ステージの識別

Virology Journal volume 19、記事番号: 130 (2022) この記事を引用

2075 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

現時点では、デング熱に対する特異的な治療薬や適切なワクチンはまだありません。したがって、明確な臨床診断指標を探求することが重要です。

この研究では、差次的発現遺伝子 (DEG) 解析、加重共発現ネットワーク解析 (WGCNA)、および受信者オペレーター特性曲線 (ROC) を組み合わせて、デング熱患者の診断価値を持つ安定した堅牢なバイオマーカーをスクリーニングしました。 CIBERSORT は、デング熱患者の免疫状況を評価するために使用されました。遺伝子オントロジー (GO) エンリッチメント、京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) 分析、および遺伝子セットエンリッチメント分析 (GSEA) を適用して、ハブ遺伝子の潜在的な機能を探索しました。

CD38 細胞と形質細胞は、デング熱患者の臨床段階を区別する際に優れた曲線下面積 (AUC) を持ち、活性化記憶 CD4+ T 細胞と単球はこの機能に関して優れた AUC を持っています。 ZNF595 は、急性期全体でデング出血熱 (DHF) とデング熱 (DF) を識別する際に許容可能な AUC を持っています。あらゆる血清型を分析すると、一貫した結果が得られます。 GO、KEGG、GSEA の分析結果に基づいたウイルス複製の負の阻害、上方制御されたオートファジー遺伝子、および免疫系の障害が、DHF を引き起こす潜在的な理由です。

CD38、形質細胞、活性化記憶 CD4+ T 細胞、単球はデング熱患者の臨床病期を区別するために使用でき、ZNF595 は血清型に関係なく DHF と DF を識別するために使用できます。

デング熱は、世界保健機関 (WHO) によって、2019 年の初めに発表された世界的な健康上の脅威トップ 10 の 1 つとしてリストされています [1]。過去数十年で、デング熱は蚊が媒介する病気として世界で最も急速に拡大しており[2,3,4]、人間の健康を深刻に危険にさらしている[5,6]。ワクチンの研究開発は引き続き進歩しています[7、8、9、10、11、12]が、抗体依存性増強（ADE）によりワクチンの有効性が制限されています[13、14、15、16、17]。無症候性感染はデング熱の発生率を増加させますが[16、18]、効果的な治療法はまだ特定されていません。したがって、より適切な診断と治療のためには、デング熱の発症メカニズムを調査し、分子マーカーをスクリーニングすることが急務となっています。

損傷または異常な細胞内成分を分解して栄養素を回復する異化プロセスであるオートファジーは、細胞と体の恒常性を維持するために不可欠であり[19、20]、デング熱ウイルス（DENV）の増殖と感染に利益をもたらします[21、22、23、 24]。 DENV-ADE 感染では、交差反応性抗体がオートファジー関連タンパク質を誘導することで感染を媒介し、その後ミトコンドリア抗ウイルスタンパク質 (MAVS) によって媒介される自然免疫を抑制します [25]。免疫応答は、症候性感染、無症候性感染[26、27]、デングショック症候群（DSS）、デング出血熱（DHF）[28、29、30]など、さまざまな程度でDENVに対する宿主の応答に直接的または間接的に影響を与えます。したがって、DENV 感染時のオートファジーと免疫応答を調査することが不可欠です。

トランスクリプトミクス研究は、研究者が疾患の原因をより深く理解し[31]、バイオマーカーを特定するのに役立ちます[32、33、34]。私たちの貴重なトランスクリプトミクス研究は、ウイルスの進化とそれが DENV の病原性とワクチン開発に与える影響の理解に貢献しました [35、36、37、38]。しかし、発表された研究[39、40、41]は、複数の遺伝子の研究と単一の分析方法（差次的発現遺伝子（DEG）分析）に焦点を当てており、ゲノミクスと免疫状況を結び付けていませんでした。この研究では、DEG 分析、加重共発現ネットワーク分析 (WGCNA)、および受信者オペレーター特性曲線 (ROC) を組み合わせて使用し、独立したデータセットで段階と重症度の診断価値を持つバイオマーカーを特定、検証、テストしました。 CIBERSORT ウェブサイトでは、3 つの段階間および DHF とデング熱 (DF) 間の免疫状況の違いを分析し、遺伝子と免疫細胞の相関関係を調査しています。

デング熱患者の遺伝子発現データセットは、遺伝子発現オムニバスデータベース (GEO、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) という名前の公共データベースから選択されました。私たちは次の基準点に従いました。 1. データセットは、DF および DHF を含むデング熱患者からのさまざまな段階の全血サンプルと正常サンプルを分析しました。 2. データセットには少なくとも 20 人のデング熱患者が含まれている必要があります。これらの基準に基づいて、2 つのチップタイプ (GLP570 プラットフォームの affymetrix HG-U133 plus 2 と GLP201 プラットフォームの HG-Focus) [41]、GSE28405 データセット [42] および GSE51808 データセット [43] を分析する GSE43777 データセットを取得しました。

GSE43777では、ベネズエラ、マラカイのDF被験者51名とDHF被験者13名から200以上のサンプル（各ステージに1サンプル）が収集され、参加者の人口統計、臨床的、免疫学的、血液学的特徴が貴重に要約されました[41]。 GSE28405では、臨床的に未分化なDENV RT-PCR陽性患者サンプル31名がシンガポールで72時間以内（急性期前期、EA）、4～7日以内（急性期後期、LA）、3～4週間以内（回復期C）に選択されました。自己申告による発熱後、その他の臨床情報は貴重に記載されているように記録されていた[42]。 GSE51808 では、バンコクのシリラート病院に入院した 47 人のデング熱患者 (DF n = 31、DHF = 16) から 2 日以内および退院後 (回復期) 4 週間以降 (回復期) に全血サンプルが採取され、9 人の正常被験者から全血サンプルが採取されました。分析され、詳細な臨床情報も示されました [44]。

貴重な研究として、C または EA 段階の遺伝子発現レベルをベースラインとして、これらの患者を C vs EA、C vs LA、EA vs LA の 3 つのグループに分けました [41]。主成分分析 (PCA) 分析 [45] は、さまざまな段階を明確に区別できるかどうかを調査するために使用されました。

R パッケージ「Limma」に基づく Web サイト (http://sangerbox.com/Tool) を、3 相間 (血清型に関係なく分析を示し、血清型ごとに個別の分析も実行しました) および DHF と DHF 間の DEG を分析するために適用しました。デング熱患者のためのDF。 R バージョン 4.1.0 の AR パッケージ「clusterProfiler」と遺伝子セット濃縮分析 (GSEA) ソフトウェア (4.1.0) [46] を使用して、ジーンオントロジー (GO) 濃縮分析を実行しました。京都遺伝子とゲノム百科事典 (KEGG)分析と GSEA を利用して、DEG の潜在的な生体機能と濃縮経路を探索します。

「WGCNA」パッケージにより、C vs EA グループで合計 4843 個の遺伝子、C vs LA グループで 4472 個の遺伝子、EA vs LA グループで 4463 個の遺伝子を取得しました。 βのべき乗が5、4、12に等しいとき、隣接行列をトポロジカルオーバーラップ行列（TOM）に変換しました。0.25の高さカットオフに従って、類似したモジュールと発生疾患との最も高い適合性を示すモジュールをマージしました。より安定な DEG を特定するために、デング熱のを使用して DEG と交差しました。

「CIBERSORT」ウェブサイト (https://cibersortx.stanford.edu/index.php) を使用して全血サンプル中の免疫細胞の割合を推定しました。これを使用して遺伝子発現データを入力し、22 個の免疫細胞の割合の推定値を取得できます。全血サンプル中のタイプ[48]。

ROC [49] は、曲線下面積 (AUC) に基づいて、段階と重症度を区別してバイオマーカーと免疫細胞の値を特定、有効にし、検査するために適用されました。

R ソフトウェア (バージョン 4.1.0) と R. Studio (バージョン 1.9.0) を使用してデータを分析し、結果を視覚化しました。 t 検定、マンホイットニー U 検定、カイ二乗検定を適用して、2 つのグループ間の差異を特定しました。ピアソン理論とスピアマン理論に従って相関分析が示されました。 P 値 < 0.05 を統計的有意性とみなしました。

図 1 は、この研究の図を示しています。

フローチャート図。デング熱患者の末梢血単核球 (PBMC) における RNA 発現レベルは、デング熱ウイルス (DENV) 感染中に変化します。これらの RNA 配列データと臨床情報は、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI) データセット (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) からダウンロードしました。 R パッケージ「Limma」と「WGCNA」を組み合わせて、デング熱患者の 3 段階間および DHF と DF の間で安定した差次的発現遺伝子 (DEG) がスクリーニングされ、また、京都大百科事典のジーンオントロジー (GO) を使用して、これらの DEG の潜在的な機能も探索されました。遺伝子とゲノム (KEGG) および遺伝子セット濃縮分析 (GSEA) 分析。遺伝子発現データに基づいて、全血サンプル中の免疫細胞の割合が「CIBERSORT」ウェブサイトによって推定され、免疫細胞と遺伝子の間の相関関係も認定されました。最後に、曲線下面積 (AUC) を使用して、臨床段階と重症度を区別する際の遺伝子と重要な免疫細胞の診断価値を評価しました。

主成分分析 (PCA) は、3 段階のサンプルを区別できることを示しています (追加ファイル 1: 図 S1 A ～ C)。 GLP201プラットフォーム上のGSE43777データセットからの発現データを正規化した後、C段階とEA段階の間の147のDEG（121個の上方制御遺伝子と26個の下方制御遺伝子）を特定しました（図2A、Fおよび追加ファイル7：表S1）。、C段階とLA段階の間の124°（102個の上方制御遺伝子および22個の下方制御遺伝子）（図2B、Gおよび追加ファイル8：表S2）、および195°（74個の上方制御遺伝子および121の下方制御遺伝子） |Log2FC|≥ 1、および調整された P 値 < 0.05 に基づく「Limma」パッケージによる、EA 段階と LA 段階の間 (図 2C、H、および追加ファイル 9: 表 S3)。同様に、EA 段階では、DF (n = 15) と DHF (n = 11) の間で 30 DEG (16 個の上方制御遺伝子と 14 個の下方制御遺伝子) (図 2D、I および追加ファイル 10: 表 S4) を得ました。 ) GLP570 プラットフォーム上の GSE43777 データセットからのサンプル、および DF (n = 25) と DHF (n = 26) LA ステージのサンプル、 |Log2FC|≥ 1 および P 値 < 0.05 に基づく。

A-E 火山マップと F-J ヒートマップは、発現差のある遺伝子 (DEG) をスクリーニングします。 K-O 遺伝子オントロジー (GO) 分析は、差次的発現遺伝子 (DEG) が主に生物学的プロセスに関与していることを示し、P-T 京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) 分析は、DEG の潜在的な濃縮経路を示しています。（C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期）

GO濃縮分析の結果は、147 DEG（C段階とEA段階の間）が主にウイルスおよびI型インターフェロンに対する防御反応において濃縮されていることを示しています（図2K）。 DNA複製は、124°（C段階とLA段階の間）の一般的な生物活性です（図2L）。図２Ｍは、好中球の活性化とウイルスに対する防御反応が、ＥＡ段階とＬＡ段階の間の１９５°の濃縮生体機能を支配していることを示している。ウイルスゲノム複製の負の制御に関与する生体機能は、図２ＮのＤＦサンプルとＤＨＦサンプルの間の３０°においてより活性である。好中球および体液性免疫応答は、LA 段階の DHF サンプルで活性化されます (図 2O)。

図2IおよびNのGO濃縮分析結果（ウイルス複製の負の制御が濃縮されたDHFサンプル中の下方制御された遺伝子）は、EA段階のDHF患者におけるウイルス複製の制御が難しいことを示唆しているため、私たちの注目を集めました。相対研究[21、24、50]は、DENVがオートファジーを通じて細胞のアポトーシスを阻害し、それによってその複製を促進することを実証した。したがって、オートファジー関連遺伝子がEA期とLA期で活性化されるのではないかと考えられます。追加ファイル 1: 図 S1 J に示すように、LA 段階では、ダウンロードされた 222 個のオートファジー関連遺伝子を使用して GLP570 プラットフォームで分析された GSE43777 からの DHF サンプルと DH サンプル間の DEG を交差させることにより、1 つの異なる発現オートファジー関連遺伝子 (CCL2) を明確に特定します。オートファジーに直接的または間接的に関与するヒトの遺伝子とタンパク質の完全かつ最新のリストを提供する Human Autophagy Database (HADb) から。箱ひげ図 (追加ファイル 1: 図 S1 K) は、CCL2 の発現レベルが LA 段階の DHF サンプルで大幅に増加していることを示しており、DENV が DF よりも DHF でより強く複製されることを示唆しており、これが LA で DHF を引き起こす 1 つの理由である可能性があります。ステージ。一方、EA 段階では DF と DHF の間でオートファジー関連遺伝子の発現の違いは確認されていません。

ＫＥＧＧ分析結果は、病原体感染およびＮＯＤ−様受容体シグナル伝達経路が、１４７°（Ｃ段階とＥＡ段階の間）の明らかな濃縮経路であることを明らかにしている（図２Ｐ）。細胞複製、レジオネラ症およびマラリアは、124 DEG (C ステージと LA ステージの間) の主要な濃縮経路です (図 2Q)。 195°（EA段階とLA段階の間）は病原体感染と細胞複製が豊富です（図2R）。 NOD 様受容体シグナル伝達経路と病原体感染は、図 2S の DF (n = 15) サンプルと DHF (n = 11) サンプルの間の 30°でより活性化します。図 2T の LA 段階では、DHF サンプルの炎症経路が活性化されています。

GLP201 プラットフォームで分析された GSE43777 データセットを使用して、「WGCNA」パッケージを実行して、デング熱の行列特徴に関連する主要なモジュールを取得しました。 C vs EA グループ、C vs LA グループ、およびEA対LAグループ。モジュールは、同様の発現特性を持つ遺伝子で構成されます (追加ファイル 1: 図 S1 G–I)。クラスターツリーでは、各ブランチを使用して遺伝子を表し、1 つの色で共発現モジュールを示します (図 3D–F)。

加重共発現ネットワーク分析 (WGCNA)。 A–C さまざまなソフトしきい値パワーのスケールフリーフィットインデックス (左) と平均接続性 (右)。 D–F 遺伝子のクラスタリング樹状図。 G–I モジュール特性のヒートマップには、さまざまな段階間の相関関係が表示されます。（C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期）

モジュール固有遺伝子 (ME) 値と臨床段階の関連付けを適用して、モジュール段階の特徴相関を評価します。 WGCNA の結果は、それぞれ 14、12、8 個のモジュールを示しています (図 3G–I)。 C と EA グループを比較すると、ターコイズモジュールは EA グループ (ピアソン係数 = − 0.89、P = 1e−33) および C グループ (ピアソン係数 = 0.89、P = 1e) と最も強く一致します。図３Ｇの−３３）。 C と LA グループを比較すると、LA グループ (ピアソン係数 = 0.71、P = 5e−20) と青色モジュール間、および C グループ (ピアソン係数 = −) の間で最も有意な相関が観察されます。 0.71、P = 5e−20）と図3Hの青いモジュール。 LA グループと EA グループを比較すると、図 3I では黒のモジュールと緑のモジュールが同じ最も高い相関関係 (ピアソン係数 = 0.72) を示しています。上記のこれらのモジュールを重要なモジュールとみなします。

信頼性が高く強力なハブ遺伝子 (共有遺伝子) を正確にフィルタリングするために、Web サイト (http://www.ehbio.com/test/venn/#/) でベン図を使用して DEG と主要モジュール間のハブ遺伝子を視覚化しました [51] 。結果は、ターコイズモジュールを147°（CステージとEAステージの間）で相互作用させ（図4A）、青色モジュールを124°（CステージとLAステージの間）で相互作用させることにより、143、99、および187個のハブ遺伝子を示しています（図４Ｂ）、黒モジュールと緑モジュールをそれぞれ１９５°（ＥＡステージとＬＡステージの間）で相互作用させる（図４Ｃ）。 CD38 と CDKN1C は 3 つの相で共有されます (図 4D)。血清型を考慮すると、CD38 と CDKN1C は依然として、各血清型の 3 つの比較グループ (C 対 EA、C 対 LA、EA 対 LA) で差次的に発現し、log|FC|> 1 または log|FC|> 1 です。は 1 に極めて近い (追加ファイル 12: 表 S6)。図４Ｇは、ＣＤ３８の発現レベルが最初に増加し、その後、０日目からＣステージまで減少することを示す（＊＊＊＊Ｐ＜０．００１）。一方、CDKN1C の発現は最初に下方制御され、続いて 0 日目から C 期まで上方制御されます (***P < 0.001) (図 4G)。 GSEA は、CD38 が細胞増殖および代謝経路に豊富に存在し (図 4E)、CDKN1C が脂質代謝および炎症経路に豊富であることを示しています (図 4F)。相関分析により、図 4H に示すように、CD38 の発現レベルは CDKN1C と負の相関関係にあります (スピアマン相関 = − 0.5)。追跡分析には CD38 と CDKN1C を選択します。

ベン図は共有遺伝子を選別します。ターコイズモジュールと差次的に発現された遺伝子 (DEG) (C ステージと EA ステージの間) の間の 143 の共有遺伝子。 B 99 は青色モジュールと DEG の間 (C ステージと LA ステージの間) で遺伝子を共有しました。 C 187 は、黒および緑のモジュールと DEG の間 (EA 段階と LA 段階の間) で遺伝子を共有しました。 D 2 は 3 つの段階で遺伝子を共有しました。 EおよびFは、遺伝子セット濃縮分析（GSEA）によるCD38およびCDKN1Cの潜在的な機能濃縮経路を示しています。 G CD38 および CDKN1C の発現レベルの経時的変化を示す箱ひげ図 (***P < 0.001)。 CD38 と CDKN1C 間の HA 負の相関。（C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期）

CD38 と CDKN1C は 3 つの段階で発現の仕方が異なるため (図 5A-B)、これらをデング熱患者の臨床段階を区別するための病期分類特性を持つバイオマーカーとして使用できると推測します。 CD38 および CDKN1C の値を特定、検証、テストするために、GPL201 プラットフォームで分析された GSE43777 データセット (C ステージ、n = 48、EA ステージ、n = 47、LA ステージ、n = 73)、GPL201 プラットフォームで分析された GSE43777 データセットを考慮します。 GPL570 プラットフォーム (C ステージ、n = 24、EA ステージ、n = 26、LA ステージ、n = 51) および GSE28405 (C ステージ、n = 31、EA ステージ、n = 57、LA ステージ、n = 31)それぞれトレーニングデータセット、検証データセット、テストデータセットです。単一の血清型を分析する場合、GPL201 プラットフォームで分析された GSE43777 データセットを考慮します (血清型 I: C ステージ、n = 26、EA ステージ、n = 26、LA ステージ、n = 44。血清型 II: C ステージ、n = 6、EA血清型 III: C ステージ、n = 9; EA ステージ、n = 9; LA ステージ、n = 15。血清型 IV: C ステージ、n = 6; EA ステージ、 n = 4; LA ステージ、n = 8.)、GPL570 プラットフォームで分析された GSE43777 データセット (血清型 I: C ステージ、n = 7; EA ステージ、n = 3; LA ステージ、n = 14。血清型 II: C ステージ) 、n = 11; EA ステージ、n = 16; LA ステージ、n = 23. 血清型 III: C ステージ、n = 3; EA ステージ、n = 3; LA ステージ、n = 8. 血清型 IV: C ステージ、n = 3; EA ステージ、n = 3; LA ステージ、n = 6.) をそれぞれトレーニングデータセットおよび検証データセットとして使用します。

A と B CD38 と CDKN1C の発現レベルが 3 段階で大きく異なります。 C CD38 および CDKN1C は、デング熱サンプルと正常サンプルを区別するために使用できます。曲線下面積 (AUC) によるデング熱の CD38 および CDKN1C の病期分類診断値の分析: D ～ F を分析最初にトレーニンググループで、G ～ I が続いて検証グループで検証し、J ～ L が最後にテストグループでテストしました。（C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期）

トレーニンググループでは、CD38 の AUC は 3 つの比較グループ (C vs EA、C vs LA、EA vs LA) でそれぞれ 0.960、0.976、0.829 であり、CDKN1C の AUC は 3 つの比較グループ (C vs LA) で 0.852、0.868、0.955 でした。 EA、C対LA、EA対LA）それぞれ（図5D〜F）。検証グループにおけるデング熱の病期分類における CD38 および CDKN1C の病期分類診断値は次のとおりです (図 5G–I): CD38 (AUC: 0.897、C vs EA; AUC: 0.957、C vs LA; AUC: 0.827、 EA vs LA)、CDKN1C (AUC: 0.575、C vs EA; AUC: 0.929 C vs LA; AUC: 0.876、EA vs LA)。図 5J–L は、テストデータセットの高い診断値を示しています: CD38 (AUC: 0.822、C vs EA; AUC: 0.996 C vs LA; AUC: 0.926、EA vs LA)、CDKN1C (AUC: 0.744、C vs EA; AUC) ：０．７２４℃対ＬＡ；ＡＵＣ：０．８４２、ＥＡ対ＬＡ）。上記の分析結果は、CD38 がデング熱患者のさまざまな段階を見事に区別でき、CDKN1C よりも高い識別値を持っていることを示しています。血清型 (血清型 I ～ IV) を考慮しますが、結果は 3 つの比較グループ (C vs EA、C vs LA、EA vs LA) 間で同様です (追加ファイル 2: 図 S2、追加ファイル 3: 図 S3)。

さらに、図 5C に示すように、CD38 は、GSE51808 データセット (9 つの正常サンプルと 28 のデング熱サンプル) において 100% の AUC でデング熱サンプルと正常サンプルを完全に区別します。したがって、CD38 はデング熱患者の病期を区別する際に高い値を示します。我々は、デング熱の病期診断のためのバイオマーカーとして CD38 を選択しました。

DH サンプルと DHF サンプルの間では CD38 と CDKN1C の発現レベルに有意な差はなく (追加ファイル 1: 図 S1 L)、デング熱の異なる血清型でも CD38 と CDKN1C の発現レベルに明らかな差はありません (追加ファイル 1:図S1M）。

EA ステージの GLP570 プラットフォーム上の GSE43777 データセットからの DF (n = 15) と DHF (n = 11) のサンプル間を 30 度で交差させた後、LA の DF (n = 25) と DHF (n = 26) のサンプル間を 58 度で交差させます。この段階では、6 つの共有 DEG (LOC101928288、TCN1、DEFA4、FRG1B、LOC286087、および ZNF595) を特定します (図 6A)。 LOC101928288、TCN1、DEFA4、FRG1B、LOC286087、および ZNF595 は、DHF と DF の間で発現が異なるため、DHF 患者と DF 患者を区別するためのバイオマーカーとして使用できると推測されます。 EA ステージ (DF = 15; DHF = 11) (図 6B) および LA ステージ (DF = 25; DHF = 26) (図 6C) における GPL570 プラットフォームでの GSE43777 データセット分析は、トレーニングとみなされます。データセット; 急性期 (DF = 40; DHF = 37) の GPL201 プラットフォームで分析された GSE43777 データセットは検証データセットとみなされます。 GSE51808 (DF = 18; DHF = 10) および GSE18090 (DF = 8; DHF = 10) データセットはテストデータセットとみなされます。 ROC の結果 (図 6B ～ F) は、ZNF595 が DHF 患者と DF 患者を区別する上で常に許容可能な診断価値を持っていることを示しています。したがって、ZNF595 は、急性期の DHF 患者を予測するためのバイオマーカーとして選択されます。

A 急性期のデング熱 (DF) とデング出血熱 (DHF) の間で差次的に発現される遺伝子 (DEG) が共有されています。 LOC101928288、TCN1、DEFA4、FRG1B、LOC286087、ZNF595 のデング熱重症度の診断値を曲線下面積 (AUC) ごとに分析: トレーニングデータセットでは B ～ C、検証データセットでは D、テストデータセットでは E ～ F。（C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期）

DHF サンプルと DF サンプルの間の 58°の GO 濃縮分析は、好中球と体液性免疫応答が活性化されていることを示し、KEGG 経路濃縮分析は豊富な炎症経路を示します。そこで、CIBERSORTによるDENV感染時の22種類の免疫細胞の分画変化を解析しました。 GLP201 プラットフォームでの GSE43777 データセット分析は、デング熱患者の全血サンプル中の 22 種類の免疫細胞の分画を 3 段階で調査するために使用され、GLP570 プラットフォームで分析された GSE43777 データセットは、DF と DF の間で異なる浸潤免疫特性を調査するために適用されます。 DHFサンプル。

図 7A ～ C および 7F に示すように、EA 期では、活性化された樹状細胞、好中球、単球、および M1 マクロファージの割合 (P < 0.05) が、LA 期および C 期と比較して大幅に増加します。 LA 期を EA 期および C 期と比較すると、形質細胞および活性化記憶 CD4+ T 細胞の割合 (P < 0.05) が明らかに増加しています (図 7A ～ C および F)。 EA 期と LA 期と比較すると、記憶 B 細胞、休止記憶 CD4+ T 細胞、休止樹状細胞、好酸球、およびナイーブ B 細胞の割合の増加 (P < 0.05) は、C 期でより明らかです (図.7A～CおよびF）。上記の分析結果は、抗原提示、食作用、走化性をもつ免疫細胞、体液性免疫に関与する免疫細胞、および記憶細胞がそれぞれEA、LA、C期でより明らかに活性であることを意味します。単一の血清型で分析した場合でも、上記の結果が得られます (追加ファイル 4: 図 S4)。

A-E ヴァイオリン図と F-H ヒートマップは、異なる比較グループにおける免疫細胞の免疫差異を示します。 I-J 遺伝子 (CD38 および ZNF595) と 22 種類の免疫細胞間の相関関係 (赤い長方形: 統計的に有意 (P < 0.05))。（C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期）

LA段階では、活性化NK細胞の割合（P < 0.05）がDHFサンプル中で増加します（図7EおよびH）が、CD8+ T細胞、ガンマデルタT細胞、休止NK細胞、M2マクロファージおよび休止マスト細胞の割合は減少します。 (図 7E および H) (P < 0.05)、これは、DHF サンプルでは免疫応答が損傷していることを意味します。 EA 段階では、DF 患者の免疫応答は DHF 患者の免疫応答と類似しています (図 7D および G)。 LA 期の DHF 患者の免疫応答は著しく損なわれており、これが LA 期の DHF 患者の急速な悪化の説明となります。

GSE43777 データセットにおける CD38 と免疫細胞の間の相関関係を分析します (図 7I)。形質細胞、活性化記憶CD4+ T細胞、ガンマデルタT細胞、およびCD8+ T細胞の浸潤レベルは、CD38と正の相関があります（図7I）。ナイーブB細胞、単球、休止樹状細胞、休止メモリーCD4+ T細胞、ナイーブCD4+ T細胞、メモリーB細胞、好酸球、および活性化マスト細胞の浸潤レベルは、CD38と負の相関があります（図7I）。したがって、上記の分析結果は、CD38 と形質細胞、および CD38 と活性化メモリー CD4+ T 細胞の間に強い共発現関係があることを示しています (ピアソン相関 > 0.5)。個々の血清型においても、この結論を導くことができます (追加ファイル 5: 図 S5)。免疫細胞とZNF595との間の相関は有意ではない(図7J)。

CD38 と形質細胞間の高い共発現相関により、浸潤免疫形質細胞も 3 つの段階で明確な差異を示す可能性があると我々は推測しました。この特性を調査するために、GPL201 によって分析された GSE43777 をトレーニングセットとして、GPL570 によって分析された GSE43777 をテストセットとみなしました。トレーニンググループで示された図 8A ～ C に示すように、病期分類における形質細胞、活性化記憶 CD4+ T 細胞、および単球の識別値は良好であり、形質細胞が最も高い識別値を示しました (AUC:0.827、C vs EA; AUC) ：0.964、C対LA、AUC：0.832、EA対LA）。試験グループでは、デング熱の段階における 3 種類の免疫細胞の識別値は依然として価値があり、図 8D ～ F では形質細胞が最も高い識別値を示しました (AUC: 0.905、C vs EA、AUC: 0.949、C vs EA) LA; AUC: 0.824、EA vs LA. 形質細胞 (AUC = 0.968)、活性化記憶 CD4 + T 細胞 (AUC = 0.845)、および単球 (AUC = 0.869) は、GSE51808 においてデング熱サンプルと正常サンプルを良好に区別できます (図 8G) ). 異なる血清型を考慮した場合でも、上記の結果が得られました (追加ファイル 6: 図 S6)。したがって、デング熱患者の血漿細胞、活性化記憶 CD4 + T 細胞、単球の割合に基づいて 3 つの段階を識別できます。

デング熱に対する免疫細胞の病期分類診断値を曲線下面積 (AUC) によって分析します。 A ～ C はトレーニンググループ、D ～ F はテストグループです。 G デング熱サンプルと正常サンプル間の免疫細胞の診断値を検証する。（C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期）

この研究では、DEGs分析、WGCNA、ROCを組み合わせて、デング熱の病期分類と重症度に関連する潜在的なバイオマーカーを特定、検証、テストし、GO濃縮分析、KEGG分析、GSEA分析を使用してDHFを引き起こす潜在的な理由を調査しました。 CIBERSORT ウェブサイトは、デング熱感染時の免疫の違いを調査するためにも適用されました。私たちの研究は、CD38 と ZNF595 がデング熱の病期と重症度において臨床的重要性を持ち、デング熱患者の臨床病期と重症度を区別するためのバイオマーカーとして使用できることを初めて示しました。形質細胞、活性化記憶 CD4+ T 細胞、および単球も顕著な値を示したことは注目に値します。

独立したデータセットで同定、検証、テストされた CD38 は、デング熱の 3 つの臨床段階を区別でき、形質細胞と有意に関連していましたが、貴重な結果 [52] と同様の重症度の予測や、異なる血清型の区別には使用できませんでした。私たちの結果は、CD38 の発現レベルと形質細胞の画分が 4 つの血清型で類似していることを示しました。私たちは、DHF を予測できる独立したデータセットで ZNF595 を特定、検証、テストしました。機構的には、ウイルス複製を阻害するEA-DEGはDHF中で下方制御され、関連オートファジー遺伝子（CCL2）はDHF中で異なる発現をし、有意に増加した。これらすべてのことは、DENVがオートファジーを制御してDHFを引き起こすことを示唆した。

さらに、3 つの段階間および急性期における DHF と DF 間の免疫の違い、免疫細胞と遺伝子の相関関係を系統的に解析しました。免疫分析の結果、自然免疫応答と呼ばれる単球、活性化マスト細胞、M1マクロファージおよび好中球の割合が、C期と比較してEA期で明らかに増加していることが示されました。 LA 期と C 期を比較すると、形質細胞と活性化記憶 CD4+ T 細胞の割合に大幅な増加が観察されます。 LA 期では、EA 期と比較して、形質細胞、CD8+ T 細胞、活性化記憶 CD4+ T 細胞、濾胞性ヘルパー T 細胞、制御性 T 細胞 (Treg)、およびガンマデルタ T 細胞の割合が増加しています。上記の結果はどの血清型にも当てはまり、異なる血清型には明らかな免疫の違いがないことが示唆されました。免疫反応の増加により DENV が排除され、デング熱の症状が回避され [27]、初期のリンパ球数に依存する免疫反応動態が疾患の重症度と一致することが観察された [53]。私たちの研究では、LA期のDHFでは好中球と体液性免疫反応が活性化されているが、DFに比べてDHFでは免疫系全体が損傷しており、これがDHFを引き起こす可能性のある理由であることを示しました。

興味深いことに、KEGG 濃縮により、DEG (EA 期と C 期の間、および EA 期と LA 期の間) がコロナウイルス感染症 - COVID-19、インフルエンザ A、C 型肝炎、麻疹経路で濃縮されていることが示され、コロナウイルスを示唆しています [54] 、アルファインフルエンザウイルス、インフルエンザ[55]、C型肝炎ウイルス[56]、および麻疹モルビリウイルスも感染中にこれらの遺伝子を上方制御し、共通の発病メカニズムを持っていました。

研究者らは、公開データベース (GEO) の遺伝子発現プロファイルをデング熱バイオマーカーの調査に適用しています。いくつかの研究では、デング熱患者と健康なサンプル [39、40]、DHF と DF [41]、およびさまざまな段階 [57] を区別するために複数の遺伝子が使用されています。ただし、複数の遺伝子リストは、疾患バイオマーカーとしての DEG の感度と特異性を制限する可能性があります [58、59]。

以前の研究[39、40、41]と比較して、私たちの研究にはいくつかの利点がありました。まず第一に、この研究は単一遺伝子分析に基づいており、これにより安定で堅牢なバイオマーカーを特定することができ、これらのバイオマーカーは独立したデータセットで特定および検証されたため、研究の精度が向上しました。次に、DEG、WGCNA、ROC を含む 3 つの方法を組み合わせて、デング熱診断用のバイオマーカーをスクリーニング、検証、テストしました。これにより、DEG 分析のみに依存する貴重な研究とは異なり、結果の精度が向上しました。第三に、DENV感染時の免疫応答全体の理解を深め、遺伝子と免疫細胞の相関関係を調査するために、RNA配列に基づいて、あまり注目されていない免疫細胞を含む22種類の免疫細胞を分析しました。以前の研究では、末梢リンパ球サブセットの変化が新型コロナウイルス感染症の臨床的特徴と治療効果の独立した予測因子となり得ることが示されている[60]。興味深いことに、デング熱患者の血漿細胞、活性化記憶 CD4+ T 細胞、単球の一部にも臨床的特徴があり、デング熱患者のこれらの臨床段階を区別できることがわかりました。最後に、私たちの研究には単一の血清型だけでなく、個別および組み合わせた分析に関与する 4 つの血清型が含まれていました。

この研究にはまだ欠点があります。なぜなら、この研究では分析、検証、テストに公開データセットのみが使用されており、臨床検証やテストが行われていないからです。私たちの研究は、デング熱感染症の段階と重症度を区別し、さまざまな血清型の発病メカニズムを理解するのに役立ち、DHFのメカニズムの分析に役立ち、将来の臨床治療に役立つでしょう。

結論として、CD38 の発現レベルと、形質細胞、活性化記憶 CD4+ T 細胞、単球の各分画に基づいて、デング熱患者の 3 つの臨床段階を見事に識別できます (結果はどの血清型にも適しています)。 ZNF595 は、デング出血熱 (DHF) とデング熱 (DF) をより適切に区別できます。上方制御されたオートファジー関連遺伝子は、DHF のメカニズムの理解に貢献します。

この記事の結論を裏付けるデータセットは、Gene Expression Omnibus (GEO) データベース (GSE43777、GSE51808、および GSE28405) で入手できます。

差次的に発現される遺伝子

加重共発現ネットワーク解析

受信機オペレータ特性曲線

遺伝子オントロジー

京都遺伝子・ゲノム大百科

遺伝子セット濃縮分析

曲線下の面積

デング出血熱

デング熱

世界保健機関 WHO

抗体依存性の増強

デング熱ウイルス

ミトコンドリア抗ウイルスタンパク質

デングショック症候群

主成分分析

回復期

急性期初期

急性期後期

国立バイオテクノロジー情報センター

末梢血単核球

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バイオインフォマティクス分析における支援をしていただいた yingde Huang 氏に感謝するとともに、GEO などの公的データベースのヒト医療への貢献に敬意を表したいと思います。

この研究は、CAMS Initiative for Innovative Medicine (2021-I2M-1-036) 財団によって後援されました。中国国家自然科学財団 (31970868); 雲南省の高レベル人材の健康研修プロジェクト (L-2019030); 雲南省科学技術局のイノベーションチームプロジェクト (202105AE160020)。

医学生物学研究所、中国医学科学院および北京連合医科大学、昆明、650118、中華人民共和国

南雄＆孫強明

昆明医科大学、昆明、650500、中華人民共和国

ナン・シオン

重篤な感染症に関するワクチン研究開発の雲南重点研究所、昆明、650118、中華人民共和国

南雄＆孫強明

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孫強明への対応。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

(A – C) PCA は、さまざまな段階を区別できることを示しています。加重共発現ネットワーク分析 (WGCNA)。 (D–F) カットオフ高さを表示します。 (G–I) サンプルのクラスタリング。 (J) DEG 間 (デング出血熱 (DHF) とデング熱 (DF) の間) の LA 段階における共有遺伝子 (CCL2) および 232 個のオートファジー関連遺伝子、および (K) その発現レベル。 DH と DHF 間 (L)、および異なる血清型間 (M) の CD38 および CDKN1C の発現レベルは同様。 S1、血清型 I。 S2、血清型 II。 S3、血清型 III。 S4、血清型 IV。 (C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期)。

3 つの比較グループ間の 4 つの血清型について、トレーニングセット (GLP201 プラットフォームの GSE43777 データセット) の曲線下面積 (AUC) による CD38 および CDKN1C の病期診断値をそれぞれ分析します。 (A) 血清型 I における C 対 EA。 (B) 血清型 I における C 対 LA。 (C) 血清型 I における EA 対 LA。 (D) 血清型 II における C 対 EA。 (E) 血清型 II における C 対 LA。 (F) 血清型 II における EA 対 LA。 (G) 血清型 III における C 対 EA。 (H) 血清型 III における C 対 LA。 (I) 血清型 III における EA 対 LA。 (J) 血清型 IV における C 対 EA。 (K) 血清型 IV における C 対 LA。 (L) 血清型 IV における EA 対 LA。 (C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期)。

テストセット (GLP570 プラットフォームの GSE43777 データセット) の曲線下面積 (AUC) による 3 つの比較グループ間の 4 つの血清型の CD38 および CDKN1C の病期分類診断値をそれぞれ分析します。 (A) 血清型 I における C 対 EA。 (B) 血清型 I における C 対 LA。 (C) 血清型 I における EA 対 LA。 (D) 血清型 II における C 対 EA。 (E) 血清型 II における C 対 LA。 (F) 血清型 II における EA 対 LA。 (G) 血清型 III における C 対 EA。 (H) 血清型 III における C 対 LA。 (I) 血清型 III における EA 対 LA。 (J) 血清型 IV における C 対 EA。 (K) 血清型 IV における C 対 LA。 (L) 血清型 IV における EA 対 LA。 (C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期)。

ヴァイオリンの図とヒートマップは、異なる比較グループにおける免疫細胞の免疫の違いを表示します。 (A) 血清型 I の C ステージと EA ステージ。(B) 血清型 I の C ステージと LA ステージ。(C) 血清型 I の EA ステージと LA ステージ。(D) 3 ステージの血清型 I の免疫差ヒートマップ。 (E) 血清型 II の C 期と EA 期。 (F) 血清型 II の C 期と LA 期。 (G) 血清型 II の EA 対 LA ステージ。 (H) 3 段階の血清型 II の免疫差ヒートマップ。 (I) 血清型 III の C 期と EA 期。 (J) 血清型 III の C 期と LA 期。 (K) 血清型 III の EA 対 LA ステージ。 (L) 3 段階の血清型 III の免疫差ヒートマップ。 (M) 血清型 IV の C 期と EA 期。 (N) 血清型 IV の C 期と LA 期。 (O) 血清型 IV における EA 対 LA ステージ。 (P) 3 段階の血清型 IV の免疫差ヒートマップ。 (C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期)。

CD38 と 22 種類の免疫細胞の間の相関関係 (赤い長方形: 統計的に有意 (P < 0.05))。 (A) 血清型 I の場合。 (B) 血清型 II の場合。 (C) 血清型 III の場合。 (D) 血清型 IV。 (C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期)。

各血清型の曲線下面積 (AUC) によるデング熱の免疫細胞の病期分類診断値を分析します。 (A) 血清型 I の C 段階と EA 段階。(B) 血清型 I の C 段階と LA 段階。(C) 血清型 I の EA 段階と LA 段階。(D) 血清型 II の C 段階と EA 段階。 (E) 血清型 II の C 期と LA 期。 (F) 血清型 II の EA 対 LA ステージ。 (G) 血清型 III の C 期と EA 期。 (H) 血清型 III の C 期と LA 期。 (I) 血清型 III の EA 対 LA ステージ。 (J) 血清型 IV の C 期と EA 期。 (K) 血清型 IV の C 期と LA 期。 (L) 血清型 IV における EA 期と LA 期。 (C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期)。

C 対 EA グループにおける差次的発現遺伝子 (DEG)。 (C、回復期、EA、急性期初期)。

C 対 LA グループにおける差次的発現遺伝子 (DEG)。 (C、回復期、LA、急性期後期)。

EA 群と LA 群における差次的発現遺伝子 (DEG)。 (EA、急性期初期、LA、急性期後期)。

。 EA グループにおけるデング出血熱 (DHF) とデング熱 (DF) の比較から得られる差次的発現遺伝子 (DEG)。 (EA、急性期初期)。

。 LA グループにおけるデング出血熱 (DHF) とデング熱 (DF) の比較から得られる差次的発現遺伝子 (DEG)。（LA、後期急性期）。

。 3 つの比較グループの個々の血清型における差次的に発現される遺伝子の倍率。 (C、回復期、EA、急性期前期、LA、急性期後期)。

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転載と許可

Xiong, N.、Sun, Q. ステージ関連および重症度関連のバイオマーカーの特定と、包括的な分析によるデング熱の免疫状況の探索。 Virol J 19、130 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s12985-022-01853-8

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受信日: 2022 年 1 月 23 日

受理日: 2022 年 7 月 14 日

公開日: 2022 年 8 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-022-01853-8

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