塩水のみを投与した対照群。 PTU、10 mg/kg プロピルチオウラシル (PTU) を投与されたラット。 YJT + PTU、2.1 g/kg YJT および 10 mg/kg PTU を投与されたラット。 T4 + PTU、0.5 mg/kg L-チロキシンおよび 10 mg/kg PTU で治療されたラット。

次に、ピアソン相関および共起ネットワーク分析を実行して、バイオマーカー間、および腸内細菌叢と宿主バイオマーカー間の潜在的な相関関係を明らかにしました。パラバクテロイデス、プレボテラ科、リケネラ科、ルミノコッカ科、ラクトバチルス、エルシミコビウムなどのいくつかの属は負の相関があることが観察されましたが、ルミニクロストリジウムとルミノコッカス科は未分類であり、ローズブリアは食物摂取、血清T4レベルおよびTbと正の相関があることが観察されました（補足図2d）およびS2e）。腸のセンサー-GPR65、TLR4、NOD2、Pglyrp1、およびPglyrp2は互いに正の相関があり、炎症性IL-6およびTNF-αと一致しました（図3e、S2f）。さらに、腸上皮密着結合マーカー (claudin-2 および ZO-1) は、Turicibacter、Ruminococcaceae UCG-010、および Peptococcaceae_unclassified と負の相関がありました。さらに、Turicibacter も Trpv1 と負の相関がありました (図 3e、補足図 3)。この共起ネットワーク内で、差次的細菌属は主に 3 つの共変動濃縮ユニットを生成しました。これらの属は、f_Tannerellaceae (p_Bacteroidota) に属する Parabacterioides 属、f_Ruminococcaceae (p_Firmicutes) に属する 7 つの属 (赤色フォント)、および (in) の 9 属です。黄色のフォント）f_Lachnospiraceae (p_Firmicutes) に属します。同じ p_Firmicutes 由来のこれらの属は、通常、互いに正の相関があるのに対し、p_Bacteroidota 由来の属とは負の相関があります。まとめると、異なる細菌属と宿主表現型の間のこの広範な共発現ネットワークは、宿主の摂食、結核、腸管バリア、および炎症の調節における腸内細菌の潜在的な役割を示唆しています。

YJT 誘導性の体温調節と炎症予防仮説の媒介における腸内微生物叢の役割をさらに確認するために、CMT を実行しました。 PTU処理ラット、YJT + PTU処理ラット、T4 + PTU処理ラット、または対照ラットの盲腸微生物叢を抗生物質処理レシピエントに移し、それぞれCMTPTU、CMTYJT、CMTT4、CMTConと名付けました（図4a）。）。私たちが予測したように、レシピエントはドナーと同様の熱および炎症表現型を示しました（図4b、c）。 1週間の抗生物質治療では、終了後2週間でもTbレベルが慢性的に減少し、体重や食物摂取量に大きな変化はありませんでした（図4b、補足図4a、b）。 CMTPTUラットは溶媒グループよりも低いTbおよび食物摂取レベルを示しましたが、CMTYJTおよびCMTT4ラットは有意な差を示さないか、溶媒グループよりも高いTbさえ示しました（図4b）。さらに、CMTPTUラットは、他のグループよりも高い血糖、血清GLP-1、LPSレベルを示しましたが、血清T3、T4、グレリンレベルが低く、回腸の陰窩長が短いことが示されました（図4c-i）。

a 実験計画の概略図。 b 実験プロセス中の平均中核体温 (Tb) (グループあたり n = 4)。 c 血糖値。 d–h ELISA による血清チロキシン (T4)、トリヨードチロニン (T3)、グレリン、グルカゴン様ペプチド 1 (GLP-1)、およびリポ多糖 (LPS)。 i 4 つの実験グループのヘマトキシリンおよびエオシン染色による回腸の組織学アッセイ。スケールバーは500μmです。データは平均値 ± SEM として表示されます。一元配置分散分析とその後の事後 LSD 検定。 *車両に対して P < 0.05。列の上の異なる文字は、大きな違いを示します。ビヒクル、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を強制経口投与された対照ラット。 CMTPTU、PTU治療を受けたドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTYJT、YJT + PTU 治療ドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTT4、L-チロキシン+PTUで治療したドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTCon、対照ドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。

BAT は、小型哺乳類およびヒトにおいて、独特のミトコンドリアタンパク質脱共役タンパク質 1 (UCP1) を持つ重要な熱産生器官です 18,19。さらに、抗生物質で治療したラットのRT-qPCRを介して、BATの熱産生関連遺伝子、および腸管バリア、腸ホルモン、神経または免疫シグナル伝達、回腸の炎症関連バイオマーカーの維持に関連する遺伝子のmRNA発現を定量しました。これらは、PTU 処理ラット、YJT + PTU 処理ラット、T4 + PTU 処理ラット、およびコントロールラットから盲腸微生物叢とともに移入されました。 Tb の変化に関しては、CMTYJT グループは主に、Adrb3 (ベータ 3 アドレナリン受容体)、Cidea (転写因子である細胞死誘導 DNA 断片化因子アルファ (DFFA) 様エフェクター a) の mRNA レベルが高いことが観察されました。コアクチベーター）、PPAR-α（増殖因子活性化増殖因子活性化受容体アルファ）、PPAR-γ、PRDM16（16を含む正の調節ドメイン）、UCP1（脱共役タンパク質1）、および低レベルのFabp4（脂肪酸結合タンパク質） 4）BATではCMTPTUグループよりも差があったが、PGC-1α（増殖因子活性化受容体γコアクチベーター1α）やDio2などの他の遺伝子はグループ間で差がなかった（図5a）。これらのデータは、YJT で処理された微生物叢が BAT の熱産生機能を活性化したことを裏付けています。

a アドレナリン作動性受容体ベータ-3 (Adrb3)、細胞死誘導 DNA 断片化因子様エフェクター A (Cidea)、増殖因子活性化受容体 γ コアクチベーター 1α (PGC-1α)、増殖因子活性化受容体アルファ (PPAR-α)、増殖因子-活性化受容体ガンマ (PPAR-γ)、正の調節ドメイン含有 16 (PRDM16)、脂肪酸結合タンパク質 4 (Fabp4)、脱共役タンパク質 1 (UCP1)、および 2 型ヨードチロニン脱ヨウ素酵素 (Dio2)。 b クローディン-2、閉塞小帯-1 (ZO-1)、増殖細胞核抗原 (PCNA)、ヒストン脱アセチル化酵素 4 (HDAC4)、活性化 B 細胞の核因子κ軽鎖強化因子 (NF-κB)、腫瘍壊死因子α (TNF-α)、インターロイキン 6 および 15 (IL-6 および IL-15)。 c バニロイド 1、3、および 4 型 (Trpv1、Trpv3、および Trpv4)、1 型および 2 型ヨードチロニンデイヨージナーゼ (Dio1 および Dio2)、チロシンヒドロキシラーゼ (Th)、トリプトファンヒドロキシラーゼ 2 (Tph2)、5-の一過性受容体電位チャネルヒドロキシトリプタミン受容体 1 F (HTR1F) およびグルカゴン様ペプチド 1 受容体 (GLP-1R)。 d 遊離脂肪酸受容体 2 および 3 (FFAR2 および FFAR3)、G タンパク質共役胆汁酸受容体 5 (TGR5)、ファルネソイド X 受容体 (FXR)、G タンパク質共役受容体 65 (GPR65)、トール様受容体 4 ( TLR4)、nod 様受容体 2 (Nod2)、ペプチドグリカン認識タンパク質 1 および 2 (Pglyrp1 および Pglyrp2)。一元配置分散分析とその後の事後 LSD 検定。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。列の上の異なる文字は、大きな違いを示しています。ビヒクル、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を強制経口投与された対照ラット。 CMTPTU、PTU治療を受けたドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTYJT、YJT + PTU 治療ドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTT4、L-チロキシン+PTUで治療したドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTCon、対照ドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。

回腸では、クローディン-2の発現はCMTPTUおよびCMTYJTグループよりもCMTT4グループで有意に高く（図5b）、ZO-1、PCNA、またはHDAC4には差がありませんでした。 CMTYJT グループは CMTPTU グループよりも NF-κB および TNF-α 値が相対的に低かったのに対し、NF-κB および IL-15 レベルは両方とも CMTT4 対 CMTYJT ラットで高かった（図 5b）。 Trpv1およびTrpv3の発現はCMTYJTグループよりもCMTYJTグループで高かったが、Trpv4の発現はグループ間で差がなかった（図5c）。 Dio1の発現はCMTPTU群とCMTYJT群の両方でCMTCon群よりも低かったが、Dio2の発現は他の群と比較してCMTYJT群で高かった（図5c）。 Th 発現と Tph 発現の両方にグループ間の差異は見られませんでした。ただし、HTR1FはCMTPTUおよびCMTT4グループで弱い発現が観察されました（図5c）。 GLP-1R発現は、CMTPTUグループよりもCMTT4グループで低かった（図5c）。さらに、CMTPTU グループと比較して、CMTYJT グループでは、TGR5 を除く FFAR2、FFAR3、FXR などの受容体の mRNA 発現の上方制御と、TLR-4 の顕著な下方制御が観察されました。 GPR65、Nod2、Pglyrp1およびPglyrp2は、CMTYJTラットとCMTPTUラットでより低い量を示しました（図5d）。これらの結果は、YJT で処理された微生物叢が細菌に関連する複数のシグナル伝達経路を調節し、甲状腺機能低下に関連する腸の炎症を軽減することを示しています。

すべてのドナーとレシピエントの糞便サンプルに対して 16 S rRNA 遺伝子の配列決定と分析を実行し、細菌定着の効率を確認し、レシピエントのグループ差を比較しました。レシピエントの腸内細菌群集のαおよびβの多様性はドナーのそれとは異なっていましたが（補足図5a、b;補足表2〜5）、ムシスピリラム、プレボテラ科、ツリシバクターなどのいくつかの特定の属は、同様のパターンを示しました。受信者のもの（補足図5c）。さらに、β多様性はレシピエントラットのグループ間の分離を示しました（図6a）。各グループの細菌バイオマーカーはレシピエントでスクリーニングされ（図6b）、CMTYJTラットはCMTPTUラットと比較して、Candidatus_Arthromitusの相対存在量が高く、PrevotellaceaeおよびTuricibacterの存在量が低いことを示しました。一方、ルミノコッカス科はCMTT4ラットで過剰発現され（図6c）、異なるドナーからのCMTによる腸内微生物叢群集の多様な構造と組成を示しています（図6c）。

a サンプル間の類似性と差異を分析および視覚化するための、アンプリコン配列バリアント (ASV) 存在量におけるブレイとカーティスの非類似性に基づく主座標分析 (PCoA) の主座標分析 (PCoA) によって示される β 多様性。上部と右側の箱ひげ図は、各グループの被験者の PCo1 軸および PCo2 軸に沿ったブレイ・カーティス非類似性の指数を表示し、統計的差異は順列多変量分散分析 (PERMANOVA) によって決定されました。 b 糞便微生物群集における LDA スコア > 2 の LEfSe 分析によって選択された示差的な細菌分類。 c 属レベルでのさまざまな細菌の相対存在量 (「+」はデータの平均を示します)。 d 腸マーカーと細菌分類間のマンテルテストとピアソン相関の組み合わせプロット。 e 特定の属と、さまざまな腸マーカーおよび受容体の mRNA 発現の間の相関係数のヒートマップ。一元配置分散分析とその後の事後 LSD 検定。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。列の上の異なる文字は、大きな違いを示しています。ビヒクル、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を強制経口投与された対照ラット。 CMTPTU、PTU治療を受けたドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTYJT、YJT+ PTU 治療ドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTT4、L-チロキシン+PTUで治療したドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。 CMTCon、対照ドナーからの盲腸微生物叢が定着したラット。

さらに、ピアソン相関および共起ネットワーク分析により、これらの腸内細菌の量と、血清T4レベル（補足図6a、b）およびBAT熱産生に関連する遺伝子発現（補足図6c、d）などの異なる代謝表現型との潜在的な相関関係が明らかになりました。および腸の炎症メーカー（図6d、e）。コアTbは腸Trpv1によって感知され、血清T3レベルおよびBAT調節因子によって調節される可能性があります（補足図7）。 Alistipes 属は腸の FFAR2 発現と負の相関があった。さらに、乳酸菌およびアイゼンベルギエラは、それぞれ血清GLP-1およびLPSレベルと負の相関がありました（補足図7）。全体として、共起ネットワーク分析により、CMT 誘導性細菌の相互作用が BAT の熱産生と全身性炎症の調節に寄与していることが明らかになりました。

最近、代謝関連疾患の有望な治療薬として HM に関する広範な研究が行われているにもかかわらず、HM と腸内微生物叢の組み合わせに関する知識は限られており、人間の健康状態の維持に役立つこの分野のいくつかの疑問は未解決のままです 15。この研究では、これら 2 つの相互に依存する分野を組み合わせることで、YJT の投与が PTU 誘発性甲状腺機能低下症のラットの結核および甲状腺ホルモン代謝に顕著な効果を発揮することを実証しました。一方、16 S rRNA 遺伝子配列決定と微生物叢伝達の結果に基づいて、YJT の効果は、腸内微生物群集の変化、したがって特定の受容体セット (例: FFAR2) の調節によって解釈および確認される可能性があります。 /FFAR3、TGR5/FXR、Pglyrp1/2/Nod2、およびTLR4）は、細菌の代謝産物および細胞壁成分として認識されます。私たちは、YJTの温熱特性を媒介して熱産生を活性化し、全身性炎症を予防するYJT-微生物叢-腸シグナル伝達カスケード経路に焦点を当てました。

甲状腺機能低下症は、腸内および全身性腸内毒素症に関連する最も一般的な代謝障害の 1 つです20。 PTU 誘発性甲状腺機能低下症のラットの甲状腺ホルモンレベルは、甲状腺機能低下症のヒトと同様であると報告されています6。したがって、我々の研究では、Sprague-Dawley (SD) ラットの PTU 治療により甲状腺機能低下症が誘発されました。予想通り、PTU 治療により食欲不振、基礎エネルギー代謝の阻害、結核の減少が見られました。これらの代謝表現型は、食欲不振性腸ホルモン GLP-1 の循環レベルの増加、食欲不振誘発性グレリンのレベルの低下、および甲状腺機能低下ラットにおける甲状腺ホルモンレベルの低下と関連していました。腸内細菌叢コミュニティの障害と全身性炎症の増強は、我々の PTU ラットモデルにおける最も注目すべき結果でした。さらに、甲状腺機能低下ラットから微生物叢を移植されたレシピエントは、ドナーと同様の代謝表現型および炎症表現型を示し、これは以前の研究でも観察されました21。したがって、これらのデータは、代謝低下と過剰炎症の形成における甲状腺機能低下症微生物叢の病原性の役割を示しています。

腸内ホルモンや炎症性サイトカインの産生に対する腸内微生物叢の寄与を考慮してこれらの変化を解釈するために、小腸における最も重要な受容体とバイオマーカーのいくつかの mRNA 発現を検出しました。特に、Nod2、Pglyrp1、2 (ペプチドグリカンセンサー)、TLR4 (LPS 受容体) などの先天的パターン認識受容体は、哺乳類の炎症反応と抗菌ペプチドの産生に不可欠です 22。我々は、PTU処理ラットにおいてGPR65、Nod2、Pglyrp1、およびTLR4の発現の有意な増加を観察した。これらの受容体は、細菌成分（ペプチドグリカンおよびLPS）を認識することにより、炎症反応を活性化し、腸関門を突破し、GLP-1分泌を増加させることによって食欲を低下させます23、24、25。さらに、細菌の LPS は、Dio 活性を阻害し、循環中の T3 レベルを低下させるため、低体温症を引き起こすことが実証されています 26、27、28。さらに、現在のデータは、ローズブリア属、ラクノスピラ科、ペプトコッカス科、およびルミニクロストリジウム属が結核菌と正の相関関係にあったのに対し、パラバクテロイデス属、リケネラ科属、およびルミノコッカス科は結核菌と負の相関関係にあったことを裏付けています。これらのデータと一致して、我々は以前、甲状腺機能低下症のアレチネズミモデルの植物相において同様の変化を検出した29。さらに、甲状腺機能低下ラットにおける絨毛の長さ、陰窩の深さ、および腸の密着結合分子の減少は、腸の吸収と障壁の障害を示し、全身性炎症反応の増加につながることが示されました 30。まとめると、LPS-TLR4 およびペプチドグリカン-Nod2/Pglyrp1 シグナル伝達経路の活性化による腸内細菌叢の異常は、甲状腺機能低下ラットにおける代謝の低下と全身性炎症の亢進に関連している可能性があります。

甲状腺機能低下症の従来の治療法としてのL-チロキシンによる治療は、甲状腺機能低下症ラットの体重減少と食物摂取量を改善しました。一方、以前の研究での推奨用量に基づくと、現在のデータは、T4 治療ラットの食物摂取量と Tb レベルの顕著な増加を示しています。脾臓、心臓、肝臓などの一部の臓器の重量の増加。絨毛と陰窩の長さが長くなり、腸細胞の増殖が増加します。そして、これらの T4 処置ラットにおけるいくつかの炎症誘発性および炎症性マーカーの過剰発現。翻訳後修飾に関与する酵素の 1 つである HDAC4 は、細胞増殖を刺激し、上皮のタイトジャンクションを強化することが報告されており 31 、T4 処理ラットにおける腸管 HDAC4、PCNA、およびタイトジャンクションマーカーにおける高発現という我々の発見を裏付けています。これらのデータは、甲状腺機能低下症の治療法としての T4 治療が、過食症、高体温、過剰炎症などの有害事象を引き起こすことを示しています。

この研究では、薬剤誘発性甲状腺機能低下ラットに YJT を投与すると、結核の減少が解消され、全身性炎症が予防されました。 YJT の正確な組成と有効成分は完全には理解されていませんが、フラボノイドやリキリチゲニン、プレバイオティック多糖類などの抗酸化作用と抗炎症作用を持つ化合物が含まれていることを示唆する証拠がいくつかあります16。これらの生物活性成分は、腸上皮 TRP チャネルによって直接感知され、ホルモン (GLP-1、レプチン、アディポネクチンなど) の分泌を調節し、BAT および関連経路に対する潜在的な利点に寄与している可能性があります 32,33。あるいは、これらの植物由来の生成物を発酵させて SCFA にし、体内で抗炎症効果や発熱効果を発揮することもできます 34。腸内微生物叢が甲状腺機能低下症状に対するYJT投与の有益な効果に役割を果たしているかどうかを調べるために、YJT治療を受けたドナーから盲腸微生物叢を抗生物質で治療したラットに移植しました。抗生物質治療は微生物叢を完全に枯渇させることはできなかったが、レシピエントの固有の微生物叢の影響を除去する目的で既存の微生物群集を減少させ、ドナーの微生物叢が定着しやすい環境を作り出し、それが果たす機能の調査に効果的に適用されている腸内微生物叢によるもの35,36。ドナーの微生物叢は、固有の微生物と競合するため、レシピエントの腸内に完全に定着することはできませんでしたが、一部の特定の属はドナーと同様の変化パターンを示しました。 CMT の同じ手順は以前の研究でも適用されました 37。これらのデータは、生着効率と、レシピエントがドナーと同様の代謝表現型および炎症表現型を収集することを示しています。

微生物叢の伝達はまた、小腸における炎症関連遺伝子およびBATにおける熱産生関連遺伝子の発現に対するYJTの効果をもたらす可能性がある。 CMTYJT ラットにおける NE 合成の律速酵素 (Th) の遺伝子発現の増加は、BAT 熱産生の活性化に寄与します。さらに、不活性な T4 から生物学的に活性な T31,29 への変換を促進する腸内 Dio2 の発現増加も、CMTYJT ラットの熱産生を誘導すると考えられました。これらの発見は、YJT または YJT で処理された微生物叢が体内でのこれらの神経伝達物質やホルモンの産生と処理に影響を及ぼし、それがひいてはその温熱特性に寄与している可能性があることを示唆しています。我々のデータはさらに、FXR および/または TGR5 (BA の場合) および FFAR2 および/または FFAR3 (SCFA の場合) などの細菌代謝産物関連受容体が、腸の神経伝達物質およびホルモンの調節に関与している可能性があることを示しています。以前の研究では、エネルギー消費とグルコース制御の強化における BA-TGR5/FXR-Dio シグナル伝達の重要性が示唆されています 38,39,40。さらに、我々のデータは、腸内のLPS-TLR4およびペプチドグリカン-Nod2/Pglyrp1シグナル伝達の減少が、YJTまたはYJTで処理された微生物叢の抗炎症効果を伝達する可能性があることを裏付けています。さらに、YJT 処理微生物叢のレシピエントにおける Trpv1 および Trpv3 発現の増加は、炎症、痛み、熱の感覚、およびその結果としての Tb41、42 の調節に関与しています。以前の文献および現在のデータを考慮すると、Dio1 発現と正の相関を示した Oscillibacter は、抗炎症反応を増強する可能性があります 43。さらに、ファーミクテス属対バクテロイデテス属の比の減少は、YJT 治療群で観察されたもう 1 つの変化であり、これは以前は推定上の疾患状態と関連付けられていました 44。私たちの研究は、YJTで処理された腸内微生物叢が腸の自然免疫系の活性に影響を及ぼし、甲状腺機能低下症によって引き起こされる過剰炎症から動物を保護できることを実証しています。さらに、このデータは、YJT 誘発の体温調節の媒介における微生物叢 - 腸 - BAT 軸の重要な役割を示唆しています。

したがって、YJT は腸内細菌叢の分類をシフトさせることでプレバイオティクスとして作用し、Tb を上昇させ、甲状腺機能低下症に関連する炎症反応を緩和する可能性があります。熱産生に対するこれらの効果は、小腸におけるノルエピネフリンの合成と甲状腺ホルモンの代謝に関与し、最終的にはBATの熱産生経路を活性化するThとDio2の発現増加に関連している可能性があります。甲状腺機能低下症を治療するための従来の薬剤L-チロキシンとは対照的に、YJTは、腸のLPS-TLR4およびペプチドグリカン-Nod2/Pglyrp1シグナル伝達経路の抑制を介して系統的な炎症反応を軽減する独自の効果を持っています（図7）。まとめると、現在報告されているデータは、YJT の有益な発熱性および抗炎症特性が、微生物叢 – 腸 – BAT 軸を介して腸内細菌叢の変化と関連している可能性があることを示唆しています。グループあたりの個体数が限られているため、これらの結果を解釈する際には注意が必要です。 YJT の正確な活性成分と、熱、エネルギー、腸の恒常性を調節するメカニズムは、そのプレバイオティクス機能を理解するために依然として十分に特徴付けられる必要があります。人間の健康におけるHMの広範な性質を考慮すると、これらの発見は、ホロビオント中心の医療を強化するためのパラダイムシフトの理論的根拠を強化することにより、現代の医療システムに新しい窓を開く可能性があります。

プロピルチオウラシル（PTU）で治療した甲状腺機能低下ラットは、低体温、摂食低下、炎症亢進を示しますが、これらは腸内細菌叢の異常、特に非常に豊富なプレボテラ科に関連しています。プレバイオティクスとして、Yijung-tang (YJT) は、腸内細菌叢および代謝産物関連受容体 (FFAR3 および TGR5/FXR など) を調節して、ノルエピネフリン合成のための腸内チロシンヒドロキシラーゼ (Th) およびノルエピネフリン合成のためのヨードチロニンデイヨージナーゼ 2 (Dio2) の遺伝子発現を刺激します。甲状腺ホルモンの代謝を促進し、その結果、褐色脂肪組織 (BAT) の熱産生経路を活性化し、甲状腺機能低下症に関連する全身性炎症を軽減します。対照的に、甲状腺機能低下ラットにおける L-チロキシン (T4) 治療は、グレリン分泌を刺激し、腸内の LPS-TLR4 およびペプチドグリカン-Pglyrp2 シグナル伝達経路を活性化し、高体温、過食症、および過炎症を引き起こします。

YJT は、東国大学国際病院 (大韓民国高陽市一山) の医療用品店から調達されました。乾燥した植物材料を家庭用粉砕機で適当な粗粉末に粉砕し、10倍量の30%エタノール(v/v)に浸漬し、2時間煮沸した。続いて溶液を室温で 1 時間冷却し、1700 × g で 20 分間遠心分離して上清を回収しました。上清をワットマンフィルターで濾過し、ロータリーエバポレーター (EYELA N-1200A、EYELA、東京、日本) を使用して 50 °C で減圧下で蒸発させ、最初の抽出物を得ました。この最初の水性生成物を凍結乾燥機 (Bondiro、IlshinBioBase、Dongducheon、Korea) を使用して凍結乾燥し、最終抽出物をさらに使用するまで -80 °C で保存しました。 YJT の用量は、前述の指示に従って、ヒトとラットの等価用量比として計算されました 45。したがって、ラットに対する YJT の同等の単回用量は 2.1 g/kg/日と計算されました。

生後 3 週間の雄の Sprague-Dawley (SD) ラット (体重約 100 g) を DBL (277 Deokho-ro, Eumseong-jun, Chung Cheong buk-do, Republic of Korea) から購入しました。微生物の伝播を防ぎ、食物摂取量を正確に監視するために7日間の隔離の後、すべての動物を個別のケージに分け、標準的なラットペレット飼料（韓国京畿道城南市、カージル・アジリ・プリナ）と水を自由に与えました。それらは、実験中、周囲温度 22 ± 3 °C、湿度 60 ± 5%、毎日 12/12 時間の明暗サイクルの標準的な実験室条件下で保管されました。この研究におけるすべての手順は、東国大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され（承認番号：IACUC-202201223）、「実験動物の管理と使用に関するガイド」に従って実施されました。

実験 1 は、結核、遺伝子発現、血清代謝産物、腸内微生物群集に対する YJT の効果をテストするために設計されました。最初のセットのラットでは、腹部に Thermochron iButton が埋め込まれ、術後 1 週間で動物は 4 つのグループに分けられました。対照群（Con）には実験期間中、1匹当たり0.3mLの生理食塩水を皮下注射し、他の3群のラットには体重1kg当たり10mg PTUを2日間、背頸部に毎日皮下注射した。週間 (治療 1)6、7。これら 3 つのグループはその後、異なる治療を受けました。 PTU治療群にはPTUのみを投与し、他の2群にはPTUだけでなく0.5 mg/kg/日のL-チロキシン（T4、参照薬）または2.1 g/kg/日のYJTを4週間投与した（治療） 2) (図1a)。実験中、体重 (±0.1 g) と摂食量をモニタリングしました。実験期間の終わりに、各ラットから新鮮な糞便を収集し、液体窒素で凍結し、DNA 抽出のために -80 °C で保存しました。血液サンプルを眼窩下静脈から採取し、1500 × g で 30 分間遠心分離して血清を得ました。治療後、ラットを 12 時間絶食させ、以前の報告書に従って、Zoletil® (チレタミン-ゾラゼパム、Virbac、Carros、フランス) および Rompun® (キシラジン-塩酸塩、Bayer、レバークーゼン、ドイツ) の投与により麻酔下で屠殺しました。プロトコル46。 CMT の実験のために、各ラットから盲腸内容物を収集し、液体窒素で凍結し、-80 °C で保存しました。小腸を切除し、液体窒素中で急速冷凍し、その後の測定のために -80 °C で保存しました。

CMT による実験 2 は、PTU 誘発甲状腺機能低下ラットにおける Tb、遺伝子発現、血清代謝産物に対する YJT の効果を媒介する腸内微生物叢の役割を調べるために設計されました。 iButton 移植を受けた他のラットのセットは、1 週間の回復期間後に 5 つのグループに分けられました (図 4a)。偽CMTの場合、レシピエントラットは、実験中に500μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS、ビヒクル)の胃内強制経口投与を受け、ビヒクル群と名付けられた。他の 4 群にはすべて、抗生物質カクテル (100 mg/kg ストレプトマイシン、200 mg/kg アンピシリン、200 mg/kg ネオマイシン、200 mg/kg メトロニダゾール、および 100 mg/kg バンコマイシン) を 1 日 1 回胃内強制経口投与しました (500 μL)。 1 日あたり) 7 日間47. 次に、抗生物質で治療したこれらのラットに、PTU、YJT + PTU、および T4 + PTU で治療したドナーと対照ドナーからの盲腸微生物叢を、胃内強制経口投与 (1 日あたり 500 μL) を介して、週に 3 日間 (継続的に) ランダムに移植しました。 3週間）、それぞれCMTPTU、CMTYJT、CMTT4、CMTConと名付けられました（図4a）。新鮮な糞便を収集し、液体窒素で凍結し、後の DNA 抽出のために -80 °C で保存しました。小腸とBATも液体窒素に浸し、さらなる分析のために-80℃で保存しました。

盲腸内容物は、実験１のＰＴＵ−、ＹＪＴ＋ＰＴＵ−、およびＴ４＋ＰＴＵ処置群および対照群から収集した。それぞれ1。各グループの 3 人のドナーからのこれらの盲腸内容物 (200 mg) を合わせ、2 mL の滅菌 PBS で希釈し、15 秒間ホモジナイズし、遠心分離 (500 × g、4 °C、5 分間) して大きな食品残留物を除去しました 37,48。 49. 続いて、500μLの懸濁液を胃内強制経口投与によりレシピエントラットに送達した(実験2)。偽ＣＭＴ（ビヒクル群）の場合、ラットは、ＣＭＴ群と同じ日間、強制経口投与のストレスに匹敵するように５００μＬの滅菌ＰＢＳの胃内強制経口投与を受けた。

我々は、生理学的状況におけるコアTbの非侵襲的、継続的、縦断的モニタリングを使用しました49,50。簡単に言うと、Thermochron iButton DS1922L-F5# (精度 0.0625 °C) は、移植後 1 週間後に 30 分または 60 分間隔で Tb の記録を開始するようにプログラムされ、その後、防水のためにパラフィンワックスの薄い層でコーティングされました (比率は 3:1)。 iButton は、全身麻酔下 (3 ～ 5% イソフルラン吸入による) で腹腔に外科的に埋め込まれました。手術後、各動物をホームケージに戻し、1週間回復させました。実験の終わりに、ロガーは動物から取り外され、OneWireViewer ソフトウェアを使用してすべての記録が読み取られました。

耐糖能は、以前の研究に記載されている一般的な方法によって評価されました51。簡単に説明すると、実験の 30 日目に、ラットに絶食状態 (12 時間) で 2 g/kg 体重の滅菌グルコース水溶液を強制経口投与しました (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)。続いて、ラットの尻尾から小さな傷を付けて血液サンプルを採取し、グルコース濃度計 (Accu-Chek Active、Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ) を使用して 0、15、30、60、および 120 で血糖値を測定しました。グルコース投与の数分後。

酵素結合免疫吸着検定法キット (ELISA) を使用して、TSH (CSB-E05115r)、遊離トリヨードチロニン (遊離 T3、CSB-E05076r)、チロキシン (T4、CSB-E05082r) などの血清中のレベルを推定しました。メーカーの推奨に従って GLP-1 (CSB-E08117r)、TNF-α (CSB-E11987r)、グレリン (CSB-E09816r)、および LPS (CSB-E14247r) (Cusabio、武漢、中国)。例としての GLP-1 アッセイの詳細な方法は次のとおりです 52,53。まず血清を不活化ジペプチジルペプチダーゼで処理し、これをマイクロプレートの表面にプレコートし、37℃で2時間インキュベートしました。 GLP-1 への結合に特異的な 2 番目のビオチン結合抗体をマイクロプレートに添加し、インキュベーションを 37 °C で 1 時間続けました。次に、アビジン結合西洋ワサビペルオキシダーゼをウェルに添加し、37 °C でさらに 1 時間インキュベートしました。洗浄後、基質溶液をウェルに添加すると、初期段階での GLP-1 結合量に比例して発色しました。吸光度はELISAリーダー(TECAN Spark、Greenmate Biotech Co、スイス)により450nmで測定した。アッセイ内およびアッセイ間の CV は、フリー T3 および T4 キットでは <15% でしたが、他のキットでは、アッセイ内およびアッセイ間の CV はそれぞれ <8% および <10% でした。

メーカーの指示に従って、Trizol 試薬 (Bioline Reagent、ロンドン、英国) を使用して、BAT および小腸から全 RNA を抽出しました。ナノドロップ分光光度計 (Implen、ミュンヘン、ドイツ) を使用して光学密度を測定することにより、総 RNA を定量しました。オリゴ-(dT) 18 プライマー (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) および RT PreMix キット (Bioneer、大田、韓国) を使用して、抽出した RNA 1 μg の逆転写によって cDNA を合成しました。リアルタイム PCR は、SYBR® Green リアルタイム PCR マスターミックス (東洋紡、東京、日本) およびさまざまな用途に固有のプライマーセットを使用して、96 ウェルプレート内の Light Cycler480TM デバイス (Roche Applied Science、バーゼル、スイス) で実行されました。遺伝子（補足表6）。相対的な遺伝子発現は、2-ΔΔCt 法 54 を使用して計算され、グリセルアルデヒド-3-ホスファターゼデヒドロゲナーゼ (GAPDH) に対して正規化されました。

新鮮な回腸組織を 4% パラホルムアルデヒド溶液で固定しました。パラフィンワックスに包埋した後、Leica RM2235 ミクロトーム (Leica Microsystems、Nussloch、Germany) を使用してサンプルを 4 μm で連続切片化し、ヘマトキシリン・エオシンで染色しました。切片は光学顕微鏡 (BX61 オリンパス、東京、日本) で 40 倍の倍率で観察されました。回腸の画像はデジタルカメラ (Olympus) を使用して取得され、顕微鏡に接続されたコンピューターに表示されました。組織切片の絨毛の高さや陰窩の深さなどの組織学的パラメーターは、ImageJ ソフトウェア (Bethesda、MD、USA) を使用して分析されました 51,55,56。

製造業者のプロトコールに従って、QIAamp(登録商標) fast DNA 便キット (ドイツ) を使用して、糞便ペレットから全 DNA を抽出した。 DNA の質と量は、ナノドロップ分光光度計 (Implant、ミュンヘン、ドイツ) を使用して A260/A280 比を測定することによって検出されました。 A260/A280 比が 1.8 ～ 2.0 の DNA のみを PCR 増幅に使用しました。 16 S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 超可変領域は、2 つのユニバーサルプライマー (341F ～ 805 R) を使用して増幅されました (補足表 7、8)37。各 DNA サンプルについて、サーマルサイクラーシステム (MiniAmp™ Thermal Cycle、Thermo Fisher) で 3 回ずつ PCR 分析を実行しました。 PCR産物は、トリス、ホウ酸、エチレンジアミン四酢酸緩衝液中の1% (w/v) アガロースゲルでの電気泳動を使用してチェックし、臭化エチジウムで染色し、紫外線下で視覚化しました。 PCR産物は、QIAamp(登録商標)高速PCR精製キット(ドイツ)を製造業者の指示に従って使用して精製し、プールした。続いて、Illumina HiSeq 2500 でシーケンスを実行しました。16 S シーケンスのペアエンドデータセットが結合され、FLASH メソッドを使用して品質がフィルタリングされました 57。シーケンス後、QIIME チュートリアル (http://qiime.org/) に従って、いくつかの方法を変更して QIIME2 を使用してすべてのシーケンス解析を実行しました。行配列を結合して選択しました (長さの要件を満たさない低品質のタグとキメラは除去されました)。

食物摂取量と器官質量のデータは、共変量として体重を使用した一元配置共分散分析 (ANCOVA) によって分析されました。血清ホルモン、Tb、および mRNA 発現のその他のデータは、一元配置分散分析 (ANOVA) によって分析されました。主効果が有意で必要な場合には、事後分析と最小有意差 (LSD) 検定を使用して、有意な群の差異をさらに評価しました。すべての統計分析には SPSS 17.0 ソフトウェア (SPSS Inc.、米国イリノイ州シカゴ) を使用しました。結果は平均値 ± SEM として表示され、P 値 < 0.05 は有意であると見なされます。グラフの作成には、GraphPad Prism 7.04 (GraphPad、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用しました。

適切な変更を加えた以前の方法48に従って、Chao 1、観察されたASV、シャノン指数、およびPD全体の細菌コミュニティの豊富さと多様性（α多様性）を評価しました。 β 多様性は、ASV 存在量における Bray-Curtis の非類似性に基づいて PCoA によって推定され、統計的差異は順列多変量分散分析 (PERMANOVA) によって決定されました。特定の細菌は STAMP58 によって同定され、細菌の相対存在量における有意な群差を一元配置分散分析とそれに続く必要に応じて LSD テストによって検査しました。 LDA エフェクトサイズと LEfSe 法を組み合わせて、LDA スコアしきい値 2 を使用して微生物群集の違いを評価しました。ベン図は jvenn59 を使用して作成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

16 S rRNA 遺伝子アンプリコン配列の生データは、NCBI Sequence Read Archive でアクセッション PRJNA938178 として入手できます。

16 S rRNA 遺伝子アンプリコンの配列決定と解析に使用されたコードは、補足情報ファイルで入手できます。

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この研究は、韓国国立財団 (2021H1D3A2A01098426)、中国国立自然科学財団 (32271575)、科学情報通信省の資金提供による韓国食品研究院 (KFRI) の主要研究プログラム (助成金番号 E0170600-06) の支援を受けました。 )、韓国保健福祉省が資金提供する韓国健康産業開発研究院 (KHIDI) を通じた韓国健康技術研究開発プロジェクト (HF20C0020) および科学情報通信省が資金提供する Brain Pool プログラムからの助成金です。韓国国立研究財団 (NRF-2021H1D3A2A01098426)。体温の記録に関して有益な提案をしてくださった Qing-Sheng Chi 博士と、実験中に実験室の設備を準備してくださった Yura Choi、Mingyu Kim、および Soo-Kyoung Lim に感謝いたします。 16 S rDNA データ分析にご協力いただいた Jianfeng Wang にも感謝します。

Saeid Khakisahneh 氏と Xue-Ying Zhang 氏も同様に貢献しました。

東国大学韓国医学リハビリテーション医学科、814 Siksa-dong, Ilsandong-gu, Goyang-si, 10326, Republic of Korea

サイード・カキサネ、ソンイ・ハン、ホジュン・キム

中国科学院動物研究所、害虫およびげっ歯類の統合管理の国家重点実験室、北京、100101、中国

チャン・シュエイン

CAS Center for Excellence in Biotic Interactions、中国科学院大学、北京、100049、中国

チャン・シュエイン

韓国食品研究所、腸内微生物叢研究グループ、ワンジュ郡、245、大韓民国

ソン・ウンジ＆ナム・ヨンド

韓国科学技術大学食品バイオテクノロジー学部、ワンジュ、韓国

ソン・ウンジ＆ナム・ヨンド

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HK、XYZ、SK がこの研究を発案し、実験を計画しました。 SKは実験を行った。 SYH と EJS は研究室の技術的作業で協力しました。 XYZとSKはデータを分析した。 SKとXYZがオリジナルの原稿を書きました。 XYZ、HK、YDN が原稿を改訂しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。 SK と XYZ はこの作業に等しく貢献しました。

ナム・ヨンドまたはキム・ホジュンへの通信。

著者は利益相反については一切開示していません。

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転載と許可

Khakisahneh、S.、Zhang、XY.、Han、SY. 他。 Yijung-tang は、甲状腺機能低下ラットの熱産生を改善し、腸内微生物叢に関連する炎症を軽減します。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 9、32 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00396-2

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受信日: 2023 年 1 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 10 日

公開日: 2023 年 6 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00396-2

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