肝臓から腸への胆汁酸の流れの障害によりマイクロバイオームが明らかになる

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 35 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

現在、腸の生態系の変化が肝疾患の発症に寄与しているという証拠はありますが、関与する複雑なメカニズムはまだ不明です。 私たちは、胆管閉塞の表現型を反映する胆管結紮（BDL）によってマウスに胆汁うっ滞を誘発し、腸への胆汁酸の流れの障害によって引き起こされる腸内細菌叢の変化が肝疾患の病因と進行にどのように寄与するかを理解しました。 BDLを受けたマウスと偽手術（ShamOP）を受けた対照を使用して、縦方向の便、心臓、および肝臓のサンプリングを実行しました。 手術前と術後1日目、3日目、7日目に採取された糞便サンプルを使用したショットガンメタゲノミクスプロファイリングが実行され、心臓血液からのサイトカインおよび臨床化学プロファイル、ならびに肝臓胆汁酸プロファイルが測定されました。 BDL 手術はマウスのマイクロバイオームを再形成し、その結果、ShamOP と比較して非常に異なる特徴が得られました。 マイクロバイオーム経路と EC の分析により、BDL が、炎症性サイトカイン (IL-6、IL-23、MCP- 1)。 これらの肝保護化合物を産生する腸内細菌叢の機能的可能性の低下は、アナエロトランクス属、ブラウティア属、ユーバクテリウム属、ラハノクロストリジウム属などの有益な細菌種の減少、ならびに大腸菌や大腸菌などの疾患関連細菌の増加と関連しています。エンテロコッカス・フェカリス。 私たちの発見は、腸内微生物叢、胆汁酸、肝臓の三角形に関する知識を前進させ、肝臓疾患の潜在的な治療戦略として役立つ可能性があります。

世界的には、肝疾患 (LD) による死亡者数は年間 200 万人以上、つまり全死亡者数の 3.5% を占めており、高齢化が進むにつれてさらに蔓延しています 1,2。 LD の複雑な病因には、肥満、高齢、過度のアルコール摂取など、相互に関連したいくつかの危険因子が含まれます 3。 非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）は、世界中の人口の最大 25% が罹患している最も一般的な慢性肝疾患です4。 これは、代謝機能不全、腸内微生物叢の変化、免疫調節不全に関連する複雑な疾患です5、6、7。 宿主の代謝、腸内微生物叢、免疫系を標的とした NAFLD に対するさまざまな治療アプローチが研究されています 8。 ただし、疾患におけるこれらの要因は複雑に相互作用しているため、これらの要素を調査するには統合的なアプローチが必要です。

腸内微生物叢が NAFLD の発症にさまざまな形で影響を与えることを示唆する証拠が増えています。 腸管バリアの破壊、細菌の転座、および肝臓における炎症反応は、腸内マイクロバイオームが NAFLD および非アルコール性脂肪性肝炎 (NASH) にどのように影響するかについて示唆されているいくつかの潜在的なメカニズムです9。 さらに、NAFLD および NASH 患者は、健常人よりも有意に高い血清一次胆汁酸および二次胆汁酸（BA）を示しました10。 BA は肝疾患における重要な代謝産物です11。 二次 BA 代謝の調節は、腸内細菌叢によって実行される既知の機能の 1 つです。 二次 BA 生産の増加は、タウリンおよびグリシン代謝細菌の増加と関連していました 12,13。 したがって、二次BAの増加はNAFLDを悪化させる可能性があります。

それにもかかわらず、微生物叢は二次 BA を介してファルネソイド X 受容体 (FXR) を調節していることが報告されています 14。 FXR には抗炎症作用があり、胆汁うっ滞、NAFLD、NASH に関連する肝臓の炎症から保護します。 これは、二次 BA であるリトコール酸およびデオキシコール酸によって活性化される可能性があり 15、16、17 、二次 BA が NAFLD の進行に対する保護的な役割も持つことを示唆しています。

サイトカインは、病気を促進する方法と有益な方法の両方で肝疾患の発症に関与しています。 したがって、彼らの役割は依然として議論の余地があります。 たとえば、腫瘍壊死因子-α (TNF-α) は肝臓において二分的な役割を果たします。 細胞死のメディエーターとして作用することに加えて、IL-6 は肝細胞の増殖と肝臓の再生を誘導します 18。一方、IL-6 は肝臓再生促進剤と炎症誘発剤の両方としても作用します 19。 さらに、炎症は疾患段階に応じて NAFLD の発症に悪影響を与える可能性があり、炎症は初期段階では肝損傷の一因となり、後期では病原体感染に対する宿主防御と肝臓再生の重要な推進力となります 20。 最後に、微生物叢は、微生物と免疫細胞の間で直接コミュニケーションを行うのではなく、主にトリプトファン、パルミトレイン酸、短鎖脂肪酸などの一般的な中間メディエーターの放出を通じて、ヒトにおけるサイトカイン産生を調節する可能性がある21,22。

胆汁うっ滞は、肝臓からの胆汁の流れが減少または遮断される状態であり、そのメカニズムに応じて、肝内胆汁うっ滞と肝外胆汁うっ滞に分類されます。 興味深いことに、胆汁うっ滞性肝疾患と NAFLD23 の間では、いくつかの主要な病態生理学的メカニズムが共有されています。 胆管結紮（BDL）は、閉塞性胆汁うっ滞損傷を導入することによりマウスに線維症および肝硬変を誘発する標準的な方法です24。 BDL によって引き起こされる形態学的変化は、ヒトの胆汁性肝硬変で観察されるものと類似しているため、研究者は根底にある病態生理学的メカニズムを研究し、可能な治療法を開発することができます 25。 BDL は胆汁うっ滞性肝疾患モデルですが、前臨床 NAFLD および NASH 研究のツールとしても使用されて成功しています 26、27、28。 最近の研究では、16S rRNA 配列決定を使用して BDL マウスと対照マウス間のマイクロバイオーム分類学的差異が調査され、急性胆汁うっ滞中に肝臓を保護する可能性のある宿主肝臓の遺伝子発現応答に関連する特定の細菌属が提案されています 29。 しかし、このマウスモデル系における腸と肝臓の相互作用の機能メカニズムはほとんど解明されていない。

肝疾患における腸-肝臓免疫軸についての理解を広げるために、BDLおよび偽手術（ShamOP）を施したマウスで糞便と血液の縦断的サンプリングを実施しました。 宿主サイトカイン、肝胆汁酸、生化学マーカーを用いたショットガンメタゲノミクスプロファイルの包括的かつ統合的な分析により、肝臓損傷の重症度を調節する腸内マイクロバイオームの考えられるメカニズムについてのさらなる洞察が得られました。

合計38匹のマウスがBDL（n = 20）およびShamOP（n = 18）を受けるようにランダムに割り当てられました（図1a）。 手術後 1 日目、3 日目、7 日目にマウスを数回に分けて屠殺し、心臓の血液と肝臓のサンプルを採取しました。 心臓血液サンプルからの 8 つの生化学マーカーと 12 のサイトカイン、および肝臓サンプルからの 15 の胆汁酸をプロファイルしました (補足表 1)。 ベースライン（手術前）からマウスを屠殺する前の１日目、３日目、および７日目までのすべての時点で便サンプルを採取した。 BDL によって誘発された肝損傷を確認するために、ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) 画像を検査し、BDL マウスと ShamOP マウスの生化学的、炎症性、および胆汁酸プロファイルを比較しました。 H&E染色による肝組織の組織病理学的検査により、BDLグループにおけるBDL手術の成功が確認されました（補足図1）。 また、BDL マウスでは肝臓全体の胆汁酸濃度が大幅に増加し、予想どおり胆汁の流れが遮断されたことが示唆されました（補足図 2、一般化線形モデル、P 値 < 0.05）。 アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASAT）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALAT）、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（GGT）、トリグリセリド（TG）などの肝損傷に関連する血清マーカーが、ShamOP マウスと比較して BDL で有意に高いことが観察されました（補足図）。 .2、一般化線形モデル、P 値 < 0.05)。 ASAT と ALAT のレベルは、2 つの研究グループ間で最も大きな差を示しました。 我々の分析では、炎症性サイトカイン IL-23、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-17A、GM-CSF、および IFN-β が BDL マウスで有意に増加していることも示されました。 対照的に、IFN-γは大幅に減少しました（図1bおよび補足図2、一般化線形モデル、P値<0.05）。 TNF-α、MCP-1、およびIL-6は、BDLマウスとShamOPマウスの間で上位の差次的サイトカインであり、ALATおよびASATと有意に正の相関がありました（図1c、スピアマン相関、P値<0.05）。

a 研究設計、データ収集、およびデータ生成手順の図解。 b BDL マウスと ShamOP マウスの間で有意に異なるサイトカインの箱ひげ図 (P 値 < 0.05)。 中心線はデータの中央値を示し、ボックスの境界は四分位範囲を表し、ひげは外れ値を除いたデータの範囲を示します。 c すべての時点 (1 日目、3 日目、7 日目) のデータを使用した、大幅に異なるサイトカインと大幅に異なる生化学マーカー間の相関。 相関の有意性はアスタリスク記号で示され、単一のアスタリスク (*) は P 値 < 0.1 を示し、二重アスタリスク (**) は P 値 < 0.05 を示します。

BDL マウスと ShamOP マウスの腸内微生物叢の構造は、すべての糞便サンプルのショットガン メタゲノミクス シーケンスによって評価されました。 合計で 110 個の便サンプルを処理し、サンプルあたり平均 46,689,954 個の高品質リードで 770.4 ギガ塩基ペアの配列を決定しました。 分類学的プロファイリング 30 に mOTU を使用して、60 属と 418 種を特定しました。 Chao1、Shannon、および Simpson のアルファ多様性指数は、比較のためにすべての時点のサンプルを使用した場合、BDL マウスと ShamOP マウスの間に有意差を示しませんでした (補足表 2、線形混合モデル、P 値 > 0.05)。 ブレイとカーティスの距離は、グループ間およびグループ内のベータ多様性を比較するために計算されました。 ベースラインでの BDL と ShamOP 間の属および種レベルでのベータ多様性には有意差はありませんでした (PERMANOVA、P 値 > 0.05)。 ただし、1日目、3日目、および7日目に2つのマウスグループを比較すると、有意な差がありました（3日目に統計的有意性に達しなかった属レベルを除く）（補足表2、PERMANOVA、P値<0.05） ）。 特に、BDL 0 日目と BDL 1 日目、および ShamOP 0 日目と ShamOP 1 日目を比較すると、属レベルと種レベルの両方で有意差が検出され、操作に関係なく、腹部切開が微生物叢の変化を促進する可能性があることを示唆しています。胆道系の。 属と種の両方の組成は、BDLマウスでは3日目と7日目に有意に変化し続けましたが（PERMANOVA、P <0.05）、ShamOPマウスでは変化しませんでした（PERMANOVA、P値> 0.05）（図2a、b）。

a 属および b 種レベルでの、0 日目、1 日目、3 日目、および 7 日目の腸内マイクロバイオーム存在量プロファイル間のブレイ・カーティス非類似性の主座標分析 (PCoA)。 c 有意差を持って豊富な属および種のヒートマップ (線形モデル、FDR < 0.1)。 細胞の色は、正規化された存在量の方向と大きさを示します。 横の箱ひげ図は、選択されたいくつかの分類群の豊富さを示しています。 中心線はデータの中央値を示し、ボックスの境界は四分位範囲を表し、ひげは外れ値を除いたデータの範囲を示します。 箱ひげ図内の点の色と形状は、治療の種類とサンプル収集の日数を示します。

各サンプリング日のマイクロバイオームの分類学的プロファイル（ベースラインに正規化、方法で詳細）を分析することにより、BDL マウスと ShamOP マウスの間で存在量が大幅に異なる 19 属（正確な属の注釈を持つ 12 属）が見つかりました（図 2c および補足表） 3、線形モデル、FDR < 0.05)。 19 の重要な属のうち、BDL グループでは 9 属が濃縮され、ShamOP マウスでは 10 属が濃縮されました。 Escherichia および Eubacterium は、BDL および ShamOP マウスで最も多く濃縮された属でした (手術後 3 日間の正規化された存在量の平均 = それぞれ 5.23 および 2.22) (補足表 3)。 エシェリヒア属以外に、正確な属注釈が付いた属を特に調べたところ、以前にマウスとヒトの研究で腸球菌とプレボテラ属を含む 5 つの属が ShamOP マウス (線形モデル、FDR < 0.05) と比較して BDL の相対存在量が有意に高かった。肝疾患または炎症31、32。 対照的に、ShamOP マウスで大幅に濃縮された 6 属には、アナエロトランカス、ブラウティア、ユーバクテリウム、ラクノクロストリジウムなどの既知の酪酸生成細菌が含まれていました (線形モデル、FDR < 0.05)33,34。 いくつかの属では、相対存在量の変化に明らかな傾向が見られました。 たとえば、BDL マウスでは、Anerotrucus の相対存在量は、手術後 7 日目まで減少し続けました (図 2c および補足表 3)。

種レベルでは、合計 128 種（正確な種の注釈を持つ 16 種）で、BDL マウスと ShamOP マウスの間で存在量が大きく異なることがわかりました（図 2c および補足表 4、線形モデル、FDR < 0.05）。 これらの種のうち、22 種と 106 種がそれぞれ BDL マウスと ShamOP マウスに著しく濃縮されていることが判明しました。 BDL マウスでは大腸菌とエンテロコッカス フェカリスが最も多く含まれていました (手術後 3 日間の正規化された存在量の平均 = それぞれ 5.24 と 4.26)。 クロストリジウム目およびラクノスピラ科に属する種は、ShamOP マウスで最も多く濃縮された種でした (手術後 3 日間の正規化された存在量の平均 = それぞれ 3.35 および 3.33) (補足表 4)。 いくつかの大きく異なる種が肝疾患の発症と負または正の関連があることが報告されています。 進行した線維症を伴う NAFLD 患者では大腸菌の存在量の増加が観察され、炎症促進活性に寄与している可能性があります 35。 Enterococcus faecalis はマウスのアルコール性肝炎を悪化させることが報告されています 36。 マウスの研究では、対照群と比較してアルコール性脂肪肝疾患（AFLD）群ではバクテロイダル目の細菌がより多く存在することが明らかになりました37。 また、私たちの研究では、バクテロイダル目種は、ShamOPマウスと比較してBDLが高かった（図2cおよび補足表4）。

一方、ラクノスピラ科細菌 A2、ラクノスピラ科細菌 A4、およびアナエロトランカス sp G3 (2012) などの酪酸生成細菌は、ShamOP マウスで有意に高かった (図 2c、線形モデル、FDR < 0.05)11。 ラクノスピラ科細菌 A2 は、BDL マウスでは術後 3 日すべてで相対存在量の大幅な減少を示しましたが、ShamOP マウスではその相対存在量は変化しませんでした。 Oscillibacter 属に属する細菌は、NAFLD38 患者よりも健康な人に多く存在することが報告されています。 それどころか、オシリバクターは非糖尿病の肥満女性の脂肪肝と関連していることも報告されています39。 この属のメンバーであるオシリバクター sp 1-3 は、BDL マウスと比較して ShamOP でより豊富に見つかりました (線形モデル、FDR < 0.05)。 しかし、BDL マウスではその相対存在量が継続的に減少しました。 興味深いことに、別の有益な細菌種、Parabacteroides goldsteinii は、高脂肪食誘発性肥満において抗炎症特性を示し 40、ShamOP マウスと比較して BDL においてより高い相対存在量で見つかりました (線形モデル、FDR < 0.05)。

要約すると、ShamOP マウスとのベータ多様性の比較によって示されるように、BDL は腸管コミュニティ構造に重大な変化を引き起こしました。 さらに、既知の酪酸生成物質の減少と主に肝疾患に関連する細菌の増加によって証明されるように、多くの種が腸内の胆汁酸の流れの遮断の影響を受けました。

ここで適用された糞便サンプルのショットガン メタゲノミクス分析により、その後、2 つのマウス グループの微生物群集の経路と酵素プロファイルに注釈を付けることができました。 HUMAnN341 を使用して、392 の経路と 1790 の EC を特定しました。 経路プロファイルの分析により、マイクロバイオーム構成だけでなく、コミュニティの機能プロファイルも変化させる BDL の影響が明らかになりました。 分類とは対照的に、Shannon、Simpson、および Chao1 指数として測定された BDL マウスと ShamOP マウスの間の群集アルファ多様性を比較した場合、機能レベルで有意な差が観察されました (線形混合モデル、P 値 < 0.05、補足)表5）。 さらに、すべての時点からサンプルをプールした BDL グループと ShamOP グループの間の経路プロファイルのベータ多様性は有意に異なりました (PERMANOVA、P 値 < 0.05)。 BDL マウスと ShamOP マウスの両方で、経路組成はベースラインから手術後 1 日目までに大幅に変化しました (PERMANOVA、P 値 < 0.05)。 同様に、微生物叢の分類学的プロファイルにおいて、我々の結果は、腹部切開が微生物叢の機能的可能性にも変化を引き起こす可能性があることを示唆しています。 これらの有意な変化は、BDL マウスでは 3 日目まで続きましたが (PERMANOVA、P 値 < 0.05)、ShamOP マウスではそうではありませんでした (PERMANOVA、P 値 > 0.05)。 BDL マウスでは、分類組成は 3 日目から 7 日目まで大幅に変化し続けましたが（図 2a、b）、コミュニティ機能プロファイルは従わませんでした（補足表 5、PERMANOVA、P 値 > 0.05）。

経路と酵素の量をベースラインに対して正規化し、BDL マウスと ShamOP マウスの機能プロファイルを比較しました。 我々は、195 の機能的経路と 762 の EC が、手術後の BDL マウスと ShamOP マウスの間で相対存在量において有意に異なることを観察しました (図 3、線形モデル、FDR < 0.05)。 BDL マウスと ShamOP マウスでは、それぞれ 139 および 56 の経路と 483 および 279 の遺伝子が濃縮されました (補足表 6 および 7)。 ビオチン生合成経路 (PWY-5005) は、BDL マウス (線形モデル、FDR < 0.05) では相対存在量が著しく低く、これに関与する酵素 6-カルボキシヘキサン酸 – CoA リガーゼ (EC 6.2.1.14) をコードする遺伝子ビオチン生合成経路における、BDL マウスでは有意に低かった (線形モデル、FDR < 0.05)。 ビオチンは糖尿病マウスの肝臓における肝毒性と酸化ストレスを軽減し、ヒトの研究ではビオチン欠乏により炎症誘発性サイトカインの分泌が亢進します42。 2つの分岐鎖アミノ酸（BCAA）、イソロイシンとバリン（ILEUSYN-PWYおよびVALSYN-PWY）の生合成経路は、BDLマウスと比較してShamOPマウスで有意に高かった（図3aおよび補足表6、線形モデル、FDR） < 0.05)。 NAFLD患者では、病気が進行するにつれてイソロイシンとバリンのレベルが増加していることが判明しました43。 しかし、イソロイシンとバリンは、NAFLD の初期段階で肝臓の脂肪蓄積を軽減し、マウスの急性肝損傷を予防し、進行した肝硬変患者の免疫機能を回復する可能性があることも報告されています 44,45。 イソロイシンおよびバリンの生合成に寄与するいくつかの EC は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ (NADP+) (EC 1.1.1.86)、アセト乳酸シンターゼなど、ShamOP マウスで有意に高い存在量を示しました (図 3b および補足表 7、線形モデル、FDR < 0.05)。 (EC 2.2.1.6)、およびジヒドロキシ酸デヒドラターゼ (EC 4.2.1.9)。 アルギニンの生合成経路（ARGSYN-PWYおよびARGSYNBSUB-PWY）も、ShamOPマウスの方が有意に高かった（図3a、線形モデル、FDR < 0.05）。 マウスの研究では、アルギニンと胆汁酸の複合体が NAFLD46 の治療法となる可能性があることが示唆されました。 NAFLD47で肝保護効果のある化合物であるオルニチン（GLUTORN-PWY）を生成する微生物の機能的潜在力も、BDLマウスでは有意に低かった（図3a、線形モデル、FDR < 0.05）。 さらに、スペルミジンは急性肝損傷を軽減し 48、スペルミジン生合成経路（PWY-6834）は、ShamOP マウスと比較して BDL マウスで有意に低かった（図 3a、線形モデル、FDR < 0.05）。 この経路は、BDL マウスでは明らかな減少傾向が見られましたが、ShamOP マウスでは、その相対的な存在量は術後期間中にわずかに変動するだけでした。 スペルミジン生合成経路内では、2つのECであるN1-アミンプロピルラグマチンウレオヒドロラーゼ（EC 3.5.3.24）とアデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ（EC 4.1.1.50）は、BDLマウスと比較してShamOPマウスで有意に高かった（図3bおよび補足表7線形モデル、FDR<） 0.05）。 損傷した肝臓の回復を促進するアラニンを生成するタウリン - ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ (EC 2.6.1.77) をコードする遺伝子 49 も、ShamOP マウスで有意に高かった (図 3b、線形モデル、FDR < 0.05)。 さらに、BDL マウスにおけるペプチドグリカン生合成経路 (PWY-5265) の相対存在量は ShamOP マウスよりも有意に高かった (補足表 6、線形モデル、FDR < 0.05)。一方、ペプチドグリカンは炎症促進因子であり、炎症を誘発することが判明しました。脂肪性肝炎の進行50． ペプチドグリカン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子である EC 2.3.2.17 は、BDL マウスで有意に高かった (補足表 7、線形モデル、FDR < 0.05)。

BDL と ShamOP の 2 つのグループにおける差次的な a 経路と b EC 倍率変化プロファイルを示すボルケーノ プロット。 水平破線は、FDR 0.05 での -log10 調整後の P 値を表します (線形モデル)。 本文で説明するいくつかの経路と EC は箱ひげ図として示されており、その中の中心線はデータの中央値を示し、箱の境界は四分位範囲を表し、ひげは外れ値を除いたデータの範囲を示します。

それどころか、メナキノンの生合成経路（PWY-5838、PWY-5840、PWY-5861、PWY-5897、およびPWY-5899）は、ShamOPマウスと比較してBDLマウスで有意に高い相対存在量を示しました（図3aおよび補足）。表 6 線形モデル、FDR < 0.05)。 さらに、線維症のある NAFLD 患者は、線維症のない NAFLD 患者よりも細菌性メナキノン産生の可能性が高いことが報告されています 51。 最後になりましたが、胆汁酸の流れを制限することが腸内微生物叢の酪酸生成能力に影響を与えるかどうかを調査しました。 分類レベルでは酪酸生産者の存在量に大きな違いがあることがわかりましたが、データセット内の酪酸生産経路 (PWY-5022、PWY-5676、P162-PWY、および CENTFERM-PWY) にはいずれも有意な違いはありませんでした。 2 つの研究グループ間の相対存在量 (補足表 6、線形モデル、P 値 = 0.16-1)。 しかし、これらの酪酸生成経路に関与する 2 つの EC、酪酸キナーゼ (EC 2.7.2.7) および 3-ヒドロキシブチリル-CoA デヒドラターゼ (EC 4.2.1.55) の相対存在量は、ShamOP マウスと比較して BDL マウスでは有意に低かった (図.3b、線形モデル、FDR < 0.05)。

全体として、BDL マウスのマイクロバイオームの機能的可能性は、抗炎症化合物および肝保護化合物 (ビオチン、イソロイシン、バリン、オルニチン、アルギニン、およびスペルミジン) の産生の減少やメナキノンの産生の増加など、大きな影響を受けました。 さらに、酪酸生合成に関与する特定の EC も BDL マウスで減少していることがわかりました。

次に、BDLによって誘発される腸内マイクロバイオームの再形成がサイトカインプロファイルとどのように関連しているかを研究しようとしました。 どの分類群と機能が測定されたサイトカインのレベルの違いに関連しているかを決定するために、サイトカインプロファイル、機能プロファイル、および分類プロファイルの間の三元相関分析を実行しました。 どの分類群/機能が胆汁酸の流れを制限した際に肝損傷に寄与する可能性があるかを判断するために、ベースライン値に正規化した後、BDL グループとシャム OP グループの間で存在量が大きく異なるサイトカイン、属、種、経路、および EC に焦点を当てました (一般化線形モデルまたは線形モデル、FDR < 0.05)。

図 4 に示すように、BDL マウスでより低いことが判明した酪酸生成属 Anaerotruncus、Blautia、Eubacterium、および Lachnolostridium は、ビオチン (PWY-5005) の生合成経路と有意に正の相関関係がありました (スピアマン相関、P 値 < 0.05)。 ）、これもBDLマウスでは有意に低かった。 これらの酪酸生成属の 2 種、Eubacterium sp. 14-2 および Anerotrucus sp. G3 (2012) もこの生合成経路と有意に正の相関がありました。 対照的に、BDL マウスで高値を示した 2 つの属、Enterococcus と Prevotella、および BDL マウスで高値を示した 2 つの種、Enterococcus faecalis と Bacteroidales 細菌 M14 は、ビオチン生成経路と有意な負の相関を示しました (図 4、スピアマン相関) 、P 値 < 0.05)。 さらに、ビオチンを合成する微生物叢の機能的潜在力は、炎症誘発性サイトカイン IL-6 および IL-23 と有意に負の相関がありました (図 4、スピアマン相関、P 値 < 0.05)。 IL-6 レベルが高いと NAFLD52 のリスクが高まることが判明し、NASH 患者では IL-23 が上昇し、NAFLD53 における脂肪肝および炎症促進反応と間接的に関連していることが示唆されました。

示されている属と種は、BDL マウスと ShamOP マウスの間で大きく異なります (線形モデル、FDR < 0.05)。 示された経路は、ShamOP マウスと比較して BDL マウスでは大きく異なります (線形モデル、FDR < 0.05)。 示されている EC は重要な経路の一部であり、ShamOP マウスと比較して BDL では大幅に変化しています。 有意な分類群 (線形モデル、FDR < 0.05) およびサイトカイン (一般化線形モデル、FDR < 0.05) と少なくとも 1 つの有意な相関関係 (スピアマン相関、P 値 < 0.05) を持たない経路は削除されました。 相関の有意性はアスタリスク記号で示され、単一のアスタリスク (*) は P 値 < 0.1 を示し、二重アスタリスク (**) は P 値 < 0.05 を示します。

Anaerotruncus、Blautia、Eubacterium、および Lachnolostridium も、2 つのアミノ酸、オルニチンおよびアルギニン (GLUTORN-PWY および ARGSYNBSUB-PWY) の腸内微生物叢の生合成と正の相関関係を示しました (図 4、スピアマン相関、P 値 < 0.05)。 これら 2 つの生合成経路は BDL マウスでは低く、ユーバクテリウム属の菌とも強く正に関連していました。 14-2 および Anerotrucus sp. G3 (2012)。 逆に、オルニチン生産経路とプレボテラ、およびアルギニンとエンテロコッカスの生合成経路との間には、有意な負の相関関係が示されました（図 4、スピアマン相関、P 値 < 0.05）。 BDL マウスでより多く検出されたバクテロイダル目細菌 (バクテロイダレス細菌 M10、バクテロイダル細菌 M11、バクテロイダル細菌 M12、およびバクテロイダル細菌 M14) は、2 つのアミノ酸生合成経路と負の相関がありました (図 4、スピアマン相関、P 値 < 0.05)。 ）。 さらに、オルニチンおよびアルギニンの生合成経路は、脂肪肝および線維症に寄与するサイトカインである MCP-1 と負の相関がありました 54,55。

さらに、スペルミジン（PWY-6834）を合成する微生物叢の機能的能力が、アナエロトランクス、ブラウティア、ユーバクテリウム、およびラクノロストリジウムと有意に正の相関があることを発見しました（図4、スピアマン相関、P値<0.05）。 一方、スペルミジン生合成経路はBDLマウスでは低かった。 BDL マウスでは低位の 2 種、Anaerotruncus sp. G3 (2012) およびラクノスピラ科細菌 A2 も、スペルミジン生産経路と正の相関関係がありました。 一方、Enterococcus、Prevotella、Bacteroidales 細菌 M11、および Bacteroidales 細菌 M14 は、この経路と負の相関を示しました (図 4、Spearman 相関、P 値 < 0.05)。 さらに、スペルミジン生合成経路は、IFN-ベータおよび MCP-1 と負の相関がありました (図 4、スピアマン相関、P 値 < 0.05)。

また、BDL マウスではイソロイシンとバリンの生成経路 (ILEUSYN-PWY および VALSYN-PWY) のレベルが低いことも観察されました。 これらの経路は、ラクノロストリジウム属およびユーバクテリウム属と正の相関がありました。 14-2 に示され、バクテロイダレス細菌 M10、バクテロイダレス細菌 M11、およびバクテロイダレス細菌 M12 と負の相関がありました (図 4、スピアマン相関、P 値 < 0.05)。 さらに、炎症促進性サイトカイン IL-6 および MCP-1 は、イソロイシンおよびバリンを合成する微生物叢の機能的潜在力と有意な負の相関を示しました (図 4、スピアマン相関、P 値 < 0.05)。

さらに、微生物叢（PWY-5840、PWY 5899、PWY-5897、PWY-5861、および PWY-5838 を含む）のメナキノン生合成は、BDL でより高いことが判明し、BDL で最も豊富な 2 種と有意な正の相関があることが判明しました。 BDL、大腸菌、および大腸菌。 これらの生合成経路は、Eubacterium sp.と負の相関があった。 14-2 およびオシリバクター sp. 1-3 (図 4、スピアマン相関、P 値 < 0.05)。 GM-CSF、IFN-β、IL-23、IL-6、MCP-1、および TNF-α は、メナキノンを生成する微生物叢の機能的能力と強い正の関連性を持っています (図 4、スピアマン相関、P 値) < 0.05)。

私たちの分析では、宿主の炎症状態と腸内微生物叢との関連性を調査し、胆汁酸の腸内への流入が停止した場合の肝臓損傷における腸内微生物叢の寄与について考えられるメカニズムをいくつか浮き彫りにしました。 BDLによって引き起こされる分類学的変化は、有益な化合物（ビオチン、オルニチン、アルギニン、スペルミジン、イソロイシン、バリン）の生合成の減少と腸内でのメナキノン産生の増加に関連しており、これが炎症促進性サイトカインの促進につながりました（肝障害マーカー (ALAT や ASAT など) との相関関係で示されるように、肝障害が悪化しました。

腸 - 肝臓軸は腸で構成され、血流のおよそ 70 ～ 75% が肝臓に供給されます 56。 肝臓は免疫系の重要な構成要素であり、腸微小環境と宿主の代謝の間の伝達の中心として機能します。 その結果、肝臓は多数の細菌成分、代謝産物、マイクロバイオーム由来のシグナルにさらされることになります。 最近の研究によると、胆汁酸は腸と肝臓の間のクロストークを媒介する多面的なシグナル伝達分子として機能します57,58。 胆汁酸と腸内細菌叢の間の複雑な相互作用（相互依存性と阻害が関与する）は、哺乳類の恒常性を維持するために重要です。 結合していない胆汁酸は、細胞膜全体の pH 差のバランスを保つことができます。 細胞膜の損傷は、プロトンポンプによる生体エネルギーの欠如によって直接生じる可能性があります。 胆汁酸は最終的に一部の細菌の増殖を防ぎ、腸内マイクロバイオームの発達に関与します59。 同時に、胆汁酸は肝臓と腸の間の双方向制御に必須の分子であり、2 つのシグナル伝達経路が胆汁酸を活性化します。 シグナル伝達分子は、脂肪肝と炎症反応を調節する G タンパク質共役胆汁酸受容体 1 (GPBAR1 または TGR5) に結合し、FXR の発現を活性化します。 これはエネルギー代謝のバランスを制御し、脂肪肝と炎症反応を制御し、腸管の組成に影響を与えます。 その結果、肝疾患の病態生理学は、腸内微生物叢によるシグナル伝達分子としての胆汁酸の使用によって影響を受ける可能性があります12、60、61、62。 新しい治療法は、肝臓疾患におけるさまざまなシグナル伝達経路における腸内微生物叢と胆汁酸の作用領域の正確な理解に基づいている可能性があります。

腸内細菌叢、胆汁酸、肝疾患の相互作用に関与する分子機構を調べる必要性は、無菌 (GF) マウスとシェドラーフローラの変化に対して BDL を行った最近のマウス研究 29 によってさらに強調されました。 -定着したマウス。 急性胆汁うっ滞は、腸内細菌量が限られているマウスと比較して、GFにおいてより重度の肝損傷を誘発したが、これは著者らが示したように、組織修復や肝保護効果を伴ういくつかの代謝機能や免疫機能に関与する肝臓遺伝子発現の変化と関連していた。 それにもかかわらず、個々の微生物種の役割と、肝臓損傷を調節する微生物誘発性の差異の機能機構は不明のままであった。 このギャップを埋め、肝損傷の軽減に有益である可能性のある標的腸内細菌叢の改変を示唆するために、我々はここで、BDLマウスモデルとShamOPマウスにおいて縦断サンプリングによるショットガンメタゲノミクスシーケンスを実行した。 さらに、肝臓から腸への胆汁酸の停止に応答した微生物種の組成と生合成能力の変化が生化学的および炎症プロファイルとどのように関連しているかを調査しました。

BDL 手術によりマウスのマイクロバイオームが再形成され、その結果 ShamOP コントロールと比較して非常に異なる特徴が得られました。 分類学と同様に、腹部切開により BDL マウスと ShamOP マウスの両方のマイクロバイオームの機能的能力が変化しましたが、その変化は BDL マウスでのみ維持されました。 経路とECの我々の分析により、急性肝損傷時の病因における微生物叢の機能的役割が明らかになりました。 BDL は、腸内でのビオチン、スペルミジン、アルギニン、オルニチン、イソロイシン、バリンなどの肝保護化合物の産生を減少させます 42、44、45、46、48、63。 BDL は細菌のメナキノン生成を誘導します。 慢性肝線維症に重要な役割を果たすビタミンK依存性タンパク質を促進することにより、肝臓への損傷を増加させる可能性があります64。 BDL マウスでは酪酸生成のための EC の量が大幅に減少しており、腸内の酪酸レベルを再び安定に保つ胆汁酸の役割の可能性が示唆されています 65。 いくつかの肝保護化合物（ビオチン、オルニチン、アルギニン、スペルミジン、イソロイシン、バリン）を生成する腸内細菌叢の機能的可能性の低下は、有益な細菌であるアナエロトランクス、ブラウティア、ユーバクテリウム、ラクノクロストリジウムの減少と有害な細菌の増加に関連しています。肝疾患における細菌（大腸菌、大腸菌、バクテロイダル種）。 これらの化合物の生合成は、NAFLD52、53、54、55 における脂肪肝および線維症に関連する炎症性サイトカイン (IL-6、IL-23、および MCP-1) と負の相関がありました。 対照的に、BDL マウスの腸内マイクロバイオームにおけるメナキノン産生の増加は、大腸菌および大腸菌の増加と酪酸産生細菌の減少に関連しています。 メナキノン産生は、炎症性サイトカイン (GM-CSF、IFN-β、IL-23、IL-6、MCP-1、および TNF-α) と正の相関がありました。 これらの結果は、サイトカインプロファイルと腸内微生物叢との関連を強調し、腸内微生物叢が炎症や肝損傷に寄与する潜在的なメカニズムを明らかにしています。

Gergiev らによると、BDL によって引き起こされる損傷のほとんどは最初の 5 ～ 7 日以内に発生し、急性炎症過程は 3 日目まで観察され、顕著な胆管増殖は 566 日目以降に見られます。 修復機構と胆管増殖2週目で分子の適応を決定し、マイクロバイオームに影響を与える部分的な胆汁の流れを回復します。 したがって、後期の時点での胆汁流の回復によって引き起こされる潜在的な偏りを回避するために、本研究では手術後の初期（1、3、7日目）に焦点を当てました。 さらに、私たちの研究には限界もあります。 長期的なサンプリングは 7 日間続きましたが、BDL によって引き起こされるより重度の肝損傷 (肝線維症) が完全に進行するまでには 20 日かかります 24。 私たちは初期段階での肝臓損傷の発症における腸内マイクロバイオームの役割を調べることしかできませんでした。 個々の細菌種の構成とそれぞれの機能は、病気が進行するにつれて変化し続け、異なるパターンを示す可能性があります。 この研究で観察された変化は、BDL および肝損傷の発症の初期影響に寄与している可能性がありますが、重度の肝疾患には直接関係していない可能性があります。 研究の最初の7日間における腸内細菌叢および生化学における胆汁うっ滞関連およびBA依存性の変化は、前駆体として機能し、より重篤な肝臓の状態に関連する変化を促進する可能性がある。 今後の研究では、進行中の線維形成中の腸内細菌叢の寄与の完全な概要を提供するために、実験を少なくとも20日間延長する可能性があります。 また、ヒトとマウスの胆汁酸プールの間にはいくつかの違いがあり、それが我々の発見のヒトへの応用を制限する可能性があります。 胆汁酸組成はマウスとヒトでは異なり、マウスでは親水性6-ヒドロキシル化ムリコール酸がBAプールの半分を占めます。 さらに、胆汁うっ滞はマウスとヒトではBA産生に異なる影響を及ぼし、マウスではBDLがBA合成を増加させるのに対し、ヒトでは胆汁うっ滞によりBA合成が減少します67,68。 将来の研究では、ヒト化マウスモデルを使用してこれらの制限に対処し、胆汁酸、腸内微生物叢、および人間の健康の間の関連性についての理解を向上させる可能性があります。

それにもかかわらず、我々の結果全体としては、代謝、腸内マイクロバイオーム、および肝臓の炎症、さらには進行中の線維形成における肝臓から腸への胆汁酸の流れの障害における腸内微生物叢の寄与とその潜在的な分子機構が明らかになった。免疫系。 私たちの発見はまた、肝臓と腸内微生物叢の間の免疫軸の基礎としての胆汁酸の役割と、潜在的な治療標的としての胆汁酸の最適利用についての知識を前進させます。

この研究におけるすべての実験動物手順は、独立倫理諮問委員会を通じて評価され、ライセンス UKJ-19-010 に基づくヨーロッパおよびドイツの法律および規制に従って、チューリンゲン州地方自治体当局 (Thüringer Landesverwaltungsamt) によって承認されました。 すべての実験では、雄および雌の FVB/NRj マウス (Janvier Laboratory、フランス) を特定の病原体のない条件下で飼育し、イエナ大学病院 (ドイツ) の動物施設で飼育しました。 すべての動物には、Altromin 社の LASQ 食餌 (Rod 16、Auto) が与えられました。これは、穀物、野菜副産物、ミネラル、油、脂肪、酵母で構成され、マウスに粗タンパク質 16.9%、粗タンパク質 4.3% の粗栄養素を提供しました。脂肪、粗繊維 4.3%、粗灰分 7.0%。

すべての動物の体重を測定し、スコアを付け、1 日前と 1 時間前に 1 mg kg-1 体重 (BW)-1 メロキシカム (メロキシカム、CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH、ブルクドルフ、ドイツ、0.5 mg mL-1 経口懸濁液) を経口投与しました。手術。 手術前の準備、麻酔下での手術手順（イソフルラン、CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH、ブルクドルフ、ドイツ、100 mL min-1 O2 流吸入で 1.5 ～ 3%）、および手術後の治療については、以前に説明されています 24,69。 胆管を、2つのプレカット6-0編組絹縫合糸(Teleflex Medical GmbH、Fellbach、ドイツ、事前に滅菌し、70%エタノールに浸したもの)で結紮した(BDLグループ)。 対照的に、偽手術グループ（ShamOP）は、胆管結紮を除いて同じ外科手術を受けました。 その後、腹部の層を閉じ、4-0 抗菌性縫合糸 (Johnson & Johnson Medical GmbH Ethicon、ノルダーシュテット、ドイツ、事前に取り付けられた 17 mm 1/2c RB-1 plus 針を備えた Vicryl Plus) で縫合しました。 2 ～ 4 μg g-1 BW-1 ブピバカイン溶液 (PUREN Pharma GmbH、ドイツ、ミュンヘン、2.5 mg mL-1) を縫合中に切開内注射として投与すると、術後の鎮痛が強化されました。 手術後、動物の体重を再度測定し、20 μL g-1 BW-1 酢酸リンガー (Berlin Chemie AG、ベルリン、ドイツ) を皮下投与しました。 動物は、加温ランプの下で水と柔らかい餌を自由に摂取できる単一のケージで別々に回復しました。 胆汁うっ滞は、手術後約 12 時間で尿の変色および足または角膜の黄変として BDL 群のすべての動物に現れました (ただし、ShamOP 群ではそうではありません)。 動物は 1、3、または 7 日間追跡調査されました。 体重は朝と夕方に測定しました。 すべての動物は、体重がほぼ手術前のレベルになるまで、1日2回輸液蘇生を受けた。 さらに、経口鎮痛とスコアリングは 1 日 3 回処理されました。

手術の 1 時間前と手術後 1、3、7 日目に新鮮な便を採取しました。 便を滅菌ピンセットで拾い、2 mL マイクロチューブに移し、微生物 DNA 抽出のために液体窒素中で直ちに凍結しました。

実験の終了時（手術後 1、3、または 7 日後）に、キシラジン（Rompun、Bayer Vital GmbH、レバークーゼン、ドイツ、80 mg kg-1 BW-1）およびケタミン（ bela-pharm GmbH、Vechta、ドイツ、500 mg kg−1 BW−1）。 動物が外科的耐性に達した後、腹部を開いて、最終的な心臓穿刺を介して、24 G 針に接続された滅菌 1 mL EDTA シリンジに心臓血液を採取しました。 その後、肝臓と脾臓を摘出し、液体窒素で凍結し、さらなる分析のためにマイクロチューブに入れて -80 °C で保存しました。

心臓血液を室温 (RT) で 15,000 × g で 15 分間遠心分離し、血漿を得ました。 次に、各動物からの血漿 25 μL を LEGENDplex マウス炎症パネル (13 プレックス) (BioL​​egend、ドイツ、コブレンツ、#740150) で処理して、13 種類の炎症性サイトカインの濃度を定量しました。 LEGENDplex マウス炎症パネルは、さまざまな前方散乱と蛍光に基づいて特定される特定のサイトカインを定量化するサイトカイン ビーズ アレイです。 アッセイは、製造業者によってこのアッセイについて検証された、BD Accuri C6 Plus フローサイトメーター (BD Bioscience、ハイデルベルク、ドイツ) で測定して実施されました。 その結果、IL-23、IL-1α、IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-1β、IL-6、IL-27、IL-17A、IFN-β、GM-CSF、および抗-炎症性サイトカイン IL-12p70 および IL-10 はフローサイトメトリーによって同定され、標準曲線に対して定量化されました。 データ分析は、BioLegend が提供するロットおよびアッセイ固有の校正済みオンライン分析ツールを使用して、メーカーのプロトコルに従って実行されました。 さまざまなビーズのゲーティング戦略はメーカー固有であり、サイトカイン ビーズ アレイ キットに付属しています。

LC-MS/MS 定量法を使用して、単離された肝細胞で 15 種類の胆汁酸の濃度を測定しました: タウロコール酸 (TCA)、グリココール酸 (GCA)、グリコケノデオキシコール酸 (GCDCA)、タウロケノデオキシコール酸 (TCDCA)、タウロリトコール酸 (TLCA)、グリコリトコール酸 (GLCA)、タウロデオキシコール酸 (TDCA)、グリコデオキシコール酸 (GDCA)、コール酸 (CA)、ケノデオキシコール酸 (CDCA)、ウルソデオキシコール酸 (UDCA)、デオキシコール酸 (DCA)、タウロウルソデオキシコール酸 (TUDCA)、グリコールソデオキシコール酸(GUDCA)、およびリトコール酸 (LCA)。 事前に秤量したサンプルを 3 倍 (w/v) エタノール - リン酸緩衝液 (15% 0.01 mol/L リン酸緩衝液 pH 7.5、85% エタノール) と混合し、続いてペブルミル (QiaShredder) で均質化ステップを実行しました。遠心分離ステップ (5 分、16,000 × g)。 270 μL の 85% メタノール水溶液を、Thomson Single Step® Filter Vial (PES 膜 0.2 μM、Thomson Instrument Company、California) 内のサンプル上清 30 μL に加えました。 この溶液を 20 秒間混合し、200 × g で 1 分間遠心分離し、濾過してオートサンプラーに置きました。 エレクトロスプレー イオン化源を備えた API 4000 トリプル四重極質量分析計 (AB Sciex、ダルムシュタット、ドイツ) に接続された CTC-PAL オートサンプラーを備えた Agilent 1200 高速液体クロマトグラフィー (HPLC) システム (Agilent Technologies GmbH、ベーブリンゲン、ドイツ) を使用しました。全体を通して。 すべてのクロマトグラフィー分離は、ガード カラム (C18、4 × 3 mm、Phenomenex、アシャッフェンブルク、ドイツ) を備えた逆相 Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 (3.5 µm、100 × 3 mm) 分析カラムを使用して実行されました。 移動相は水 (A) とメタノール (B) で構成され、0.012% ギ酸と 5 mM 酢酸アンモニウムを含み、総流量は 300 μL min-1 でした。

イエナ大学病院の日常臨床検査では、アルブミン、アスパラギン酸トランスアミナーゼ (ASAT)、アラニン トランスアミナーゼ (ALAT)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ (GLDH、GDH)、ガンマ-グルタミルトランスフェラーゼ (ガンマ-GT)、トリグリセリド、乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH) の 8 つの生化学マーカーを定量しました。 、血漿が残っている場合はアルカリホスファターゼ（ALP）。

すべての便サンプル (サンプルあたり約 200 mg) は Novogene (英国) によって処理されました。 以下のプロトコールを使用して DNA を抽出しました: 糞便サンプルを 900 μL の CTAB 溶解バッファーと完全に混合しました。 すべてのサンプルを 65 °C で 60 分間インキュベートした後、4 °C、12,000 × g で 5 分間遠心分離しました。 上清を新しい２ｍＬ微量遠心管に移し、抽出ごとに９００μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、ｐＨ＝６．７；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。 サンプルを完全に混合した後、室温で 10 分間インキュベートしました。 12,000 × g、4 °C で 15 分間の遠心分離によって相分離が起こり、上部の水相をさらに 900 μL のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールで再抽出しました。 次に、サンプルを 12,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離し、上部の水相を新しい 2 mL 微量遠心管に移しました。 最終抽出は、900 μL のクロロホルム:イソアミル アルコール (24:1) で実行し、12,000 × g、4 °C で 15 分間の遠心分離によって層分離を行いました。 DNAの沈殿は、最後の抽出ステップからの上相を、50μLの7.5M酢酸アンモニウム(Fisher)を含有する450μLのイソプロパノール(Sigma-Aldrich)に添加することによって達成された。 サンプルは –20 °C で一晩インキュベートされましたが、インキュベーションが短い (1 時間) と DNA 収量が低下しました。 サンプルを 7500 × g、4 °C で 10 分間遠心分離し、上清を廃棄しました。 最後に、DNA ペレットを 1 mL の 70% (v/v) エタノール (Fisher) で洗浄しました。 最終ペレットを風乾し、２００μＬの７５ｍＭ ＴＥ緩衝液（ｐＨ＝８．０；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁した。 シーケンシング ライブラリは、Illumina テクノロジーに基づいて、メーカーの推奨事項に従って生成されました。 DNA フラグメントをエンドポリッシュし、A テール化し、イルミナ シーケンシングの全長アダプターとライゲーションし、続いて P5 オリゴとインデックス付き P7 オリゴを使用してさらに PCR 増幅しました。 ライブラリの最終構築物としての PCR 産物は、AMPure XP システムで精製されました。 次に、Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies、カリフォルニア州、米国) によってライブラリーのサイズ分布をチェックし、リアルタイム PCR によって定量しました (3 nM の基準を満たすため)。 認定されたライブラリーは、Illumina シーケンサー (NovaSeq システム) に供給されます。

生のリードの品質管理のため、最初のステップですべての Illumina プライマー/アダプター/リンカー配列を削除しました。 続いて、BWA バージョン 0.7.4 を使用してすべてのリードをマウス ゲノム (バージョン: GRCm39) にアライメントし、その後、90% を超えるカバレッジと 95% の同一性を持つリードを削除しました。 次に、フォワードリードとリバースリードの両端から連続して一致する 25 bp という基準を使用して、ペアエンドリードのペアワイズ比較を実行して、潜在的な PCR 重複を排除しました。 最後に、各リードの低品質末端領域をトリミングしました。これは、Phred 品質スコアが <2070 の連続した塩基として定義されます。

高品質リードの分類学的アノテーションは、mOTUs2 によってデフォルト設定で実行され、分類学的相対存在量が生成されました 30。 さらなる分析のために、細菌群集プロファイルが科、属、種レベルで構築されました。 品質管理後の機能アノテーションは HUMAnN341 によって行われました。 次に、RPK 単位 (キロベースあたりの読み取り) で定量化された経路および遺伝子ファミリーの存在量を、100 万あたりのコピー数 (CPM) 単位に正規化しました。 次に、さらなる分析のために遺伝子ファミリーを EC ドメインに再グループ化しました。

すべての分析は、R Statistical Software (v4.1.1; R Core Team 2021) を使用して実行されました。

有病率フィルタリングは、差異が豊富な分析と多様性分析の前に、有病率が 10% 未満の低有病率特徴を除去するために実行されました。

臨床データは、マウスの採取日および体重によって調整された一般化線形モデルによって分析されました (臨床データ ~ グループ + 採取日 + 体重)。 分類学的および機能的データは、分析前にベースライン（ベースラインに対する追跡調査のlog2倍変化[log2FC]）に対して正規化され、マウスからの糞便の採取日によって調整された線形モデルによって分析されました（log2FC存在量〜グループ+採取量）日）。 メタゲノミクス データは、相関分析の前に R パッケージ マイクロバイオームを使用して中心対数比 (CLR) 変換されました 71。 データ間のスピアマン相関は、R パッケージ Hmisc72 の関数 rcorr を使用して分析されました。 P 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。 誤検出率 (FDR) は、Benjamini-Hochberg 手順を適用することにより、複数の仮説検定の P 値を調整するために計算されました。

アルファ多様性 (Shannon、Simpson、および Chao1 インデックス) は、R パッケージ vegan73 を使用して計算されました。 線形混合モデルを適用して、グループ間のアルファ多様性を比較しました。 ブレイとカーティスの距離は、コミュニティの相違点を推定するための R パッケージ vegan を使用して計算されました。 最後に、R パッケージ vegan の関数 adonis を使用した順列多変量分散分析を実行して、グループ間のベータ多様性を分析しました。 P 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究のすべてのサンプルの生のメタゲノム配列データは、アクセッション ID PRJEB57214 で European Nucleotide Archive に寄託されています。 さらなる情報およびリソースおよび試薬のリクエストは、GP ([email protected]) に送信してください。

Asrani, SK、Devarbhavi, H.、Eaton, J.、Kamath, PS 世界における肝疾患の負担。 Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ． 70、151–171 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Kim、IH、Kisseleva、T. & Brenner、DA 老化と肝臓病。 カー。 意見。 胃腸ロール。 31、184–191 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Younossi、ZM 非アルコール性脂肪肝疾患 - 世界的な公衆衛生の観点。 Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ． 70、531–544 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

ユノッシ、Z.ら。 非アルコール性脂肪肝疾患と非アルコール性脂肪性肝炎に関する世界的な視点。 肝臓学 69、2672–2682 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

エスラム、M.ら。 代謝機能不全に関連する脂肪肝疾患の新しい定義: 国際的な専門家の合意声明。 Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ． 73、202–209 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Sharpton, SR、Schnabl, B.、Knight, R. & Loomba, R. 非アルコール性脂肪肝疾患における腸内マイクロバイオームに基づく個別化医療の現在の概念、機会、課題。 細胞メタブ。 33、21–32 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ホタミスリギル、GS 炎症、メタ炎症および免疫代謝障害。 ネイチャー 542、177–185 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Tilg, H.、Adolph, TE、Dudek, M. & Knolle, P. 非アルコール性脂肪肝疾患：代謝、微生物、免疫間の相互作用。 ナット。 メタブ。 3、1596–1607 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kolodziejczyk, AA、Zheng, D.、Shibolet, O.、Elinav, E. NAFLD および NASH におけるマイクロバイオームの役割。 エンボモル。 医学。 11、https://doi.org/10.15252/emmm.201809302 (2019)。

Bechmann, LP et al. 遊離脂肪酸はスモールヘテロダイマーパートナー（SHP）の活性化を抑制し、アディポネクチンは非アルコール性脂肪性肝炎の超肥満患者における胆汁酸誘発性肝損傷を抑制します。 肝臓学 57、1394–1406 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Biddle, A.、Stewart, L.、Blanchard, J. & Leschine, S. 多様な腸内コミュニティにおけるラクノスピラ科とルミノコッカス科による線維分解の特殊化の遺伝的基盤を解き明かす。 ダイバーシティ 5、627–640 (2013)。

記事 Google Scholar

Jiao, N. et al. NAFLDでは一次および二次胆汁酸の産生が増加しているにもかかわらず、肝臓の胆汁酸シグナル伝達が抑制されています。 Gut 67、1881–1891 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ferslew、BC et al. 非アルコール性脂肪性肝炎患者における胆汁酸メタボロームの変化。 掘る。 ディス。 科学。 60、3318–3328 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

セイイン、SIら。 腸内微生物叢は、天然に存在するFXRアンタゴニストであるタウロ-ベータ-ムリコール酸のレベルを低下させることによって胆汁酸代謝を調節します。 細胞メタブ。 17、225–235 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Rizzo, G.、Renga, B.、Mencarelli, A.、Pellicciari, R. & Fiorucci, S. 胆汁酸恒常性の調節における FXR の役割とヒトの病気との関連性。 カー。 薬物標的免疫内分泌メタブ。 障害。 5、289–303 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

クリフォード、BLら。 FXR の活性化は、胆汁酸依存性の脂質吸収の減少を介して NAFLD から保護します。 細胞メタブ。 33、1671–1684.e1674 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Armstrong, LE & Guo, GL 非アルコール性脂肪性肝炎における肝臓炎症における FXR の役割。 カー。 薬局。 議員 3、92–100 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Schwabe, RF & Brenner, DA 肝損傷のメカニズム。 I. TNF-α 誘発肝損傷: IKK、JNK、および ROS 経路の役割。 午前。 Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 胃腸検査。 肝臓生理学。 290、G583–G589 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schmidt-Arras, D. & Rose-John, S. 肝臓における IL-6 経路: 生理病理学から治療まで。 Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ． 64、1403–1415 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gao, B. & Tsukamoto, H. アルコール性および非アルコール性脂肪肝疾患における炎症: 敵か味方か。 消化器病学 150、1704–1709 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Vinolo, MA、Rodrigues, HG、Nachbar, RT & Curi, R. 短鎖脂肪酸による炎症の制御。 栄養素 3、858–876 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シルマー、M.ら。 ヒトの腸内マイクロバイオームと炎症性サイトカイン産生能力の関係。 セル 167、1897 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Trauner, M. & Fuchs, CD 胆汁うっ滞性肝疾患および脂肪肝疾患の新規治療標的。 Gut 71、194–209 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

タグ、CG 他マウスの胆管結紮：閉塞性胆汁うっ滞による炎症性肝損傷および線維症の誘発。 J.Vis. 経験値 https://doi.org/10.3791/52438 (2015)。

Kounturas, J.、Billing, BH & Scheuer, PJ 長期にわたる胆管閉塞: ラットにおける肝硬変の新しい実験モデル。 Br. J.Exp. パソル。 65、305–311 (1984)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kluwe, J. et al. c-Jun-N末端キナーゼ阻害による肝線維症の調節。 消化器病学 138、347–359 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, X. et al. A20 は NAFLD における肝線維化を軽減し、炎症反応を阻害します。 炎症 40、840–848 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ガビ、C.ら。 非アルコール性脂肪肝疾患の2匹のラットモデルにおける脂肪肝に対する胆管結紮およびコール酸処理の効果。 掘る。 肝臓障害 44、1018–1026 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジュアノーラ、Ｏ．ら。 腸内微生物叢は、胆汁うっ滞によって誘発される特定の肝臓遺伝子発現パターンを駆動します。 腸内微生物 13、1–20 (2021)。

論文 PubMed Google Scholar

ミラネーゼ、A.ら。 mOTUs2 を使用した微生物の存在量、活性、および集団のゲノム プロファイリング。 ナット。 共通。 10、1014 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ジョレンテ、C. 他胃酸の抑制は腸内の腸球菌の異常増殖を誘発し、アルコール性肝疾患を促進します。 ナット。 共通。 8, 837 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

クワン、SYら。 脂肪肝疾患のリスクが高いヒスパニック系住民の肝線維症に関連する腸内微生物叢の特徴。 肝臓学 75、955–967 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Louis, P. & Flint, HJ ヒト大腸からの酪酸生成細菌の多様性、代謝、微生物生態学。 FEMS 微生物。 レット。 294、1–8 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vital, M.、Howe, AC & Tiedje, JM (メタ) ゲノム データを分析することで細菌の酪酸合成経路を明らかにします。 mBio 5、e00889 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ルンバ、R. et al. ヒトの非アルコール性脂肪肝疾患における進行性線維症を非侵襲的に検出するための、腸内微生物叢に基づくメタゲノム シグネチャ。 細胞メタブ。 25、1054–1062.e1055 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duan、Y.ら。 腸内細菌を標的とするバクテリオファージはアルコール性肝疾患を軽減します。 ネイチャー 575、505–511 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ヤン、AW 他アルコール性肝疾患のマウスモデルに関連する腸内細菌叢の異常。 肝臓学 53、96–105 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジャン、W.ら。 腸内細菌叢の異常は、非アルコール性脂肪肝疾患を患うヒトの腸内の炎症と粘膜免疫機能の障害に関連しています。 科学。 議員第 5 号、8096 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoyles、L. et al. 非糖尿病性肥満女性における脂肪肝の分子フェノミクスとメタゲノミクス。 ナット。 医学。 24、1070–1080 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウー、TRら。 腸内共生パラバクテロイデス ゴールドスタインは、ヒルステラ シネンシスから単離された多糖類の抗肥満効果において主な役割を果たしています。 Gut 68、248–262 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Beghini, F. et al. bioBakery 3 を使用した、多様な微生物群集の分類学的、機能的、および菌株レベルのプロファイリングの統合。Elife 10、https://doi.org/10.7554/eLife.65088 (2021)。

Agrawal, S.、Agrawal, A. & Said, HM ビオチン欠乏はヒト樹状細胞の炎症反応を増強します。 午前。 Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 細胞生理学。 311、C386–C391 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

レイク、AD 他進行性ヒト非アルコール性脂肪肝疾患における分岐鎖アミノ酸代謝プロファイル。 アミノ酸 47、603–615 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

岩尾 正 他分岐鎖アミノ酸を補給すると、腸内微生物叢を介した酢酸の生成を通じて肝臓での脂肪の蓄積が減少します。 科学。 議員 10、18768 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

田尻 K. & 清水 Y. 肝疾患における分岐鎖アミノ酸。 翻訳。 胃腸ロール。 ヘパトール。 3、47（2018）。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Voloshin, I.、Hahn-Obercyger, M.、Anavi, S. & Tirosh, O. 胆汁酸の L-アルギニン結合体 - 非アルコール性脂肪肝疾患の治療法の可能性。 脂質の健康障害 13、69 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Canbay, A. & Sowa, JP L-オルニチン L-アスパラギン酸 (LOLA) は、非アルコール性脂肪肝疾患の治療のための新しいアプローチとして使用されています。 薬物 79、39–44 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

周、S.ら。 スペルミンは、ATG5依存性オートファジーを介して肝臓常駐マクロファージの炎症誘発性反応を阻害することにより、急性肝障害を軽減します。 フロントイミュノール。 9, 948 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

前園和也ほかアラニンは、F-ガラクトサミンとCCl4によって引き起こされる損傷から肝臓を保護します。 肝臓学 24、185–191 (1996)。

CAS PubMed Google Scholar

ジン、M.ら。 脂肪性肝炎の発症に対するペプチドグリカンの影響。 ビオチム。 生物物理学。 アクタモル。 セルバイオル。 脂質 1865、158595 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロドリゲス・ディアス、C. 他非アルコール性脂肪肝疾患および薬物性肝障害における微生物叢の多様性。 薬局。 解像度 182、106348 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

Duan、Y.ら。 炎症性サイトカインと非アルコール性脂肪肝疾患との関連性。 フロントイミュノール。 13、880298 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, Y. et al. インターロイキン 17 は、非アルコール性脂肪肝疾患における脂肪肝と炎症を悪化させます。 クリン。 経験値イムノール。 166、281–290 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

神田 宏 ほか MCP-1 は、脂肪組織へのマクロファージの浸潤、インスリン抵抗性、肥満における脂肪肝に寄与します。 Ｊ．クリン． 投資する。 116、1494–1505 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

関 英 他 CCR2 はマウスの肝線維症を促進します。 肝臓学 50、185–197 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アブデル・ミシ、SR およびブルームストン、M. 肝臓の解剖学。 外科。 クリン。 北午前。 90、643–653 (2010)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

de Aguiar Vallim、TQ、Tarling、EJ & Edwards、PA 代謝における胆汁酸の多面発現的役割。 細胞メタブ。 17、657–669 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Wahlstrom, A.、Sayin, SI、Marschall, HU & Backhed, F. 胆汁酸と微生物叢の間の腸内クロストークと宿主の代謝に対するその影響。 細胞メタブ。 24、41–50 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

Ciocan, D. et al. アルコール性肝炎における胆汁酸恒常性と腸内環境異常。 アリメント・ファーム。 それで。 48、961–974 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Ma, C. et al. 腸内マイクロバイオームを介した胆汁酸代謝は、NKT細胞を介して肝臓がんを制御します。 サイエンス 360、https://doi.org/10.1126/science.aan5931 (2018)。

ハートマン、P.ら。 腸内胆汁酸/ファルネソイド X 受容体/線維芽細胞成長因子 15 軸の調節により、マウスのアルコール性肝疾患が改善します。 肝臓学 67、2150–2166 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wehr、A. et al. ケモカイン受容体 CXCR6 依存性の肝 NK T 細胞の蓄積は、炎症と肝線維化を促進します。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 190、5226–5236 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Butterworth, RF & Canbay, A. 非アルコール性脂肪肝疾患における L-オルニチン L-アスパラギン酸による肝保護。 掘る。 ディス。 37、63–68 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

スミルン、C.ら。 肝線維症の新規バイオマーカーとしての Gas6/TAM シグナル伝達成分。 ディス。 マーカー 2019、2304931 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheng、L.ら。 胆汁酸合成の調節不全によって引き起こされる肝臓の炎症は、酪酸の補給によって回復可能です。 Ｊ．パソール。 243、431–441 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ゲオルギエフ、P. et al。 実験的胆管結紮後の時間に関連した変化の特徴付け。 Br. Ｊ．Ｓｕｒｇ． 95、646–656 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

稲垣達也ほか線維芽細胞増殖因子 15 は、胆汁酸の恒常性を調節する腸肝シグナルとして機能します。 細胞メタブ。 2、217–225 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schaap, FG、van der Gaag, NA、Gouma, DJ & Jansen, PL 肝外胆汁うっ滞患者の肝臓における胆汁酸塩恒常性維持ホルモンである線維芽細胞成長因子 19 の高発現。 肝臓学 49、1228–1235 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

タグ、CG 他マウスにおける実験的閉塞性胆汁うっ滞の誘発。 ラボアニム。 49、70–80 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、J.ら。 プロバイオティクスで調節された腸内微生物叢は、マウスの肝細胞癌の増殖を抑制します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 113、E1306–E1315 (2016)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lahti, L. & Shetty, S. マイクロバイオーム R パッケージ、https://bioconductor.org/packages/microbiome/ (2019)。

Harrell, FE Jr & Dupont, C. Hmisc: Harrell Miscellaneous、https://CRAN.R-project.org/package=Hmisc (2022)。

オクサネン、J.ら。 ビーガン: コミュニティ エコロジー パッケージ、https://CRAN.R-project.org/package=vegan (2020)。

リファレンスをダウンロードする

この研究は、イエナ臨床研究学際センター (ID: AMSP-05) によって支援されました。 Marie Sklodowska-Curie Actions (MSCA) および革新的なトレーニング ネットワーク、H2020-MSCA-ITN-2018 813781 "BestTreat"; 著者らは、動物のスコアリングと収穫に関する支援について、Jessica Hoff 博士と Wanling Foo 博士に感謝します。

Howell Leung、Ling Xiong などの著者も同様に貢献しました。

マイクロバイオームダイナミクス、ライプニッツ天然物研究および感染生物学研究所 - ハンス・ノール研究所、イエナ、ドイツ

ハウエル・レオン、ユエチオン・ニー、ジャンニ・パナギオトゥ

イエナ大学病院、麻酔科および集中治療科、イエナ、ドイツ

リン・シオン、アン・ブッシュ、マイケル・バウアー、エイドリアン・T・プレス

フリードリヒ・シラー大学、理論微生物生態学、生物科学部微生物研究所、イエナ、ドイツ

アン・ブッシュ

フリードリヒ・シラー大学医学部、イエナ、ドイツ

エイドリアン・T・プレス

フリードリヒ・シラー大学イエナ、生物科学部微生物研究所、イエナ、ドイツ

ジャンニ・パナギオトゥ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

GP と ATP が研究を設計しました。 LX と ATP は動物実験とサンプルを実施し、材料から血液と便のサンプルを処理しました。 ATP と MB は動物実験を監督しました。 HL はメタゲノミクス分析を実行しました。 GP と YN はメタゲノミクス解析を監督しました。 GPとYNが原稿を監修しました。 HLとGPが原稿を書きました。 HL と LX はこの論文に同等に貢献しました。 著者全員が最終原稿を読み、レビューし、承認しました。

Adrian T. Press または Gianni Panagiotou との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Leung、H.、Xiong、L.、Ni、Y. 他。 肝臓から腸への胆汁酸の流れの障害は、肝臓損傷に関連するマイクロバイオームと免疫の相互作用を明らかにします。 npj バイオフィルム マイクロバイオーム 9、35 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00398-0

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 11 月 29 日

受理日: 2023 年 5 月 18 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00398-0

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供