色素による腸内神経系の活動の可視化

Communications Biology volume 6、記事番号: 236 (2023) この記事を引用

843 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

イメージング技術は大きな進歩を遂げてきましたが、腸ニューロン機能の研究に現在使用されているほとんどの方法論的アプローチは、細胞の機能や生存を妨げる可能性のある外因性造影剤に依存しています。本論文では、全視野光コヒーレンストモグラフィー (FFOCT) を使用して腸神経系の細胞を視覚化し、分析できるかどうかを調査しました。固定されていないマウス結腸のホールマウント調製物に関する実験研究では、FFOCT では筋層神経叢ネットワークの視覚化が可能であるのに対し、動的 FFOCT では筋層神経節の個々の細胞を in situ で視覚化して同定できることが示されました。分析では、動的 FFOCT シグナルがベラトリジンや浸透圧の変化などの外部刺激によって変更される可能性があることも示しました。これらのデータは、動的 FFOCT が正常および疾患状態における腸ニューロンおよびグリアの機能の変化を検出するのに非常に興味深い可能性があることを示唆しています。

腸神経系 (ENS) は、胃腸 (GI) 管内に存在する統合されたニューロンネットワークです。 ENS はニューロンと腸グリア細胞 (EGC) で構成され、運動性、粘膜分泌、細胞増殖、組織修復だけでなく免疫機能も含む主要な消化管機能を制御します 1。 ENS の組織と機能の欠陥は、幅広い消化器疾患および消化器外疾患で観察されるさまざまな消化器機能障害の一因となります2。

過去数年にわたって、正常および異常な条件下での ENS の機能をよりよく理解するために、顕微鏡イメージング技術が開発されてきました。たとえば、高解像度の顕微鏡技術と、カルシウム感受性色素や電圧感受性色素などの蛍光プローブを組み合わせることで進歩が見られました。 ENS の組織と血管構造についての洞察は、切除された消化組織の数平方センチメートルの切片の分析を可能にするライトシート顕微鏡法や光投影断層撮影法などの技術によっても提供されています 4,5。ただし、これらの技術的アプローチは、組織の除去と免疫組織化学的染色を必要とするため、生体外でのみ実行できます。ヒト ENS の in vivo 視覚化は、プローブ共焦点内視鏡検査 (pCLE) を使用して実現されましたが、解像度と浸透深さが低すぎるため、ENS7 の鮮明な画像を取得するには、内視鏡的粘膜下層切開 6 またはクレシルバイオレット染色 6 が必要でした。これに関連して、ENS の高い空間解像度と色素を使用しない動的イメージングを提供する新しい技術が非常に興味深いものとなっています。

この点に関して、光コヒーレンストモグラフィー (OCT) は、後方散乱光と反射光の干渉分析によって組織内部構造のイメージングを可能にするため、非常に役立ちます8。この高速かつ非侵襲的な技術は、固有の組織コントラストに依存して組織の体積再構成を作成します。このイメージング戦略は、人間の目の病気を診断するために最も広く使用されています9が、光ファイバープローブと組み合わせると、OCT は心臓血管系、呼吸器系、または消化器系の画像を取得できます10。腸では、内視鏡 OCT は通常、バレット食道の診断に使用され 11、炎症性腸疾患や結腸直腸がんなどの他の適応症についての予備データが得られています 12、13。一般的な解像度が数十ミクロンの In vivo 内視鏡 OCT 14 は、ENS を視覚化するには解像度が低すぎますが、この技術の 2 つの実装である FFOCT15、16 と高解像度 SD-OCT17、18、19 により、より高い解像度を得ることができます。この論文では、高開口数対物レンズと可視光を使用して 2D 正面画像を取得する FFOCT で得られた結果を紹介します。これにより、マイクロメートル解像度および細胞内解像度の画像の生成が可能になり、OCT 正面画像の取得深さを変更することで体積データも収集できます。その応用は主に、脳 21 を含むさまざまな臓器 20 における手術中の腫瘍辺縁検出のために研究されてきました。目の構造の画像化についても報告されています 22,23。初期の努力にもかかわらず 24、FFOCT の内視鏡版の開発はこれまでのところ達成されていません。腸の ex vivo サンプルでは、FFOCT はマウスとヒトの消化管の筋層神経叢を画像化する能力を実証しました 25。ただし、このイメージング方法では、筋肉細胞などの周囲の組織や ENS によって生成される強い後方散乱信号とスペックルノイズの存在により、腸神経節のニューロンやグリア細胞は視覚化されません。ダイナミック FFOCT (D-FFOCT) と呼ばれる新しいツールは、組織や細胞からの後方散乱光の時間的変動を分析することにより、複雑な組織における細胞のコントラストを大幅に改善しました 26。 D-FFOCT の固有コントラストの基礎となる細胞構成要素の微動の時間解析では、OCT 信号が同じ撮像面から時間をかけて収集されるため、付加ノイズも低減され、画質が向上します。ダイナミックコントラストは、D-FFOCT27 の正面結像面と比較して、組織の断面画像を提供する高解像度 SD-OCT テクノロジーにも実装されました。ダイナミックコントラストを備えたマイクロ OCT は、気道 28、子宮頸部、食道 29 の微細解剖学的構造の視覚化に使用されました。最近の取り組みは、生体内イメージングを可能にするダイナミックコントラストを備えた D-FFOCT およびマイクロ OCT の取得速度と画質をさらに改善することに焦点を当てています 30,31,32。同時に、マイクロ OCT 技術は内視鏡設計にうまく応用されています 33,34。ダイナミックコントラストを備えたマイクロ OCT 内視鏡の予備設計が発表されました 35 が、ダイナミックコントラストを抽出するために必要な長時間のデータ収集中の組織の安定化という課題が大きな制限として残っています。 OCT シグナルの時間的変動の根底にある細胞メカニズムも不明のままですが、ロテノンを使用したミトコンドリア活性の阻害、または 2-デオキシ-D-グルコースを使用した解糖系の阻害により OCT シグナル強度が大幅に低下したため、細胞代謝活性の変化が部分的に原因である可能性があります 26。興味深いことに、FFOCT では個別に識別できなかった個々の上皮細胞や免疫細胞が、D-FFOCT36 によって視覚化できました。これは心強いことですが、ENS を画像化する D-FFOCT の能力や、ENS 細胞からの D-FFOCT シグナルの根底にある生物学的メカニズムについては、これまでのところ何もわかっていません。

本研究では、成体マウスから切除した結腸セグメントをFFOCTおよびD-FFOCTによって分析し、筋層神経叢内のニューロンおよびグリア細胞を画像化するこの技術の能力と、ニューロンの電気生理学的に関連するD-FFOCT信号の変化を測定する能力を実証した。活動。

FFOCT を使用して色素標識なしで筋層神経節を特定できるかどうかを判断するために、マウスの結腸遠位セグメントのホールマウント標本を Sylgard サポート上に固定し、FFOCT を使用して画像化しました。画像は、外部漿膜のレベルから開始して 0.5 μm の連続的な深さで取得されました。縦筋層（図 1a）と輪状筋層（図 1c）は、繊維が互いに垂直であるため、明確に識別されました。興味深いことに、2つの筋肉層の間に記録された10〜12枚のFFOCT画像には、不応領域によって輪郭を描かれた暗いネットワークが示されていました（図1b）。これらの暗い構造が腸管叢に対応することを確認するために、FFOCTによって以前に画像化された組織サンプルを、HuおよびS100βに対する抗体を使用して免疫染色し、それぞれニューロンおよび腸グリア細胞を同定した（図1d〜f）。これらの組み合わせたアプローチを使用して、FFOCTで観察されたダークネットワークがHu / S100β染色と重ね合わされているため、FFOCTを使用して神経節および神経節間線維路によって形成された構造を識別できることを示すことができました（図1f）。しかし、筋層神経叢内に存在する個々のニューロンおよび/またはグリア細胞は、FFOCT を使用して同定できませんでした。

a – c マウス結腸を、FFOCT によって a 縦筋、b 筋層神経叢、および c 環状筋のレベルで分析しました。腸管神経叢の選択された領域は、ニューロン (赤色の Hu) および腸管グリア細胞 (緑色の S100b) の免疫標識後、d FFOCT および e アポトームによって視覚化されました。結合された画像 (f) は、FFOCT によって観察された暗い領域が神経節および神経節間線維路に対応していることを確認します。スケールバー: a ～ c 200 μm。 d – f 100 μm。

D-FFOCT では、選択した領域の画像が時間をかけて取得され、各ボクセル内の動きの分析が可能になり、細胞と核の分解を可能にする追加のコントラストが提供されます。このアプローチを使用して、我々は以前にヒトの腸に沿って個々の上皮細胞を識別することができました36。ここでは、D-FFOCT によって組織サンプルを分析し、この技術を使用して筋層神経節内の個々の細胞を識別できるかどうかを判断しました。

図2に示すように、FFOCT画像とD-FFOCT画像を比較すると、ダイナミックモードでのみ検出された構造が明確に示されました（図2a〜f）。これらの構造のいくつかは、その形態および神経節内での局在からわかるように、おそらく個々の核であったと考えられます。 Light-CT スキャナーによって生成される D-FFOCT 画像は、擬似カラー RGB 画像であり、各カラーチャネルは 3 つの異なる周波数範囲で統合された微動のフーリエドメイン解析に基づいて構築されます。低 [0〜0.6 Hz]、中 [0.6〜5.4 Hz]、高 [5.4〜25 Hz] の周波数は、それぞれ青、緑、赤に色分けされました (図 2g-i)。コントラストを改善し、機能情報を視覚化および定量化するために、RGB 画像は 3 つのカラーチャネルに対応するモノクロ画像に分割されました。このアプローチを使用すると、組織内の信号強度と振幅の違いにより、神経節構造と神経節外構造を区別することができました。第一に、すべての周波数信号の振幅は、神経節外構造と比較して、神経節構造において著しく高かった（図２ｊ）。さらに、神経節構造では、高周波信号の振幅が低周波信号に比べて高かった。これは、神経節外構造には当てはまりませんでした。最後に、どちらの構造でも、中周波信号の振幅は低周波信号や高周波信号に比べて高かった。

a – d FFOCT（a、b）またはD-FFOCT（c、d）における筋層神経叢領域の顕微鏡写真。 b と d は、それぞれ (a) と (c) の点線領域の拡大を表します。 e、f FFOCT (e) および D-FFOCT (f) z スタック画像 (60 枚の画像) の異なる平面 (x/y、x/z および y/z) の直交図。矢印の頭は、直交ビューにおける「顔画像」の位置を示します。 g–i (c) の D-FFOCT 顕微鏡写真は RGB コード化された画像で、青チャンネル (g) は低周波数 [0 ～ 0.6 ヘルツ] を表し、緑チャンネル (h) は中周波数 [0.6 ～ 0.6 ヘルツ] に対応します。 5.4 ヘルツ] と赤のチャンネル (i) を高周波 [5.4 ～ 25 ヘルツ] にします。 j 低（青）、中（青緑）、高（朱）の周波数の平均強度が、筋層神経叢の神経節内および神経節外領域で測定されました。平均強度 +/- SEM を決定するために 3 匹の動物を使用し、動物ごとに 5 つの独立した領域を分析しました。統計: 両側マンおよびホイットニー t 検定。 *p < 0.05; ***p < 0.001。スケールバー: a、c、g – i、125 μm。 b、d、30μm。 e-f、x/y 30 μm、x/z および y/z 12 μm。 MP 筋層神経叢、Mu 粘膜。

D-FFOCT によって検出される腸管神経叢内の構造を同定するための最初のアプローチとして、D-FFOCT を、核を標識し、腸管神経系の細胞を特徴付けるために現在使用されている標準的な組織学的および免疫染色法と組み合わせました。この目的のために、D-FFOCT で画像化した組織サンプルを固定し、デオキシリボ核酸 (DNA) に結合する細胞透過性蛍光色素である 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で染色しました。 D-FFOCT画像とDAPI染色の高倍率共焦点顕微鏡写真を重ね合わせると、D-FFOCTによって筋層神経叢で検出された核様構造がDAPI標識核に対応することが明確に示されました（図3a〜h）。興味深いことに、すべての核を D-FFOCT で可視化できるわけではありません。筋層神経節で計数された261個のDAPI標識核のうち、27個はD-FFOCTによって視覚化されませんでした（図3e〜hの白い矢印）。注目すべきことに、筋細胞のような細胞が存在する可能性がある一方で、神経節外領域では D-FFOCT 核が検出されませんでした。この観察は、細胞または形態に依存する FFOCT シグナルを示唆しています。

a – d D-FFOCT（a）およびDAPI染色共焦点顕微鏡写真（b）の合成画像（c、d）。マウスの筋層神経叢の同じ領域を分析し、比較しました。 dでは、信号の共局在がはっきりとわかるように、D-FFOCTの高周波（赤）画像のみをDAPI共焦点画像（白）と重ね合わせています。スケールバー: 25 μm。 e～hは(a～d)の点線部分の拡大図。矢印は、D-FFOCT では検出されない DAPI 陽性核を指します。スケールバー: 10 μm。 i-k D-FFOCT（i）またはHu（j）またはS100b（k）免疫染色後のアポトームによって視覚化された同じ神経節の顕微鏡写真。 D-FFOCT 陽性核と重複する Hu 細胞と S100b 細胞は、それぞれ矢印と矢頭で正確に示されました。スケールバー: 25 μm。 l–n マウス腸管神経節の高周波 D-FFOCT (赤)、Dapi (白)、Hu (l、緑) または S100b (m、黄) 共焦点顕微鏡写真の合成画像。同じ神経節では、D-FFOCT 陽性核 (単一矢印) および陰性核 (二重矢印) が示されました。オレンジ色の矢頭および二重矢頭は、D-FFOCT 核が Hu と共局在することを示し、白色の矢頭および二重矢頭は、D-FFOCT 核が S100b と共局在することを示しました。スケールバー: 25 μm。 o HuまたはS100b染色と共局在するD-FFOCT陽性核のサイズ頻度分布。 3 匹のマウスの 13 神経節内の 344 個の核を分析しました (10 µm2 の範囲でプール)。 p ニューロン (Neu、n = 219) またはグリア (EGC、n = 125) D-FFOCT 陽性核の平均面積 (μm2)。平均値 +/- SEM; 統計: 両側マンおよびホイットニー t 検定。 q ニューロン核 (Neu、n = 219) またはグリア核 (EGC、n = 125)) の低周波数 (青)、中周波数 (青緑)、または高周波数 (朱色) の平均強度。平均値 +/- SEM; 統計: 両側マンおよびホイットニー t 検定。 *p < 0.05; **p < 0.01、***p < 0.001。

D-FFOCT 陽性核を持つ細胞を特徴付けるために、組織を固定し、ニューロン (Hu) またはグリア (S100β) マーカーに対する抗体を使用して免疫染色し、アポトーム蛍光顕微鏡で分析しました。図3i〜kに示すように、D-FFOCTによって観察された核様構造の大部分は、Hu（矢印）またはS100β（矢印）染色と重なっていました。免疫組織化学およびDAPI染色後の共焦点顕微鏡によって得られた画像とD-FFOCT画像を重ね合わせると（図3l、m）、DAPI陽性Hu陽性細胞でD-FFOCT核構造が検出されたことが明らかになりました（図3lのオレンジ色の矢印）、n）。オレンジ色の二重矢印で示されているように、DAPI 陽性 Hu 陽性ニューロンはほとんど D-FFOCT 核構造を示さなかった。グリア細胞に関しては、大部分の DAPI 陽性 S100β 陽性グリア細胞 (図 3m、n の白い矢印) で D-FFOCT 核構造が検出されましたが、一部の DAPI 陽性 S100β 陽性細胞は D-FFOCT では見えませんでした。 -FFOCT (図 3m、n の白い二重矢印)。細胞計数の結果、D-FFOCTによって検出された核構造は、DAPI陽性核を含むニューロンの96％（170個中163個の核）とEGCの78％（91個中71個の核）に存在することが示された。

D-FFOCT 核構造の形態および/または RGB 強度を使用して核をニューロンおよびグリア細胞から区別できるかどうかを判断するために、それらのサイズ分布を分析しました。その結果、ガウス分布が明らかになりました。グリア細胞の場合、ピークは小さな核に対応するヒストグラムの左側の部分に局在していましたが、ニューロンの場合、ピークは大きな核に対応する右側にありました（図3o）。この観察は、EGC D-FFOCT 核構造の平均面積がニューロン D-FFOCT 核構造の平均面積よりもほぼ 2 倍小さいという事実によって裏付けられています (49.9 μm² +/- 15.8 対 89.9 μm² +/- 17.9、それぞれ;平均+/- SD）（図3p）。興味深いことに、カットオフ値 65 µm2 により、65 µm2 以下と 65 µm2 を超える画分にある EGC の 78.4% とニューロンの 92.7% をそれぞれ識別できることがわかりました。 D-FFOCT 周波数の振幅を比較しました。結果は、すべての周波数信号の平均強度がグリア細胞と比較してニューロンで有意に大きいことを示しました（図3q）。

D-FFOCTシグナルがニューロン活動によって調節されるかどうかを判断するために、Naチャネル活性化剤であるベラトリジンの添加前と添加30分後に神経節全体の画像をD-FFOCTによって取得しました（図4a）。

75 μM ベラトリジンによる 30 分間の処理前 (T0) と処理後 (T1) に視覚化された同じ神経節の D-FFOCT 顕微鏡写真。スケールバー: 30 μm。 b、c ビヒクル（0.1% vol/vol DMSO）または75 μMでの処理後の低（青）、中（青緑）、または高（朱）の周波数範囲の平均強度のパーセンテージとして表されるT1:T0比。ベラトリジン（ベラ）。平均強度は、パネルの上部に示されているように、神経節全体 (b) または核構造 (c) から計算されました。 d、e (c) と同じ実験ですが、核はサイズ > 65 μm (d) と <65 μm (e) の関数で細分化されました。ベラトリジン、4 匹のマウスからの n = 20 神経節。 DMSO、n = 20 (b、d) または 18 (c、e) 4 匹のマウスの神経節。平均値 +/- SEM; 統計: 両側マンおよびホイットニー t 検定。 *p < 0.05; **p < 0.01、***p < 0.001。

次に、低域、中域、および高域の周波数の平均強度が分析されました。図4bで観察されたように、ベラトリジンは、対照と比較して神経節全体で高周波および中周波シグナルの強度の増加と低周波シグナルの強度の大幅な減少を誘発しました（図4b、動物あたり5つの神経節）条件ごとに 4 匹の動物から収集、コントロール: DMSO 0.1% vol/vol)。次に、D-FFOCT シグナルに対するベラトリジンの影響を単一核レベルで調べました。対照と比較して、ベラトリジン処理核では中周波と高周波の両方のシグナル強度の増加が観察されましたが、低周波では変化は認められませんでした（図4c、4匹の動物で1匹あたり100〜300個の核）。興味深いことに、基礎条件下では検出されなかったいくつかの D-FFOCT 核シグナルがベラトリジン処理核で観察されました（補足図 1a、矢印）。 D-FFOCT シグナルの変化が細胞型に依存するかどうかを判断するために、結果をニューロン細胞 (核サイズ >65 µm2) とグリア細胞 (核サイズ <65 µm2) を区別する核サイズカットオフ値の関数として分類しました。 μm2)。対照と比較して、ベラトリジン処理は、主にニューロンに対応する核サイズ>65μm2の細胞集団における中周波および高周波シグナルの両方の強度を大幅に増加させました（図4d）。ベラトリジンはまた、主にグリア細胞で構成される核サイズ<65μm2の細胞集団における高周波シグナル強度の有意な増加を誘導しました（図4e）。最後に、ベラトリジンによって誘発された D-FFOCT シグナルの変化は、クレブス溶液で洗い流した後に逆転しました（補足図 1b、c）。

神経活動は神経細胞およびグリア細胞のD-FFOCTシグナルを調節するため、テトロドトキシン（TTX）による基礎神経活動の薬理学的阻害がD-FFOCTシグナルに影響を与えるかどうかを調べました（図5a）。 TTXによる処理後の神経節全体の分析により、毒素は中周波または高周波信号の強度を変化させなかったが、低周波信号の強度を大幅に減少させたことが明らかになりました（図5b）。さらに、TTXで処理した後の核構造では、D-FFOCT周波数シグナルの有意な変化は観察されませんでした（図5c）。

1 μM テトロドトキシンによる 30 分間の処理前 (T0) と処理後 (T1) の同じ神経節の D-FFOCT 顕微鏡写真。スケールバー: 30 μm。 b、c ビヒクル（クレブス）またはテトロドトキシン（TTX）による治療の低（青）、中（青緑）、または高（朱）範囲の周波数の平均強度のパーセンテージで表した比T1：T0。平均強度は、神経節全体 (b) または核構造 (c) から計算されました。テトロドトキシン、5 匹のマウスからの n = 25 の神経節。クレブス、3 匹のマウスからの n = 15 の神経節。平均値 +/- SEM; 統計: 両側マンおよびホイットニー t 検定。 **p < 0.01。

ニューロン活動の増加がニューロン核とグリア核の両方で D-FFOCT シグナルを調節するという観察により、これらの変化の根底にある推定メカニズムをさらに調査することが求められました。興味深いことに、ニューロンの活動は、転写活性の変化による核形態の変化に関連していることが示されています 37。核の形態を調節することが知られている他の要因の中には、浸透圧ストレスもあります 38,39。特に、高浸透圧は核の収縮を誘発したり、核の形態を収縮させたり、その振動特性を変化させたりすることが示されており、その変化は D-FFOCT で検出できる可能性があります。

この仮説を検証するために、浸透圧の変化がENS細胞のD-FFOCTシグナルに影響を与えるかどうかを分析しました（図6a）。興味深いことに、マンニトールの濃度が増加すると、神経節（図6b）だけでなく、神経節細胞核（図6c）でも、低、中、高周波数のD-FFOCTシグナルの強度が大幅に減少しました。神経節（補足図2b）および核（補足図2c）のD-FFOCTシグナルは、クレブス溶液で洗い流した後に初期値に戻ったため（補足図2a）、この効果は可逆的でした。

ビヒクル（Krebs）、100、200、または300 mMのマンニトールで30分間処理した後（T1）の同じ神経節のD-FFOCT顕微鏡写真。スケールバー: 25 μm。 b、c ビヒクル (Krebs、0) または 100、200、300 mM による治療の低 (青)、中 (青緑)、または高 (朱) 周波数範囲の平均強度の割合で表した T1:T0 比マンニトールの。平均強度は、神経節全体 (b) または核構造 (c) から計算されました。 3 匹のマウスからの n = 15 個の神経節。平均値 +/- SEM; 統計: 各色について、両側クラスカル-ウォリス検定とそれに続くダン検定。 *p < 0.05; **p < 0.01、***p < 0.001。

本研究では、OCT 信号または D-FFOCT の時間周波数解析により、マウス結腸の標本中の腸ニューロンおよびグリア細胞の in situ 同定が可能になることを示しました。腸ニューロンおよびグリアの核における OCT シグナルの周波数は、神経節外領域で記録されたものよりも高く、興味深いことに、ニューロンの活性化や高浸透圧などの外部刺激により、OCT シグナルの変動に可逆的な変化が引き起こされました。将来的には、この技術の使用により、健康や病気における腸管およびグリア機能の変化について新たな洞察がもたらされる可能性があります。

FFOCTイメージングモードにより、縦筋と輪状筋の間の界面に低反射構造が明らかになり、免疫組織化学により筋層神経叢であることが特定されました。同様の所見は、OCT 技術を使用してマウスでも以前に得られており、ヒルシュスプルング病の動物モデルにおける筋層神経節の密度の変化を検出できるようになりました 25。 FFOCTイメージングでは、縦走筋と筋層神経節の境界面にある神経節に一致する高屈折構造も示されました（図1a）。これらの高屈折構造は、コラーゲンに富んだ化合物によって形成されている可能性があり、その分子は神経節と縦筋の接着に重要です40。興味深いことに、この細胞外マトリックスの組成は、炎症性腸疾患 41 やヒルシュスプルング病 42 などの病的状態において変化します。したがって、FFOCT は細胞外マトリックスの組成の変化を検出するための興味深いツールとなる可能性があります。これに関して、我々は最近、二分脊椎患者の結腸粘膜における高反射性 FFOCT シグナルの減少が、コラーゲン沈着のマーカーであるシリウスレッド染色の強度の大幅な減少と相関していることを示しました 43。

他の研究とは対照的に、FFOCT では筋層神経節の個々の細胞を視覚化することはできませんでした 25。この不一致は、私たちが使用した市販の FFOCT システム (Light CT スキャナー、LLTech) 間の対物レンズや光源強度などの技術的な違いによって説明される可能性がありますが、D-FFOCT では、細胞の全層にわたって個々の細胞をイメージングする可能性が得られます。腸組織、特に腸管神経叢や上皮細胞層などの明確な構造において。したがって、この技術的アプローチは、腸管のさまざまな部分からのヒト生検材料の上皮細胞を識別するために最近使用されました 36。さらに、D-FFOCT は細胞内の動きを統合する可能性を提供し、放射された周波数の強度に応じた画像を提供します。中周波および高周波の上昇を特徴とする核などの細胞内成分は、D-FFOCT により筋層神経節ではっきりと確認でき、免疫組織化学分析により、これらの核がニューロンまたはグリア細胞に相当することが示されました。興味深いことに、神経節内ニューロンの 96% が D-FFOCT によって可視化されましたが、神経節外領域または筋肉層では D-FFOCT によって細胞要素がほとんど、またはまったく識別されませんでした。 D-FFOCT シグナルは移動する細胞内構造の代謝活性に関連している可能性があるため、これらの違いは細胞内の代謝活性のレベルの違いの結果であると仮説が立てられる可能性があります。 3 つのカラーチャネル間の最適な周波数分離の調査は、ENS の視覚化をさらに改善するために興味深い可能性があります。また、D-FFOCT画像と免疫染色後の共焦点画像では、核の形状や位置に不一致が見られる場合がありました。これはおそらく、無視することを選択した 2 つの取得の間の固定および染色プロセスによって引き起こされた変形と、画像解像度のために避けられないそれ自体の位置合わせエラーによるものと考えられます 44。実際、形状の偏りを避けるために、位置合わせは変形を許さず厳密に実行されました。この厳格な制約により、D-FFOCT で観察できるのは細胞ではなく核であると自信を持って主張できましたが、観察された小さな不一致につながりました。

本研究では、ニューロンおよびグリア細胞の D-FFOCT シグナルが外部刺激によって変更される可能性があることも実証しました。私たちは最初に、高浸透圧が FFOCT 核シグナルを可逆的に減少させることを示しました。興味深いことに、高浸透圧はタンパク質の DNA への結合を変化させ、有糸分裂に匹敵する可逆的な DNA 凝縮プロセスを誘導することが知られています 45。したがって、マンニトールの濃度を増加させた後の D-FFOCT シグナルの可逆的な減少は、核 DNA 凝縮による DNA 移動の減少によるものである可能性があります。浸透圧に加えて、ニューロン活動の増加は、特にマイトジェン活性化プロテインキナーゼなどの細胞内経路を介してニューロンの転写活性を活性化するため、D-FFOCTシグナルに対するニューロン活動の影響を決定することを目的としました46。実際、活性に依存するクロマチン状態の変化は、核の振動状態に影響を与える可能性があります。今回我々は、ベラトリジンによるニューロン活動の刺激が、筋層神経節に存在するニューロンおよびグリア細胞の核において中および高周波のD-FFOCTシグナルの増加を引き起こすことを報告した。グリア細胞はベラトリジンによって直接活性化されませんが、D-FFOCT シグナルの増加は、ニューロン活性化後の神経グリア相互作用の結果である可能性があります。興味深いことに、基礎条件下では筋層神経節では検出されなかった核が、ベラトリジンでの治療後に観察されました（補足図1）。このような誘導は、高浸透圧刺激の後では観察されませんでした。さらに、TTX による処理後に核構造において D-FFOCT 周波数シグナルの有意な変化が観察されなかったという事実の根底にある理由は不明のままです。しかし、これは、基礎条件下ではニューロンの活動が低いため、TTX を追加しても、我々のシステムでは検出できない活動の小さな変化しか誘発されないという事実によるものである可能性があります。筋層神経節における D-FFOCT シグナルの分子基盤を理解するにはさらなる研究が必要ですが、我々のデータは、核の振動状態の変化が核 DNA の凝縮および/または転写活性の変動に関連している可能性があることを示唆しています。

私たちの今回の研究は、D-FFOCT を使用して、筋層神経叢の神経細胞およびグリア細胞をその場で画像化および識別できることを初めて実証しました。生理的および非生理的刺激に応答した核の振動周波数の変化は、D-FFOCT が細胞活動の分析や異常な細胞機能の検出にも役立つ可能性があることを示唆しています。

8〜12週齢の雄C57BL/6J Rj マウス（Janvier Laboratory、ル・ジェネスト・セント・アイル、フランス）を12時間の明暗サイクルで飼育し、餌と水を自由に摂取させた。研究者はフランス国立獣医庁の認定を受けており、実験は地元のナント（フランス）の動物管理使用委員会の勧告に厳密に従って実施されました。 1週間の適応期間の後、動物を頸椎脱臼により屠殺し、組織を採取した。各マウスの腸全体を素早く切除し、氷冷したクレブス溶液（NaCl、117 mM、KCl、4.7 mM、MgCl2、1.2 mM、NaH2PO4、1.2 mM、NaHCO3、25 mM、CaCl2、2.5 mM、グルコース、 11mM）。

成体マウスから腸組織を収集し、冷クレブス溶液で洗浄し、小片に切断した。次に、遠位結腸の部分を腸間膜に沿って縦方向に開き、引き伸ばし、サンプルキャリアに適合したSylgard (Dow Corning, Midland, MI)上にピン留めした。

FFOCT および D-FFOCT 画像は、防振テーブル (ジンバルピストン防振機能を備えた CleanBench、Photon Lines SAS、サンジェルマンアンレー、フランス) 上に置かれた Light-CT スキャナー (LLtech、フランス、パリ) を使用して実行されました。 Sylgard キャリアプレートは、乾燥を避けるために十分な溶液とともにスキャナーホルダーに配置されました。ハロゲン光源でサンプルを照明した後、サンプルから反射された光は、メガピクセルカメラで検出される前に、Linnik 干渉計の参照アームの光と干渉しました。二次元 (2D) 「正面」画像は、視野 1.25 mm × 1.25 mm、ボクセルサイズ 1 μm × 1 μm × 1 μm で収集されました。このシステムにより、最大約 150 µm の深さのサンプルの探査が可能になりました。 D-FFOCT の場合、300 Hz で 1000 枚の画像が収集されました (3.3 秒間、3.3 ミリ秒ごとに干渉計画像を出力)。 S/N 性能を改善するために、4 つの画像の重複しない平均をローパスフィルターとして適用して、より高い周波数を効果的に減衰させ、より多くのフォトンを測定しながらノイズを抑制しました。市販の Light-CT スキャナの S/N 比を最大化するために、RGB 積分バンドは低周波数の青チャネル (0 ～ 0.6 Hz)、中周波数の緑チャネル (0.6 ～ 5.4 Hz)、および高周波数に事前設定されています。 - 周波数赤チャンネル (5.4 ～ 25 Hz)。

FFOCT イメージング後、結腸サンプルを PBS 中の 4% パラホルムアルデヒドで室温で 3 時間固定し、洗浄し、使用するまで PBS NaN3 (1 リットルあたり 1 g) 中に保存しました。透過処理は、10% ウマ血清、3% トリトン X100、0.05% サポニンを添加した PBS NaN3 中で組織を 4 °C で撹拌しながら 48 ～ 36 時間インキュベートすることによって達成されました。次に、サンプルを一次抗体抗Hu (1:500のヒトモノクローナル抗体、ギフト)および抗S100b (1:3のウサギポリクローナル抗体、Dako Agilent、米国サンタクララ)を含む透過性緩衝液中で24時間インキュベートしました。室温で撹拌します。洗浄後、サンプルを、1:500に希釈した二次抗体ヤギ抗ウサギCy5（Jackson Immuno Research、ケンブリッジハウス、英国）および1/500に希釈したロバ抗ヒトCy3（Jackson Immuno Research）を含む透過性緩衝液中で5時間インキュベートしました。）室温で撹拌しながら。洗浄後、DAPI (PBS Sigma-Aldrich、米国セントルイス、1:1000) を使用して核対比染色を室温で 10 分間行い、サンプルをスライドとカバースライドの間に退色防止封入剤 (Prolong gold antifade、Thermofisher) で封入しました。、ウォルサム、米国）。

標本は、Apotome2 に関連付けられた蛍光 AxioZoom.V16 (Zeiss、マルリールロワ、フランス) を使用して観察されました。共焦点画像は、60 倍と 20 倍の 2 つの対物レンズを備えた共焦点顕微鏡 Nikon A1 RSi (Nikon SAS、シャンピニーシュルマルヌ、フランス) を使用して取得しました。 FFOCT とアポトームからの画像は、「ライン ROI による画像の位置合わせ」プラグイン T. 3D D-FFOCT (Fiji ソフトウェア)47 を使用して位置合わせされ、共焦点 3D 画像は以下に説明するように ICY ソフトウェア48 を使用して位置合わせされました。

D-FFOCT の画像は、ICY の下で ec-clemv244 を使用して位置合わせされました。

D-FFOCT の内容を細胞レベルで正確に評価するために、2 つのシステム間でのサンプルの姿勢の変化を考慮し、このスケールでは組織の変形は無視できると厳密に仮定して、レジストレーションは 3D で実行されました。 D-FFOCTイメージング（補足図3a）後、サンプルをNikon A1R共焦点で20倍でイメージングし、対象領域の特定を容易にする参照画像を取得しました（補足図3e）。次に、任意の視野上のスタックが 60 倍で取得されました (補足図 3f)。 20x の最大強度投影は、対象の構造を使用し、変換でスケーリングや変形を行わない (回転と平行移動のみが許可される) ように制約を設定して、最初に D-FFOCT に手動で登録されました。これにより、20x から D-FFOCT への 2D 変換行列が得られます。両方の画像のピクセル数が大幅に異なっていたとしても、ec-clemv2 は、計測器によって与えられた画像メタデータに基づいて、ピクセルサイズを使用してマイクロメートル単位で変換を計算し、変換を厳密に制限することができました。 60 倍の共焦点取得の最大強度投影は、ecclemv2 のオートファインダー部分を使用して 20 倍の最大強度投影で自動的に検出されました。カスタマイズされた icy プロトコルを使用します。これにより、2D 変換が 60 倍から 20 倍になります。これらの変換は、ecclemv2 のカスケード変換関数を使用して計算するために結合され、逆変換されて D-FFOCT から 60x 2D 変換が得られます。この変換は D-FFOCT フルスタックに適用され、いくつかの核と一致すると仮定されたものの手動で選択された中心に基づく 3D 剛体位置合わせの初期化として機能しました (両方の画像の 3D で局在化された約 10 点)。厳格な制約により、画像を変形させず、位置合わせに使用されなかった原子核が適切に一致していることを確認することができました。

神経細胞およびグリア細胞の各核サイズを識別および定量化するために、FIJI のアルゴリズム「Align Image by line ROI plugin」を使用して D-FFOCT 画像とアポトーム画像を重ね合わせました。

核分析では、フィジー国内の WEKA プラグインを使用して D-FFOCT 画像からマスクが作成されました。マスクにより、赤、緑、青の画像が分割されたと報告されています。次に、パラメータ平均強度を含む 2D ROI が各コンパートメントについて分析されました。 125 個のグリア核と 219 個のニューロン核の平均強度を測定しました。

分析する領域をマークした後、Sylgard に固定された各組織サンプルを、治療前 (T0) に D-FFOCT によって画像化しました。次にサンプルをキャリアプレートから取り出し、6 ウェル細胞培養プレートに置き、75 μM のベラトリジン (Sigma-Aldrich、セントルイス、米国)、1 μM の TTX (Bio-Techne SAS、Noyal-Châtillon sur Seiche) で処理しました。、フランス)、100 mM、200 mM、および 300 mM の D-マンニトール (Sigma-Aldrich)、0.1% (vol/vol) DMSO (ベラトリジンコントロール) または Krebs (TTX およびマンニトールコントロール) を室温で 30 分間撹拌（２００ｒｐｍ）。次に、Sylgard に固定された各処理組織サンプルは、D-FFOCT (T1) によって画像化されるために、同じ圧力と位置 (X、Y) でスキャナーホルダーに戻されました。次に、各組織サンプルを 15 分間ずつ 2 回洗浄し、D-FFOCT (T2) によって再度画像化しました。

治療前（T0）、化学処理後（T1）、洗浄後（T2）に取得された神経節の D-FFOCT 画像は、フィジー国内の「Align 機能」を使用して位置合わせされました。

神経節全体の解析では、T0 で観察された神経節を手動で囲んでマスクを作成し、T0、T1、T2 で取得した赤、緑、青の画像を分割し、神経節全体の平均強度を測定したと報告されています。青は低周波（LF、0 ～ 0.6 Hz）、緑は中周波（MF、0.6 ～ 5.4 Hz）、赤は高周波（HF、5.4 ～ 25 Hz）に対応します。

核分析のために、フィジー国内のWEKAプラグイン49を使用してT0で取得した画像からマスクが作成されました（補足図4）。マスクにより、赤、緑、青の画像が分割されたと報告されています。各核の平均強度を T0、T1、および T2 で計算しました。結果が T0 のパーセントで表される場合、値は各核について計算され、神経節ごとの平均値が使用されました。

独立した実験の数は図の凡例に指定されています。統計的有意性は、ノンパラメトリック両側マンおよびホイットニー t 検定または両側クラスカルワリス検定とそれに続くダン検定を使用して決定されました。すべての統計分析は、GraphPad Prism (GraphPad Prism 8.0、GraphPad software Inc) を使用して実行され、0.05 以下の p 値の差は統計的に有意であると見なされました。 *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究中に生成または分析された数値データは、この公開された論文 (およびその補足データファイル) に含まれています。現在の研究で提示されている顕微鏡写真は、[OMERO] リポジトリ [https://omero.os-bird.glicid.fr/webclient/?show=project-315 ログイン: guest_user パスワード: ようこそ!1] で入手できます。

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この作品は、「ペイ・ド・ラ・ロワール地方」のミビオゲート（大会2016-11179）とサンテディジェ財団の支援によるものでした。我々は、フランス国立研究庁 (ANR-10-INBS-04) が支援する国家インフラストラクチャー France-Bioimaging のメンバーである IBISA MicroPICell 施設 (Biogenouest) を認めます。 PP-G. は、ANR CROCOVAL (ANR-18-CE45-0015) によってサポートされています。

この作品は、ミッシェル・ヌンリスト、フィリップ・ナヴェイアンの共同監修者です。

ナント大学、CHU ナント、Inserm、TENS、腸および脳疾患における腸管神経系、IMAD、ナント、フランス

トニー・デュラン、ララ・ラブディ、エマニュエル・コロン、イザベル・ヌヴー、ミシェル・ヌーリスト、フィリップ・ナヴェイアン

ナント大学、CNRS、INSERM、胸部研究所、F-44000、ナント、フランス

ペリーヌ・ポール・ジロトー

ナント大学、CHU Nantes、Inserm、CNRS、SFR Santé、Inserm UMS 016、CNRS UAR 3556、F-44000、ナント、フランス

ペリーヌ・ポール・ジロトー

Wyss Center for Bio and Neuroengineering、キャンパスバイオテック、ジュネーブ、スイス

ミカリーナ・ゴーラ

ICube 研究所、CNRS、ストラスブール大学、ストラスブール、フランス

ミカリーナ・ゴーラ

消化器科および肝臓病科、ジュネーブ大学病院 (HUG)、rue Gabrielle Perret-Gentil 4、1211、ジュネーブ、1205、スイス

エマニュエル・コロン

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MN、PN、および TD は、作品のデザイン、構想、解釈に貢献します。 TD、LL、PP-G.、および PN がデータを取得、分析、解釈しました。 TD、PN、および MN が MS を起草しました。 PP-G.、MG、EC、IN による原稿の批判的な改訂。

ミッシェル・ヌンリストへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Chao Ren と他の匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Chao Zhou と Manuel Breuer。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Durand, T.、Paul-Gilloteaux, P.、Gora, M. 他染料を使用しないダイナミックフルフィールド光コヒーレンストモグラフィーによる腸神経系の活動の視覚化。 Commun Biol 6、236 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04593-9

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受信日: 2022 年 8 月 19 日

受理日: 2023 年 2 月 14 日

公開日: 2023 年 3 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04593-9

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色素による腸内神経系の活動の可視化