コピー数のバリエーション

Communications Biology volume 6、記事番号: 189 (2023) この記事を引用

733 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

コピー数変異 (CNV) は、先天性心疾患 (CHD) の病因として長い間認識されてきました。コード配列の破壊による用量効果として解釈できる CHD 関連 CNV はほとんどありません。新たな証拠により、心臓の発達における長鎖非コード RNA (lncRNA) の調節的役割が強調されています。一方、CNV内のlncRNA（CNV-lncRNA）がCHD関連CNVの病因に寄与する可能性があるかどうかは未解明のままである。今回我々は、ヒト臓器発生トランスクリプトームデータを用いて、CHD関連CNV内のCNV-lncRNAとタンパク質コード遺伝子を含む共発現ネットワークを構築し、非症候性CHD関連CNVのうち10個のCNV-lncRNAが最も重要な心臓関連モジュールにクラスター化されていることを示した。そして、複数の主要な CHD 遺伝子と高度に相関した共発現を示しました。 15q11.2 領域内の HSALNG0104472 は、心臓に偏った発現を持つハブ CNV-lncRNA として同定され、実験的に検証されました。我々の結果は、HSALNG0104472が、心筋細胞の分化の調節を介して15q11.2欠失の心臓欠陥の原因となる主要なエフェクターであることを示した。我々の発見は、CNV-lncRNA が非症候性 CHD 関連 CNV の最大割合 68.4% (13/19) の病理に潜在的に寄与している可能性があることを示唆しました。これらの結果は、CHD 関連 CNV の病因を説明するには非コード領域を考慮する必要があることを示しました。

先天性心疾患 (CHD) は世界中で最も一般的な先天異常であり、発生率は出生 1,000 人あたり 6 ～ 13 人です 1,2,3。外科的矯正と臨床ケアの進歩により、ほとんどの患者が成人まで生存することが保証されているにもかかわらず、CHD は依然として新生児関連死亡の主な原因となっています。 CHD の病因は多岐にわたります。現在までに、CHD 症例の約 20 ～ 30% が環境要因または遺伝的要因によって特定される可能性がありますが、その数は次世代シーケンス (NGS) などの新しい検査方法の広範な適用により変化する可能性があります 4,5。 CHDコホートに関する最大規模の次世代配列決定研究では、CHD患者の1/3について遺伝的病因を特定できることが示された。 de novo バリアント (DNV) と遺伝性常染色体劣性バリアントは、それぞれ患者の 8% と 2% を占めます6。コピー数変異 (CNV) は、CHD の遺伝的病因の重要な原因です。病原性 CNV は、症候群性 CHD 症例の 3 ～ 25%、孤立性 CHD 症例の 3 ～ 10% で記録されました4。コード配列が関与する CNV の病原性は、通常、遺伝子量に対する影響に基づいて解釈されていました。このような戦略は多くの疾患で成功しているにもかかわらず、ほとんどの CHD 関連 CNV の病態は未解明のままです 4,5,7。

心臓の器官形成は、複数の細胞系統の分化、特定、遊走を含む複雑なプロセスであり、NKX2-5、MESP1、GATA4、GATA6、TBX55などのコア系統決定転写因子（TF）によって初期化され制御される精巧な遺伝子制御ネットワークが必要です。。過去 20 年間にわたり、多くの研究により、非コードゲノムの大部分 (一次転写物と処理された転写物はそれぞれヒトゲノムの 74.7% と 62.1% をカバーする) が転写されたことが明らかになりました 8。長い非コーディング RNA (lncRNA) は、コーディング能力を持たない 200 ヌクレオチドを超える転写物として定義され、発生中の細胞運命を制御する遺伝子制御ネットワークの重要な構成要素として出現します 8,9。心臓血管の発達に関連する lncRNA Braveheart (Bhvt) がマウス 10 で発見されて以来、Fendrr11、Chast12、HBL113、Uph14、Hdn15、BANCR16、lncExACT117 などの数十の lncRNA が細胞および動物モデルにおける心臓の発達プロセスに関与していることが判明しました。 CHD はその高い遺伝的不均一性を特徴としており、そのため病原性 lncRNA の発見はイライラするほど困難でした。さらに、CNVとCHDの強力な関連性を確立した蓄積された証拠の恩恵を受けて、再発性病原性CNVは、lncRNAと疾患表現型を結び付ける天然の供給源を提供している。

ほとんどの CNV は、lncRNA を含むゲノム領域に影響を与えます。 CNV 関連の病因における lncRNA の寄与は、いくつかの神経学的研究で示唆されています。孟ら。は、統合失調症のリスクに関連する 10 個の CNV 領域内の lncRNA を調査し、22q11.2 内の DGCR5 が統合失調症関連遺伝子を制御するハブ遺伝子であることを同定しました 18。 Alinejad-Rokny et al. は、47 の再発性自閉症スペクトラム障害に関連する CNV を特定し、脳に豊富に含まれるコード遺伝子と lncRNA がこれらの領域で過剰に存在することを示しました 19。最近、CHD 発端者 749 名を対象としたトリオベースの全ゲノム配列決定研究により、潜在的に破壊的な調節非コーディング de novo バリアント (DNV) が豊富に存在することが実証され 20、CHD 研究における非コーディングバリアントの重要性が強調されました。メールシャウトら。は、病原性が不明な 138 個の CNV の遡及的再評価を実施し、CNV 関連 CHD の発症における非コード遺伝子調節要素の潜在的な関連性を提案しました 21。一方、CHD の病因に対する CNV 領域に位置する lncRNA (CNV-lncRNA) の寄与は体系的に評価されていません。

我々は、CHD 関連 CNV が CNV-lncRNA のすべてではないにしても一部を破壊し、その結果、標的遺伝子の調節不全を引き起こし、CHD の病因に寄与するのではないかという仮説を立てました。仮説を検証するために、再発性の CHD 関連 CNV を要約し、これらの領域内に位置する候補 CNV-lncRNA を取得しました。このような CNV-lncRNA とタンパク質コード遺伝子の統合共発現プロファイルは、LncExpDB23 からのヒト臓器発生トランスクリプトームデータの加重遺伝子共発現ネットワーク分析 (WGCNA)22 に基づいて構築されました。我々は、心臓組織と有意に相関する 2 つのモジュールを特定し、そのうちの 1 つは既知の CHD 遺伝子の濃縮を示しました。すべての非症候性 CHD 関連 CNV の 52.6% (10/19) からの CNV-lncRNA が最も重要な心臓モジュールにクラスター化していることは注目に値しました。このモジュールのハブ CNV-lncRNA HSALNG0104472 は 15q11.2 領域に位置しており、この領域の欠失は全肺静脈接続異常 (TAPVC) と関連していることが以前に証明されています 24。次に、既知のCHD遺伝子に対するHSALNG0104472の潜在的な調節効果を検証するためにin vitro実験を実施し、心臓の発達におけるHSALNG0104472の潜在的な役割を強調しました（図1）。

19 件の再発性非症候性 CHD と 21 件の症候性 CHD 関連 CNV が要約されました。我々は、LncExpDB からのヒト臓器発生トランスクリプトームデータ (n = 313) に基づいて、これらの領域内に位置し、心臓発生中に発現する候補 CNV-lncRNA を検索しました。 b 重み付け遺伝子共発現ネットワーク解析 (WGCNA) を実行して、ヒト臓器発生トランスクリプトームデータに基づいて CNV-lncRNA とタンパク質コード遺伝子の共発現プロファイルを特徴付けました。経路分析、濃縮分析、および発現差分析を含む下流分析を実行して、CHD 関連モジュールおよびハブ CNV-lncRNA を同定しました。 CNV-lncRNA-miRNA-mRNA 制御ネットワークも、miRNA 相互作用データと競合する内在性 RNA (ceRNA) 分子機構に基づいて同定されました。 c 心臓関連の非症候性黒色モジュールにおける共発現関係は、LncExpDB の in vitro 心筋細胞分化データセット (n = 297) に基づいて検証されました。 d 相対重量分析（RWA）により、いくつかの重要なCHD遺伝子の制御におけるハブCNV-lncRNA HSALNG0104472の強力な役割が明らかになりました。 e インビトロ実験を実施して、ハブCNV-lncRNA HSALNG0104472の予測制御を検証した。

2つの欠失、6つの重複、および11の欠失/重複を含む合計19のCNVが、再発性の非症候性CHD関連CNVとして定義されました（図2a、表1、補足図1a、および補足表1）25、26、27、28。 29、30。基準を満たす合計 568 個の候補 CNV-lncRNA と 19957 個のタンパク質コード遺伝子をさらなる調査に使用しました (補足データ 1)。また、21 の症候群性 CHD 関連 CNV 4 にも分析を拡張しました (補足表 2)。比較すると、ほとんどの症候群性 CHD 関連 CNV (19/21) は欠失であり、他の 2 つの CNV は欠失または重複のいずれかである可能性があります (補足図 1b; 補足表 2)。 4つのCNV（1q21.1欠失/重複、8p23.1欠失/重複、16p12.2欠失/重複、および22q11.21欠失/重複）は、非症候性および症候性CHD症例の両方に関連していた（図2a）。

a ヒト染色体上の再発性非症候性 CHD (n = 19) および症候性 CHD (n = 21) 関連 CNV の分布が示されています。バンドの色は、CNV が報告された CHD 症例タイプを表します。フォントの色は CNV の種類を表します。 b ヒト臓器発生データセット（n = 313）で構築された心臓と正の相関がある（r > 0.6、n = 2）共発現モジュール（黒およびダークグリーンモジュール）が特定されました（補足データ1）。 y 軸は、さまざまな CNV-lncRNA 共発現モジュールを表します。心臓組織に対するピアソン相関係数 (r) の値が x 軸に表示されます。赤い破線は |r| を示します。 = 0.6。ノードのサイズは、各モジュール内の CNV-lncRNA 数を表します。ノードの色は -log10(Padj) の値を表します。調整された P 値は、WGCNA R パッケージの corPvalueStudent 関数を使用して計算されました。 c 心臓と正相関する共発現モジュールの機能的注釈を示します (補足データ 2)。水平バーは GO 用語を表し、バーの色は異なる CNV-lncRNA 共発現モジュールを表します。心臓と正の相関があるモジュールごとに、上位 5 つの GO 用語 (Padj によってランク付け) が y 軸にリストされます。 -log10(Padj) の値が x 軸に表示されます。赤い破線は、Padj が 0.05 であることを示します。 d 黒いモジュールの CNV-lncRNA の分類。 CNV-lncRNA の各クラスの数を括弧内に示します。 e 黒色モジュール内の CNV-lncRNA の配列保存 (補足データ 3)。

LncExpDB からのヒト臓器発生トランスクリプトームデータに対して WGCNA を実行し、候補の非症候性 CHD 関連 CNV-lncRNA およびタンパク質コード遺伝子を含む共発現モジュールを構築しました。合計 43 個の共発現モジュールを同定し、そのうち 34 個には 568 個の候補 CNV-lncRNA のうち 511 個が含まれていました。残りの 57 個の候補 CNV-lncRNA は、どの共発現モジュールにもクラスター化されませんでした (補足データ 1)。さらに、13 モジュールには、モジュールメンバーシップ (MM) ≥ 0.8、P < 0.05 のハブ CNV-lncRNA が少なくとも 1 つ含まれていました (補足データ 1)。次に、モジュールと心臓組織の間のピアソン相関係数を計算しました (サンプルの量子化された形質情報は補足データ 1 にリストされています)。2 つのモジュール (黒とダークグリーン) が有意な正の相関を示したことが明らかになりました (r > 0.6、P < 0.05;図2b)。

2 つの心臓相関共発現モジュールのタンパク質コード遺伝子を使用して、ジーンオントロジー (GO) および京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) 経路による機能強化分析を実施しました。注目すべきことに、心臓と最も有意に相関した黒いモジュール（r = 0.88、P = 3.20 × 10−104）は、筋肉系のプロセス（Padj = 3.35 × 10−47、Padj は調整された P 値を表す）、筋肉に関連していました。収縮 (Padj = 3.55 × 10−42)、心臓のプロセス (Padj = 1.14 × 10−33)、心臓の収縮 (Padj = 1.14 × 10−33)、筋組織の発達 (Padj = 3.04 × 10−32) (図.2c)。これらの遺伝子は、肥大型心筋症 (Padj = 7.62 × 10−13)、拡張型心筋症 (Padj = 1.87 × 10−12)、心筋収縮 (Padj = 1.15 × 10−9)、心筋細胞におけるアドレナリン作動性シグナル伝達の KEGG 経路にも豊富でした。 (Padj = 4.24 × 10−9)、不整脈原性右室心筋症 (Padj = 3.97 × 10−7) (補足データ 2)。黒色モジュールの心臓発生サンプル (n = 50) における CNV-lncRNA の平均発現値も、CNV-lncRNA を含む 34 モジュールの最前線にランクされました (34 個中 3 位、平均 tpm = 7.17; 補足データ 1)。隣接するタンパク質をコードする遺伝子と比較したゲノムの位置に基づいて、lncRNA は遺伝子間、イントロン (センス)、イントロン (アンチセンス)、重複 (センス)、重複 (アンチセンス)、センスおよびアンチセンスに分類できます 31。センス、遺伝子間およびアンチセンス lncRNA は、黒色モジュールの CNV-lncRNA の大部分 (28/30) を占めました (図 2d)。黒色モジュール内の 30 個の CNV-lncRNA の配列保存は、LncBook v2.032 のアラインメントデータに従って特定されました (図 2e; 補足データ 3)。黒いモジュールに含まれる高い割合のCNV-lncRNAは、HAND1、HAND2、NKX2-5、TBX5、GATA6、MYH6などのよく特徴付けられた複数のCHD遺伝子と高度に相関していました（図3a）。これらのlncRNAは、再発性非症候性CHD関連CNVの52.6％（10/19）に分布していた（図3a）。さらに、モジュールと発達段階および性別との相関関係も計算されました（補足図2および補足データ1、2）。 CNV-lncRNAのゲノム遺伝子座および患者の表現型を含む特定の非症候性CHD関連CNV記録に従って、CNV-lncRNAと黒いモジュールのCHDサブタイプとの間の34の潜在的な関連性を特定しました（図3bおよび補足データ4））。

a 非症候性関連 CNV (n = 19)、共発現 CNV-lncRNA (n = 30、10 個の CNV に分布)、および心臓相関黒色モジュールの 12 個の CHD 遺伝子が circos プロットに示されています。 CNV の色は CNV の種類を表します。線の色は、各遺伝子ペアのピアソン相関係数 (ヒト臓器発生データセット、n = 313 を使用して計算) を表します。黒いモジュール内の 2 つのハブ CNV-lncRNA は太字で示されています。 b CNV-lncRNA と黒いモジュールの CHD サブタイプの間の相関関係。これらの関係は、CNV-lncRNA と非症候性 CHD 関連 CNV の交差に基づいて特定されます (補足データ 4)。

心臓相関共発現モジュールと CHD の間の潜在的な関連性を調査するために、4 つの CHD 関連遺伝子リスト (補足データ 5) に対してこれらのモジュールの濃縮分析のための超幾何学的検定を実行しました。症候群性CHD5の単一遺伝子状態に関連する69個の遺伝子セット、CHDの機能喪失（LOF）バリアントを含む66個の遺伝子セット、CHD27の損傷性ミスセンスバリアント（DMV）を含む80個の遺伝子セット。結果は、2 つのモジュール (黒: P = 2.12 × 10−11、およびサケ: P = 0.04) で、単離された CHD 遺伝子が豊富であることを示しました。 2 つのモジュール (ターコイズ: P = 3.97 × 10−6、および白: P = 0.03) は、症候群性 CHD 遺伝子が豊富でした。 3 つのモジュール (ピンク: P = 2.94 × 10−5、黒: P = 1.34 × 10−3、ターコイズ: P = 6.27 × 10−3) は LOF CHD 遺伝子が濃縮され、5 つのモジュール (黒: P = 5.62 × 10−5、ピンク: P = 3.02 × 10−3、ターコイズ: P = 5.35 × 10−3、オレンジ: P = 6.78 × 10−3、およびダークオレンジ: P = 0.05) は、DMV CHD 遺伝子が濃縮されました (補足データ5)。特に興味深いのは、黒と青緑色のモジュールがそれぞれ4つのCHD遺伝子セットのうち3つを大幅に濃縮したことです（図4a〜dおよび補足データ5）。さらに、心臓の発達に関連する特定の数の経路が黒と青緑色のモジュールの両方で大幅に豊富であることがわかり、これらのモジュールと心臓の発達との間に重要な関係があることが示唆されました（図4eおよび補足データ2）。

4 つの CHD 遺伝子セットのうち 3 つを大幅に濃縮した 2 つの心臓関連モジュール (黒と青緑色) が示されています。黒色 (a) および青緑色 (b) の共発現モジュールのハブ CNV-lncRNA および CHD 遺伝子がリストされています (補足データ 1 および 5)。ハブ CNV-lncRNA は赤いエッジで強調表示されます。 CHD 遺伝子のサブセットは異なる色で示されています。ノードのサイズは、対応するモジュールの遺伝子モジュールメンバーシップ値 (MM) を表します (補足データ 5)。超幾何検定を使用して、4 つの CHD 遺伝子セットに対する黒 (c) および青緑色 (d) モジュールの共発現タンパク質コード遺伝子の濃縮に関する統計的有意性を計算しました。 CHD 遺伝子セットは異なる色で示されます。有意な濃縮（PH < 0.05、PH は超幾何 P 値を表す）は、赤いフォントで PH 値で示されています。 WGCNA (n = 19,957) に該当するタンパク質コード遺伝子をバックグラウンド遺伝子リストとして使用しました。 e 黒と青緑色のモジュールの心臓発達関連経路 (補足データ 2)。横軸はGOタームを表します。ドットの色は異なるモジュールを示します。ドットのサイズは、対応する GO 用語に含まれる各モジュールの遺伝子数を表します。 -log10(Padj) の値が x 軸に表示されます。赤い破線は、Padj が 0.05 であることを示します。

競合内因性 RNA (ceRNA) は、lncRNA-miRNA 相互作用によって調節される mRNA 発現の基礎となる重要な分子機構として認識されています。以前に我々は、因果推論法を実装することにより、ファロー四徴症患者の心臓組織における lncRNA-miRNA-mRNA 制御ネットワークの同定に成功しました 33。本研究では、この分析をヒト臓器発生トランスクリプトームデータ (n = 313) にも適用しました。 ceRNAネットワークを媒介する合計10のハブCNV-lncRNAが同定されました（補足図3、補足データ6）。これらの CNV-lncRNA は、黄色のモジュール (HSALNG0063477)、ターコイズ色のモジュール (HSALNG0112753、HSALNG0044817、HSALNG0006725)、灰色の 60 モジュール (HSALNG0022874)、青色のモジュール (HSALNG0110179)、およびオレンジ色のモジュール (HSALNG0022140) に分布しています。 HSALNG0096627、HSALNG0019873、HSALNG0044901 はどの共発現モジュールにもクラスター化されず、灰色でラベル付けされました。一方、既知の CHD 遺伝子はいずれもこれらの ceRNA ネットワークには関与していませんでした。さらに、スポンジ lncRNA-mRNA 制御関係を共有する CNV-lncRNA と mRNA は、同じ共発現モジュールに分布することはほとんどありませんでした (補足データ 1 および 6)。

CHD は症候群として発生することが多く、CHD と他の異常、特に神経発達障害には共通の遺伝的寄与が発見されています。我々は、非症候性および症候性 CHD 遺伝子 (n = 88; 補足データ 7) のうち、13.6% (12/88) が心臓組織で最大の発現を示したことに気づきました。驚くべきことに、33.0% (29/88) が脳および小脳組織で最大発現を示しました (脳: 19、小脳: 10、補足データ 7)。これらの CHD 遺伝子について差次的発現分析が実行され、心臓 (n = 50) と脳 (n = 87) の発生サンプル間の CNV-lncRNA が含まれました (補足図 4)。既知のCHD遺伝子リストで、21個の心臓で上方制御される遺伝子（|log2FoldChange | ≥ 1、Padj < 0.05）と8つの脳で上方制御される遺伝子を見つけました（図5a〜c;補足データ7）。

心臓 (21 遺伝子) および脳 (8 遺伝子) の発生サンプル (心臓サンプル: n = 50、脳サンプル: n = 87) で上方制御された CHD 遺伝子 (|log2FoldChange| ≥ 1、Padj < 0.05) をヒートマップ (a) に示します。。各クラスターについて、統計的に強化された GO Biological Process 用語と Padj がパネルに表示されます。円グラフは、差次的に発現された各 CHD 遺伝子クラスターの関連する CHD タイプを示します (b)。各クラスターの上位の差次的発現 CHD 遺伝子 (c) および CNV-lncRNA (d) は、火山プロットでラベル付けされています (log2FoldChange によってランク付けされています)。 x 軸と y 軸は、それぞれ log2FoldChange (心臓 vs 脳) と -log10(Padj) を表します。赤い点は、心臓で有意に上方制御された遺伝子を表します (log2FoldChange ≥ 1、Padj < 0.05)。青い点は、脳内で有意に上方制御された遺伝子を表します (log2FoldChange ≤ -1、Padj < 0.05)。灰色の点は、差次的に発現しない遺伝子を表します。水平および垂直の赤い破線は、Padj = 0.05 および |log2FoldChange| を示します。 = 1、それぞれ。各クラスターの横の円グラフは、症候群性 WGCNA によって構築された共発現モジュール内の遺伝子の分布を示しています。各クラスターの遺伝子比率が最も高いモジュールのみが色付けされます。

さらに、比較分析のために21の症候群性CHD関連CNVを組み込みました（補足表2）。以前の分析と同じ基準で、19957 個のタンパク質コード遺伝子を含む 1500 個の CNV-lncRNA が WGCNA 用に選択されました (補足データ 1)。症候性および非症候性 CHD のそれぞれのモジュールが特定されました (補足データ 8)。次に、症候群モジュールと 7 つの臓器の間の相関関係をテストしました。 57 個の CNV-lncRNA を含む症候群性の茶色のモジュール (r = 0.73) および 28 個のマゼンタモジュール (r = 0.71) は脳と高く相関し、120 個の CNV-lncRNA を含む症候群性の緑色のモジュール (r = 0.87) は小脳と高く相関しました。 (図6および補足データ8)。症候性の黄色のモジュール (s- yellow) は、非症候性の黒色のモジュールに対応するはずです。 (1) s- yellow モジュールは、心臓組織と最も高い相関を示しました (r_heart = 0.83) (図 2、6)。 (2) 非症候性黒色モジュールの遺伝子の大部分 (84.89%、579/682) は、s-黄色モジュールに出現しました (補足データ 8)。 (3) 2 つのモジュールの遺伝子は同じ機能が強化されました (補足データ 8)。 s-イエローおよびs-ターコイズモジュールにおけるCNV-lncRNAの遺伝子型と配列保存が特定された（補足図5および6;および補足データ1および3）。心臓サンプルと脳サンプルの間で 1500 個の CNV-lncRNA について差次的発現分析も実行されました。我々は、221 個の心臓で上方制御される (|log2FoldChange| ≥ 1) および 205 個の脳で上方制御される CNV-lncRNA を発見しました。 (図5dおよび補足データ7)。 CHD と神経発達障害との関係をさらに調査するために、代表的な自閉症スペクトラム障害関連遺伝子の分布を記述し 35 、症候群の WGCNA モジュールにおけるそれらの濃縮をテストしました。結果は、症候性ターコイズ (P = 7.66 × 10−14)、茶色 (P = 9.18 × 10−7)、およびミディアムパープル 3 (P = 6.96 × 10−4) モジュール内のタンパク質をコードする遺伝子が自閉症スペクトラムで有意に豊富であることを示しました。障害関連遺伝子 (補足データ 9)。非症候性ターコイズ（s-ターコイズに対応）モジュールがCHDと自閉症スペクトラム障害の両方の遺伝子セットを大幅に濃縮したことに注目するのは興味深いことでした（図4dおよび補足データ5および9）。このモジュールには、脳で上方制御されるCNV-lncRNAと症候群性CHD遺伝子が高い割合で含まれており、これらは複数のシステムの発達と幹細胞集団の維持に関連しています（図5および補足データ7）。

45 の共発現モジュールとサンプル特性 (組織タイプ) の間のピアソン相関係数 (r) は、症候性 WGCNA で計算されました (補足データ 8)。有意な相関 (|r| > 0.6、Padj < 0.05) のみがラベル付けされます。色は相関係数の値と方向を表します。 **Padj < 0.01。

上記の分析によれば、HSALNG0104472は、心臓相関非症候性黒色モジュールのハブCNV-lncRNA（非症候性黒色モジュールのモジュールメンバーシップ値= 0.83;補足データ1）として同定され（図2b）、ほとんどの機能を示しました。脳サンプルと比較して心臓サンプルにおける発現の偏り（図5dおよび補足データ7）。相対重量分析（RWA）は、いくつかの重要なCHD遺伝子の調節におけるその強い役割も明らかにしました（図7aおよび補足データ10）。さらに、HSALNG0104472 と CHD 遺伝子の間のこれらの共発現関係のほとんどは、インビトロ心筋細胞分化データセット（n = 297）に基づく人工多能性幹細胞（iPSC）でも観察されました（図7b;補足図7;および補足データ） 11)。

a 非症候性黒色モジュールにおける主要な CHD 遺伝子に対する CNV-lncRNA (n = 30) の相対重みが示されています (補足データ 10)。再スケーリングされた相対重みの値 (各予測変数に起因する基準変数の予測分散のパーセンテージとして、1 つのテストの合計で予測変数の重みを丸め誤差の範囲内で 100% に再スケーリングしたもの) が y 軸に表示され、規制効果を表します。発生中の心臓サンプル (n = 50) における CNV-lncRNA の平均発現値 (100 万あたりの転写産物、tpm) を x 軸に示します。赤い破線は各軸の中間値を示します。赤い点は重要な予測因子を表します。灰色の点は有意でない予測子を表します。 b HSALNG0104472 および 8 つの予測制御 CHD 遺伝子の発現パターンは、ヒト iPSC から心筋細胞への in vitro 分化中の非症候性黒色モジュールで制御されます (n = 297) (補足データ 11)。 x軸とy軸はそれぞれ心筋細胞の分化段階（日）と各段階の平均発現値（tpm）を表す。中心線は中央値を表します。ボックスの限界は、上限と下位の四分位を表します。ひげは 1.5 倍の四分位範囲を表します。点は外れ値を表します。

HSALNG0104472 の過剰発現とノックダウンを成人ヒト心筋細胞株 (AC16) で実施しました。我々の結果は、HSALNG0104472のノックダウンが、血管系発達の調節や血管新生の調節などの経路に富む、1310個のタンパク質コード遺伝子の発現に有意な影響を及ぼした（|log2FoldChange| ≥ 1、Padj < 0.05）ことを示唆しました（補足データ12）。それにもかかわらず、CNV-lncRNAによって調節されると予測されたCHD遺伝子はいずれも示差的発現遺伝子リストには現れなかった(補足データ12)。さらに、HSALNG0104472の過剰発現は、AC16細胞の遺伝子発現に有意な影響を示さなかった（補足図8）。

HSALNG0104472 の shRNA ノックダウンが iPSC で成功し、NKX2-5、ACTC1、および TBX20 の発現が大幅に下方制御されました (補足図 9a および補足データ 13)。対照群（7日目）と比較して、in vitro誘導HSALNG0104472ノックダウンiPSC（9日目）では拍動心筋細胞の発生の遅延が観察されました（補足図10）。 iPSC における HSALNG0104472 の shRNA ノックダウンは、分化した心筋細胞の拍動挙動に有意な影響を与えました (18 日目)。ノックダウングループの拍動頻度は毎分24回であったのに対し、対照グループでは毎分57回であった。 (補足ムービー 1 および 2)。 GATA6 の大幅なダウンレギュレーションが検出されました (補足図 9b および補足データ 13)。心筋細胞分化に対するHSALNG0104472のノックダウン効果は、心筋細胞分化の誘導後のiPSCへの低分子干渉RNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むスマートサイレンサーの形質導入を通じてさらに検証されました（図8a）。心筋細胞マーカーである心臓トロポニンT（cTnT）を使用したフローサイトメトリー分析は、HSALNG0104472のノックダウンが心筋細胞の分化効率を大幅に低下させることを示しました（ P = 0.006;図8b、補足図11〜16、および補足データ13）。また、一過性トランスフェクションによる分化心筋細胞（18 日目）における HSALNG0104472 ノックダウン効果も検証しました。心筋細胞の免疫蛍光アッセイは、心臓トロポニン I (cTnI) の減少と、HSALNG0104472 の減少に起因する成熟心筋サルコメアの欠如を示しました (図 8c)。

a HSALNG0104472 ノックダウングループとコントロールグループについては、ヒト iPSC から心筋細胞への分化中の 3 つの時点が捕捉されました。スケールバー、40μm。 b HSALNG0104472ノックダウングループとコントロールグループについて、心筋トロポニンT（cTnT）を含む心筋細胞（誘導後8日目）の定量を示します（補足図11〜16および補足データ13）。エラーバーは、3 つの生物学的に独立した実験の平均 ± SD を示します。両側スチューデントの t 検定を 2 つのグループ間の比較に使用しました。 **P < 0.01。 c 誘導された心筋細胞における心臓サルコメアマーカーの免疫蛍光。 DAPI (青)、cTnl (赤)、α-アクチニン (緑)。スケールバー、15μm。 cTnl 心筋トロポニン I。

CNV は CHD の重要な原因として長い間認識されていました。 CNV はサイズが広範囲にわたり、常に複数の表現型効果を示すため、CHD に関連する特定の病原性 CNV の関連遺伝子または臨界区間を特定することは依然として困難です4。臨床応用においては、CNV の病原性を解釈するための自然な考え方は、コード配列の破壊から生じる遺伝子量の影響であろう。残念ながら、これまでに、19 の非症候性 CNV のうち 2 つ（22q11.2: TBX1 および 8p23.1: GATA4）のみが、心臓欠陥の原因となる関連タンパク質をコードする遺伝子を含むと記録されていました（表 1）。明らかに、用量感受性タンパク質をコードする遺伝子を同定するこのような戦略は、CNVによって引き起こされるCHDの病因を解明するには十分とは言えません。

タンパク質コード領域はヒトゲノムの約 2% しか占めません。対照的に、ヒトゲノムの合計 60 ～ 70% が転写される可能性があります 8。したがって、CHD 関連 CNV の病因における非コード RNA の影響を調べることは合理的です。過去数年間、lncRNA は心臓の発生過程における遺伝子発現の調整に関与していると考えられてきました。現在の研究では、CNV-lncRNA の潜在的な制御的役割と、CNV によって引き起こされる CHD の病因に対する CNV-lncRNA の寄与を調査しました。 WGCNAを通じて、合計35のCNV-lncRNAを含む2つの心臓組織相関共発現モジュールを特定しました（補足データ1）。機能強化分析により、これらのモジュールが心臓の発達プロセスの重要な要素として認識されている心臓プロセス、筋肉発達、エネルギー代謝などの生物学的プロセスに関連していることが示されました（図2c）。心臓組織と最も高い相関を示した非症候性黒色モジュールには、よく特徴付けられた非症候性 CHD 遺伝子の半分 (11/22、P = 2.12 × 10−11) が含まれていましたが、69 個の症候性 CHD 遺伝子のうち 2 つだけが含まれていました ( P = 0.66)。さらに、黒いモジュールのタンパク質コード遺伝子は、LOF（P = 1.34×10−3）およびDMV（P = 5.62×10−5）CHD遺伝子セットにも富んでいました（図4a、cおよび補足データ5）。、これらは、次世代シーケンスを使用した大規模な希少変異体の発見に従って得られました36。総合すると、これらの結果は、非症候性黒色モジュールが心臓の表現型に影響を与える性質を持っていることを示しました。さらに、再発性非症候性CHD関連CNVの半分以上（52.63％、10/19）は、非症候性黒色モジュール内の複数の重要なCHD遺伝子と共発現する少なくとも1つのlncRNAを包含していた（図3a）。

非症候性黒色モジュールには、2つのハブCNV-lncRNA（15q11.2のHSALNG0104472およびXp11.22のHSALNG0137903）が含まれていました（図4aおよび補足データ1）。相対重み分析（RWA）は、HSALNG0104472が非症候性黒色モジュールで共発現される12個のCHD遺伝子すべての発現の調節に有意に影響を及ぼし、HSALNG0137903がMYH6とSMAD6を除く10個の共発現CHD遺伝子の発現の調節に有意に作用することを示した（図1）。 7aおよび補足データ10)。 15q11.2 の欠失は、神経発達の欠陥に寄与していることが繰り返し報告されていました。しかし、CHD との関連性については議論の余地がありました 37。我々は最近、15q11.2 欠失が CHD24 のまれで重篤な形態である TAPVC と関連していることを明らかにしました。一方、心臓欠陥の原因となる 15q11.2 欠失の重要な遺伝子は不明のままでした。興味深いことに、非症候性黒色モジュールの30のCNV-lncRNAのうち、HSALNG0104472は、脳と比較して発達中の心臓で最も有意に偏った発現を示しました（図5dおよび補足データ7）。次に、HSALNG0104472 の調節効果を調査するために、心筋細胞株で過剰発現およびノックダウン実験を実施しました。 HSALNG0104472 の過剰発現は、AC16 細胞株における遺伝子発現の重大な妨害を引き起こしませんでした。 AC16 における HSALNG0104472 のノックダウンにより、血管新生の正の制御、血管系発達の正の制御、および血管系発達の制御などの経路に関与する下方制御された遺伝子を同定しました。それにもかかわらず、HSALNG0104472 と非症候性黒色モジュールで同定された CHD 遺伝子との共発現関係を明確に検証することはできませんでした (補足データ 12)。このような矛盾は、共発現モジュールが発生データセットに基づいて構築されたのに対し、AC16 は成人のヒト心筋細胞株を表すという事実に起因すると推測しました。 iPSC-心筋細胞分化システムを使用したさらなる検証により、CHD遺伝子に対するHSALNG0104472の段階特異的調節効果が示されました（iPSCではNKX2-5、ACTC1、TBX20、分化心筋細胞ではGATA6、補足図9）。 15q11.2 欠失領域には、主に 4 つのタンパク質コード遺伝子、TUBGCP5、CYFIP1、NIPA1、および NIPA2 が含まれます。この研究では、発生期の心臓組織と脳組織の間の遺伝子発現差分析により、NIPA1が発生期の脳組織で優先的に発現されるのに対し、他の3つの遺伝子は有意な発現差を示さなかったことが示されました（補足データ7）。 TUBGCP5 と NIPA1 のみが胎児心臓で発現していると報告されているため、我々は以前に TUBGCP5 ノックアウト iPSC を作成し、TUBGCP5 の減少が心筋細胞の分化に影響を与えることを証明しました 24。今回、我々は、CNV-lncRNA HSALNG0104472が発生中の心臓組織で特異的に発現し、その減少が心筋細胞の分化により深刻な影響を与えることを証明した。したがって、HSALNG0104472 は、15q11.2 欠失に起因する心臓欠陥に対する主要なエフェクターであるはずです。

多数の新規 CHD 遺伝子の最近の発見は、CHD コホートに対する大規模な次世代シーケンスの適用の恩恵を受けました。これらの遺伝子のほとんどの証拠 (LOF および DMV 遺伝子セット、補足データ 5 にまとめられている) は稀な変異体に関連しているため、これらの遺伝子にはより多くの共発現モジュールが豊富に含まれていると考えられます。したがって、次世代シークエンシングに基づく希少変異体の発見により、CHD の遺伝的病因についての知識が著しく広がりました。このような結果は、CHD の普遍的な遺伝的不均一性とも一致していました。症候性および非症候性 CHD 遺伝子セットもさまざまなモジュールで濃縮されており、症候性および非症候性 CHD の根底にある分子基盤の相違を示唆しています（図 4 および補足データ 5）。したがって、我々は、症候群性 CHD 関連 CNV 内の lncRNA まで分析を拡張しました。非症候性 CHD と比較して、症候性 CHD 関連 CNV のほとんどすべてが欠失でした 4。一般に、削除は重複よりも有害であるはずです4。一方で、かなりの数の再発性欠失症候群では、浸透率の低下または高い臨床的ばらつきが見られました7。症候性 CHD 関連 CNV には、より多くの lncRNA とハブ CNV-lncRNA が含まれており、これらは非症候性 CHD の 2 倍以上 (29/13) 多くのモジュールに関与していました (補足データ 1 および 8)。心臓および脳の発生サンプルにおける88個の症候性および非症候性CHD遺伝子およびCNV-lncRNAの遺伝子発現差解析を通じて、心臓および脳でそれぞれ上方制御されている21個および8個の遺伝子を同定した。心臓で上方制御される遺伝子は心臓の発達に関連し、脳で上方制御される遺伝子は複数のシステムの発達に関連していました（図5a〜c）。驚くべきことに、心臓上方制御されるタンパク質コード遺伝子とCNV-lncRNAの両方は、非症候性黒色モジュールに対応するs黄色モジュールに最も富んでいました（図5c、dおよび補足データ7）。最大のターコイズモジュールは、症候群性のCHD、LOF、およびDMV CHD遺伝子セットに富んでいました（図4b、dおよび補足データ5）。我々は、脳の上方制御された症候群性CHD関連CNV-lncRNAの大部分が、対応する（s-ターコイズ）モジュールにクラスター化されていることを明らかにしました（図5dおよび補足データ7）。自閉症スペクトラム障害は、CHD と共通の遺伝的基盤を持つ神経発達障害に相当します。症候性共発現モジュールで自閉症スペクトラム障害遺伝子をテストしました（補足データ9）。まとめると、これらの発見は、神経発達欠陥を伴う症候群性 CHD の病因におけるターコイズ (s-ターコイズ) モジュール内の CNV-lncRNA の重要性を強調しました。

環境要因は CHD 症例の最大 30% に関連している可能性がありますが、単独の環境原因が特定できるのは 2% の症例のみです4。原因不明の CHD 症例のほとんどは、遺伝的要因と環境要因の相互作用によって引き起こされ、エピジェネティックな調節因子によって調節されている可能性があることが示唆されています。 lncRNA が心臓の発達に関与しているという証拠が増えていることは、CHD の根底にある lncRNA の調節不全を真剣に考慮する必要があることを示唆しています。 mRNA や miRNA とは対照的に、lncRNA は配列と発現レベルの観点から急速に進化しました。ただし、それらの組織特異性は多くの場合保存されています。 LncRNA は、シスまたはトランスで遺伝子発現を抑制または活性化する可能性があります。私たちの分析によると、ほとんどのCNV-lncRNAは、対応するCNV領域外の既知のCHD遺伝子と高度に相関しており（図3a）、したがってトランスで機能しています。機械的には、lncRNA はシグナル伝達 lncRNA、デコイ lncRNA、ガイド lncRNA、足場 lncRNA、およびエンハンサー lncRNA として分類できます。以前、我々はCHD33を用いて心臓組織におけるlncRNA-miRNA-mRNA遺伝子制御ネットワークの構築に成功した。本研究では、lncRNA-miRNA-mRNA制御ネットワークを駆動する可能性があるハブCNV-lncRNAも特定しました（補足図3）。ただし、既知の CHD 遺伝子リストには標的 mRNA はありませんでした (補足データ 5)。

CNV の病原性は、コード配列の破壊による遺伝子量への影響に基づいて解釈されるのが最も一般的であり、このアプローチはメンデル病における CNV の原因遺伝子の発見に応用され成功しています 7。このような戦略の成功にもかかわらず、ほとんどの CHD 関連 CNV の病態は長い間未解明のままでした。ほとんどの CNV は lncRNA のゲノム領域にも影響を与えるため、制御性 lncRNA が関与する発病メカニズムを真剣に検討する必要があります。驚くべきことに、心臓組織と最も有意に相関するモジュール（非症候性黒色モジュール）のみを考慮したとしても、非症候性 CHD 関連 CNV の半分以上（52.6%、10/19）には、高い相関を示す少なくとも 1 つの lncRNA が含まれていました。複数の重要なCHD遺伝子との共発現と相関（図3a）。前述の 10 個の lncRNA 含有 CNV のうち、1q21.1、2q24.1、2q35、2q37.1、8p23.1、および 13q14.11 には、ceRNA 機構に関与するハブ lncRNA も含まれています。これらのCNVとは別に、他の3つの非症候性CHD関連CNV（5q31.1、16p12.2、および16q23.1）にも、ceRNA分析に関与するハブlncRNAが含まれていました（図3aおよび補足データ6）。 CHD 遺伝子は ceRNA ネットワークのハブ lncRNA の標的として同定されませんでしたが、心臓の発達における遍在的な調節役割のため、ceRNA 機構の影響を無視することはできませんでした 38。合計すると、CNV-lncRNA は、非症候性 CHD 関連 CNV の最大割合 68.4% (13/19) の病理に寄与する可能性があります (図 3a、表 1、および補足データ 6)。

私たちの研究にはいくつかの限界があるため、さらなる調査が必要です。まず、CNV に起因する CHD 症例を説明できる原因となる lncRNA を共発現ネットワークから同定する必要があり、これがこの研究の本来の動機でもありました。第二に、分析では 4 つの既知の CHD 遺伝子セットを使用しました (補足データ 5)。 CHD 遺伝子リストがまだ増加していることを考えると、結果は不完全である可能性があります。さらに、分析を簡素化するために mRNA と CNV-lncRNA をモジュールにグループ化しましたが、CNV-lncRNA と mRNA は時間的および空間的に複雑なモジュール間相互作用を持っている可能性があります。例えば、ハブ CNV-lncRNA HSALNG0104472 は、既知の CHD 遺伝子に対する一貫性のない調節効果が iPSC および分化心筋細胞で観察されました (つまり、NKX2.5、ACTC1、および TBX20 の転写レベルは iPSC で下方制御されましたが、分化心筋細胞では下方制御されませんでした)。 HSALNG0104472の段階固有の役割を示しました（補足図9および補足データ13）。最後に、詳細なメカニズムの調査が不足していることが、この研究の限界です。まとめると、我々は、CNV-lncRNA が十分に確立された CHD 遺伝子の発現パターンを制御する可能性があるという証拠を提供しました。 CHD における分子メカニズムを明らかにするには、多次元データセットの統合が必要です。しかし、CHDにおけるCNV-lncRNAの調節的役割を完全に明らかにするには、さらなる研究がまだ必要である。このような目標を達成するには、細胞および in vitro/in vivo モデルの改善に加え、臨床遺伝データの蓄積が必要となるはずです。 CNV-lncRNA のほとんどは進化的に保存されていないため、心臓オルガノイドなどの in vitro モデルが、CNV-lncRNA の分子機構についての洞察を提供する潜在的なツールとして浮上しています。

結論として、lncRNAがCHDを引き起こすCNVの病原性に寄与しているかどうかを調べるために、ヒト臓器発生データを使用してCHD関連CNV-lncRNAとタンパク質コード遺伝子の共発現ネットワークを構築しました。我々の結果は、既知の CHD 遺伝子が、非症候性および症候性 CHD 関連 CNV 領域内の複数の lncRNA によって制御されている可能性があることを示唆しました。非症候性 CHD 遺伝子がほとんど豊富な非症候性黒色モジュールについて、15q11.2 領域内のハブ CNV-lncRNA HSALNG0104472 の制御的役割を検証しました。 HSALNG0104472 は、心筋細胞の分化の調節を通じて 15q11.2 欠失の心臓欠陥の原因となる主要なエフェクターであることが明らかになりました。我々の結果は、CHD 関連 CNV の病原性に対する lncRNA の潜在的な寄与を強調しました。

我々は、CHD 関連 CNV の病原性に対する lncRNA の潜在的な寄与を明らかにすることを目的としました。非症候性および症候性の CHD 関連 CNV は、それぞれ CHDGKB39 および CHD4 に関する最近のレビューから取得されました。まず、少なくとも 3 例で報告された再発性の非症候性 CNV に分析を限定しました。我々は、LncExpDB23 からのヒト臓器発生トランスクリプトームデータ (n = 313) を使用して、568 の非症候性 CNV-lncRNA と 19,957 のタンパク質コード遺伝子の共発現ネットワークを構築しました。 313 サンプルすべての遺伝子発現行列 (tpm 値) が WGCNA に使用され、CNV-lncRNA が関与する堅牢な共発現関係の特定が可能になりました。

非症候性CHDと症候性CHDの違いの根底にある分子基盤を明らかにするために、1500の非症候性および症候性CHD関連CNV-lncRNAを使用して別のWGCNAを実行しました。また、脳 (n = 87) と心臓 (n = 50) のサンプル間で差次的に発現する CHD 遺伝子と CNV-lncRNA も同定しました。

同定された WGCNA モジュールは、WGCNA R パッケージにより、性別、発育段階、および 7 つの臓器と相関していました。私たちは主に、心臓組織と有意に相関するモジュールに焦点を当てました。 15q11.2 内のハブ CNV-lncRNA である HSALNG0104472 は、複数の主要な CHD 遺伝子との高い共発現および相関を示しました。次に、心筋細胞における潜在的な調節効果を検証するために一連の細胞実験を実施しました。

iPSC 株は、我々の以前の研究で健康な女性から生成されました 24。参加者からインフォームドコンセントを得た。 SCMC の倫理委員会はこの研究を審査し、承認しました (SCMCIRB-K2022182-1)。人間の参加者が関与する研究で行われるすべての手順は、機関および/または国の研究委員会の倫理基準、および 1964 年のヘルシンキ宣言およびその後の修正に相当する倫理基準に従っていました。

非症候性 CNV は CHDGKB39 から収集されました。再発性 CNV は臨床的な意味がはるかに大きいため、少なくとも 3 件の症例で報告された 19 件の CNV のみを分析に使用しました (表 1)。さらに、比較分析のために、最近のレビュー 4 から 21 件の症候群性 CNV が要約されました。 50 個の心臓発生サンプルにおいて最大発現値 (100 万あたりの転写数、tpm) ≥ 1 でこれらのゲノム領域にマッピングされた注釈付き lncRNA 23、31 は、心臓発生中に発現するとみなされました。 CNV-lncRNA の検索には BEDTools v2.29.2 を使用しました40。 LncExpDB によって提供された 313 個のヒト臓器発生組織サンプルのこれらの遺伝子を含む処理された遺伝子発現データを共発現解析に使用しました。 R パッケージ WGCNA v1.7022 は、共発現ネットワークの構築とモジュールの識別に使用されました。ピアソン相関を使用して、ペアごとの遺伝子発現相関およびモジュール特性相関を計算しました。モジュール特性相関の場合、調整された P 値は、WGCNA R パッケージの corPvalueStudent 関数を使用して計算されました。共発現ネットワーク構築のためのパワー値は６に設定した。 blockwiseModules 関数のパラメーターは次のとおりです: maxBlockSize = 6000、TOMType = "unsigned"、minModuleSize = 30、reassignThreshold = 0、mergeCutHeight = 0.25、numericLabels = T、および pamRespectsDendro = F。モジュールメンバーシップ (MM) 値。遺伝子/lncRNA と対応するモジュール eigengene の間の相関関係の推定値として使用され、ハブ CNV-lncRNA を定義するために使用されました。各モジュールのタンパク質コード遺伝子は、R パッケージclusterProfiler v3.1041 を使用した、ジーンオントロジー (GO) 濃縮分析および京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) 経路濃縮分析の入力として使用されました。

LncBook25、NPInter42、miRTarBase43、および TarBase44 から、598537 個の lncRNA-miRNA および 331604 個の miRNA-mRNA 相互作用の証拠を取得しました。相互作用の証拠と心臓発生サンプル (n = 50) の遺伝子発現データを統合し、LncmiRSRN v3.034 を使用して lncRNA-miRNA-mRNA 制御ネットワークを構築し、非症候群性 CHD 関連の病原性に対する ceRNA 機構の寄与を推定しました。 CNV。

私たちの研究室24で健康な女性から生成されたiPSC株は、心筋細胞の分化実験に使用されました。 iPSC (1 × 106) を、Matrigel (BD Bioscience、ハイデルベルク、ドイツ) でプレコートした 6 ウェルプレートに接種しました。 iPSC を播種し、E8 培地で培養しました。 iPSCが80％〜90％のコンフルエンスに達したら、CardioEasyキット（Cellapybio、北京、中国）を使用してプロトコルに従ってin vitro誘導心筋細胞分化を実行しました。心筋細胞の分化効率をフローサイトメトリーで定量化した（「心筋細胞の分化効率の評価」のセクションを参照）。

免疫蛍光染色では、細胞を 4% パラホルムアルデヒドを含む PBS で室温で 20 分間固定しました。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を５％ウシ血清を含むＰＢＳで３０分間ブロックした。一次抗体による染色: ブロッキングバッファーで希釈した心筋トロポニン I (cTnI) (RRID: AB_2532494、ThermoFisher、Waltham、MA、USA)、α-アクチニン (RRID: AB_2692251、ThermoFisher、Waltham、MA、USA) を、気温-4℃。細胞核を検出するために DAPI で染色した後、翌日に二次抗体を使用しました。蛍光画像は、レーザー共焦点顕微鏡 (Leica TCS SP8) を使用して取得されました。

プロトコルに従って、TRIzol 試薬 (Ambion、米国テキサス州オースティン) を使用して全細胞 RNA を単離しました。 RNA 濃度と完全性は、Agilent Bioanalyzer 2100 システムを使用して測定されました。 RIN ≥ 7 のサンプルは、シーケンシングライブラリの構築に適格とされました。 BGI プラットフォーム用のアダプターを備えた Illumina 用 mRNA-seq Lib Prep Kit (ABclonal Technology Co.、武漢、中国) を使用して、シーケンシングライブラリーを調製しました。シーケンスは DNBSEQ-T7 で実行されました。データは次のように処理されました: FastQC v0.11.9 (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc) および Trim Galore v0.6.6 (https://github. com/FelixKrueger/TrimGalore)、SortMeRNA v4.3.445 による rRNA の除去、STAR v2.7.1046 によるアラインメント、Subread パッケージ v2.0.3 に実装されている featureCounts47 によるリードカウント、DESeq2 v1.3248 による差次的発現解析および主成分解析、および関数clusterProfiler v3.1041 を使用したエンリッチメント分析。差次的発現分析では、遺伝子 raw カウントを DESeq2 v1.3248 の rlog 関数で正規化しました。

LncExpDB23 からの遺伝子発現データは、発生サンプルの元のデータセット (n = 313、脳: 55、小脳: 59、心臓: 50、腎臓: 40、肝臓: 50、卵巣: 18、および精巣: 41) ArrayExpress (E-MTAB-6814) から収集。組織サンプリングは受胎後 4 週間で開始し、受胎後 14、15、および 17 週間を除き、受胎後 20 週まで毎週サンプリングしました。出生後の組織は、新生児、乳児（6 ～ 9 か月）、幼児（2 ～ 4 歳）、学齢期（7 ～ 9 歳）、十代の若者（13 ～ 19 歳）、および成人（約 65 歳）としてサンプリングされました。腎臓の発達は 8 歳までサンプリングされ、卵巣の発達は出生前にのみサンプリングされました 49。

LncExpDB23 からの in vitro 心筋細胞分化の処理されたトランスクリプトームデータ (n = 297) を使用して、WGCNA によって同定された非症候性黒色モジュールにおける CNV-lncRNA と CHD 遺伝子の間の高度に相関した共発現関係を検証しました。元のデータは、アクセッション GSE122380 の下で Gene Expression Omnibus (GEO) から収集されました。元のデータは、ヨルバ HapMap 集団の 19 人からの iPSC 株の心筋細胞分化から生成されました50。

人間の臓器発生データのサンプル特性は、LncExpDB23 から収集されました。サンプルのカテゴリ変数 (性別と組織) は 1 と 0 に量子化されました。性別の場合、男性は 1 に量子化され、女性は 0 に量子化されました。7 つの臓器 (心臓など) の場合、心臓サンプルは 1 に量子化され、他のサンプルは量子化されました。サンプルの連続変数 (発育段階) は、次のルールに従って週に量子化されました: 胚サンプル (出生前) の場合、発育段階の値は、受胎後何週目であるかに等しくなります (たとえば、胚が産まれてきた場合、生後 10 週間で、値は 10 でした)。出生後に収集されたサンプルの場合、発達段階の値は 40 (ヒトの妊娠推定値 40 週) に年齢 (週数) を加えたものと等しくなります。 1 年は 52 週間、1 か月は 1/12 年、1 週間は 7 日として計算されました。 (たとえば、生後 6 か月のサンプルの発達段階値は 40 + 6/12 × 52 = 66、生後 7 日のサンプルの発達段階値は 40 + 7/7 = 41 でした。 ) (補足データ 1)。

再発性の非症候性 CHD 関連 CNV の詳細（CHD サブタイプを含む）は CHDGKB39 から収集されました。特定の CNV 座標情報を含まない CNV レコードをフィルターした後、UCSC (http://genome.ucsc.edu) のリフトオーバーツールを使用して、各 CNV レコードの元の座標が hg38 アセンブリに変換されました。すべての CNV-lncRNA (hg38 アセンブリ) の座標は LncExpDB23 から取得されました。座標の交点を取得して、CNV-lncRNA と CHD サブタイプの間の関連性を特定しました。

ドライバー分析としても知られる相対重量分析 (RWA) を、RWA Web および R package52 を使用して実行し、非症候性黒色モジュール内の主要なドライバー CNV-lncRNA を特定しました。各 RWA 分析では、CHD 遺伝子が応答変数として使用され、CNV-lncRNA が予測変数として使用されました。 R2 は、応答変数に対する予測変数のグループの寄与を推定しました。信頼区間に 0 が含まれていない場合、相対的な重みは有意であると示されます。それ以外の場合、相対的な重みは互いに有意差はありませんでした。詳細については、RWA Web をご覧ください。

過剰発現実験では、HSALNG0104472 の完全長転写産物 (HSALNT0217290) をレンチウイルスベクター PCDH-CMV-MCS-EF1a-gfp-T2A-puro にクローン化し、空のベクターを対照として使用しました。 shRNA を使用した安定したノックダウン実験では、HSALNG0104472 転写物を標的とする相補配列 (AGGGAACCAGCTTCAGAACTCAAGAGGTTCTGAAGCTGGTTCCCTTTTTTT) をレンチウイルスベクター pLVX-shRNA2-zsGreen-PGK-puro に挿入しました。対応するスクランブルシーケンス (CGTATACCCGGAACAAAGGTCAAGAGCCTTTGTTCCGGGTATACGTTTTTT) をコントロールとして使用しました。構築したレンチウイルスプラスミドを、リポフェクタミン2000（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド）によりパッケージングプラスミドpsPAX2およびpMD2・GとともにそれぞれHEK293細胞にトランスフェクトし、ウイルスを産生した。ピューロマイシン処理を数日間行った後、AC16/iPSCをレンチウイルスに感染させ、過剰発現細胞株とノックダウン細胞株を取得しました。ノックダウン実験は、スマートサイレンサー（中国広州のRiboBioによって合成された、HSALNG010447を標的とする低分子干渉RNAとアンチセンスオリゴヌクレオチドの混合物）を用いた一過性トランスフェクションを通じても繰り返されました。スマートサイレンサーは、リポフェクタミン RNAiMAX (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) で iPSC または心筋細胞にトランスフェクトされました。サイレンサーの配列は補足表 3 にリストされています。

合計 1 μg の細胞 RNA を、PrimeScript RT 試薬キット (Takara、大連、中国) による cDNA 調製のテンプレートとして使用しました。定量的逆転写 qPCR (RT-qPCR) は、CFX 96 リアルタイム PCR 検出システム (Bio-Rad Laboratories, Inc.、カリフォルニア州ハーキュリーズ、アメリカ）。相対遺伝子発現レベルは、2-ΔΔCt 法に基づいて計算されました。各グループに対して少なくとも 3 つの生物学的に独立した実験が実施されました。 GAPDH を内部参照遺伝子として使用しました。 RT-qPCR プライマーペアを補足表 4 に示します。

フローサイトメトリーを使用して、心臓特異的タンパク質である心臓トロポニン T (cTnT) を発現する細胞の数を測定することにより、心筋細胞の相対収量と細胞分化の効率を評価しました。心臓トロポニン T ポリクローナル抗体 PE 結合体 (カタログ番号: #C90559PE) を使用して、心筋細胞を標的にしました。サンプルを調製するには、穏やかな消化酵素で心筋細胞を 5 分間消化します。等量の細胞培養液を加えて反応を停止します。 25 °C、800 × g で 5 分間遠心分離し、PBS で細胞を再懸濁し、同じ手順で細胞を 2 回洗浄します。前処理サンプルから 1 × 106 細胞を 1 テストにつき 5 ml アッセイチューブに 100 ul ずつ分取します。心臓トロポニン T ポリクローナル抗体 PE 結合体を適切な希釈率 (1:100) でアッセイチューブに加えます。 37℃で1時間インキュベートします。２〜３ｍｌの洗浄緩衝液（０．１％ＦＢＳを含むＰＢＳ）中で遠心分離により洗浄する。細胞を 0.3 ～ 0.5 ml の PBS に再懸濁し、フローサイトメーターで分析します。 BD FACSCanto™ フローサイトメーターは心筋細胞分化アッセイに使用されました。細胞のパーセンテージは、BD FACSDiva™ v8.0.1 ソフトウェアによって評価されました。陽性および陰性画分の存在量は、ソート後の細胞計数によって決定されました。ゲート戦略は補足情報に示されています（補足図10）。

調整された P 値 < 0.05 の閾値を差次的遺伝子発現解析に使用しました。 P 値は、Benjamini-Hochberg 法を使用した複数のテスト用に調整されました。超幾何検定を使用して、共発現モジュールにおける既知の CHD 遺伝子の濃縮の重要性を推定しました。両側スチューデント t 検定を 2 つのグループ間の比較に使用しました。各グループに対して少なくとも 3 つの生物学的に独立した実験が実施されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付ける、AC16 心筋細胞における HSALNG0104472 の過剰発現およびノックダウン実験の RNAseq 生データは、GEO: GSE201076 で公開されています。すべてのデータは本文または補足資料で入手できます。 HSALNG0104472 の過剰発現およびノックダウン用のプラスミドは、Addgene に寄託されています (197902、197989、および 197991)。

GBD 2017 先天性心疾患の協力者。先天性心疾患の世界的、地域的、および国家的負担、1990 年から 2017 年：世界的疾患負担調査 2017 の系統的分析。Lancet Child Adolesc。ヘルス 4、185–200 (2020)。

記事 Google Scholar

Liu、Y.ら。 1970年から2017年の先天性心疾患の世界的な出生有病率：260件の研究の系統的レビューとメタ分析を更新。 Int J. Epidemiol. 48、455–463 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Leirgul、E. et al. 1994 年から 2009 年までのノルウェーにおける先天性心疾患の出生有病率 – 全国調査。午前。 Heart J. 168、956–964 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

ピアポント、メイン他先天性心疾患の遺伝的根拠: 再考: 米国心臓協会の科学的声明。回覧 138、e653–e711 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Nees, SN & Chung, WK ヒト先天性心疾患の遺伝的基礎。コールドスプリングハーブ。視点。バイオル。 https://doi.org/10.1101/cshperspect.a036749 (2020)。

ジン、SCら。 2,871 人の先天性心疾患発端者における稀な遺伝性および新規変異の寄与。ナット。ジュネット。 49、1593–1601 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spielmann, M.、Lupianez, DG & Mundlos, S. 3D ゲノムの構造変異。ナット。ジュネ牧師。 19、453–467 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Djebali, S. et al. ヒト細胞における転写の風景。 Nature 489, 101–108 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Batista, PJ & Chang, HY 長い非コーディング RNA: 発生と疾患における細胞のアドレスコード。セル 152、1298–1307 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カリフォルニア州クラッテンホフほか。 Braveheart、心血管系統の関与に必要な長い非コード RNA。セル 152、570–583 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grote, P. et al. 組織特異的 lncRNA Fendrr は、マウスの心臓および体壁の発達に必須の調節因子です。開発者セル 24、206–214 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Viereck、J.ら。長いノンコーディング RNA Chast は心臓リモデリングを促進します。科学。翻訳。医学。 8、326ra322 (2016)。

記事 Google Scholar

Liu, J.、Li, Y.、Lin, B.、Sheng, Y. & Yang, L. HBL1 は、MIR1 に対抗することによって多能性幹細胞からの心筋細胞の発生を調節するヒトの長い非コード RNA です。開発者セル 42、333–348 e335 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アンダーソン、KM et al. ノンコーディング RNA の転写は Hand2 の発現と心臓の発達を制御します。ネイチャー 539、433–436 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リッター、N.ら。 lncRNA 遺伝子座は心臓遺伝子プログラムを制御しており、マウスの初期発生に不可欠です。開発者セル 50、644–657.e648 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ウィルソン、KDら。内因性レトロウイルス由来の lncRNA BANCR は、ヒトおよびヒト以外の霊長類の心筋細胞の遊走を促進します。開発者セル 54、694–709.e699 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、Ｈら。 lncExACT1 および DCHS2 は、生理学的および病理学的な心臓の成長を制御します。循環。 https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.121.056850 (2022)。

Meng, Q. et al. DGCR5 の長い非コード RNA は、いくつかの統合失調症関連遺伝子の発現を調節している可能性があります。科学。翻訳。医学。 https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aat6912 (2018)。

Alinejad-Rokny, H.、Heng、JIT、Forrest、ARR 脳に豊富に含まれるコーディング RNA 遺伝子と長い非コーディング RNA 遺伝子は、再発性神経発達障害 CNV で過剰に存在します。 Cell Rep. 33、108307 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リヒター、F.ら。ゲノム分析は、先天性心疾患に非コーディングのde novo変異が関与していることを示唆しています。ナット。ジュネット。 52、769–777 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

メールシャウト、I. et al. 先天性心疾患におけるコピー数変異の再評価: 全ゲノムの描写。ジーン（バーゼル）。 https://doi.org/10.3390/genes12071048 (2021)。

Langfelder, P. & Horvath, S. WGCNA: 重み付け相関ネットワーク分析用の R パッケージ。 BMCバイオインフォーム。 9, 559 (2008)。

記事 Google Scholar

リー、Ｚら。 LncExpDB: ヒト長鎖非コード RNA の発現データベース。核酸研究所 49、D962–D968 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、Ｘら。 15q11.2 欠失は、肺静脈接続全体に異常がある患者に多くみられます。 J.Med. ジュネット。 https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2019-106608 (2020)。

Soemedi、R. et al. 散発性先天性心疾患のリスクに対する世界的に稀なコピー数変異の寄与。午前。 J. ハム。ジュネット。 91、489–501 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

シルバーサイド、CKら。ファロー四徴症の成人におけるまれなコピー数の変動は、新たなリスク遺伝子経路に関係しています。 PLoS ジュネット。 8、e1002843 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xie、L.ら。先天性肺閉鎖症患者におけるまれな新規コピー数変異。 PLoS ONE 9、e96471 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

グレスナー、JT 他。一塩基多型アレイとエクソーム配列データの統合分析による、先天性心疾患における新規コピー数変異の頻度の増加。円解像度 115、884–896 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sanchez-Castro、M. et al. 先天性心疾患におけるまれなコピー数バリアントの検索により、新規候補遺伝子と、大動脈狭窄患者における FOXC1 の潜在的な役割が特定されました。円心臓血管。ジュネット。 9、86–94 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

コステイン、G.ら。ゲノム全体にわたる稀なコピー数の変異は、大動脈の転位の遺伝的リスクに寄与します。内部。Ｊ．カーディオール． 204、115–121 (2016)。

論文 PubMed Google Scholar

マ、L.ら。 LncBook: ヒト長鎖非コーディング RNA の厳選された知識ベース。核酸研究所 47、D128–D134 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リー、Ｚら。 LncBook 2.0: ヒト長鎖非コーディング RNA とマルチオミクスアノテーションを統合します。核酸研究所 https://doi.org/10.1093/nar/gkac999 (2022)。

Zhang、X.ら。 FGD5-AS1 は、先天性心疾患遺伝子を転写的およびエピジェネティックに制御するファロー四徴症の心臓におけるハブ lncRNA ceRNA です。フロント。セル開発バイオル。 9、630634 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, J.、Liu, L.、Li, J. & Le, TD LncmiRSRN: ヒト癌における長い非コーディング RNA 関連 miRNA スポンジ制御ネットワークの同定と分析。バイオインフォマティクス 34、4232–4240 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

エイブラハムズ、BS 他。 SFARI Gene 2.0: 自閉症スペクトラム障害 (ASD) に関するコミュニティ主導の知識ベース。モル。自閉症 4、36 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Morton, SU、Quiat, D.、Seidman, JG & Seidman, CE 先天性心疾患のゲノムフロンティア。ナット。カーディオール牧師。 19、26–42 (2022)。

論文 PubMed Google Scholar

Zhao、W.ら。単純性から中等度の先天性心疾患を有する成人におけるコピー数バリアントの高解像度分析。午前。 J.Med. ジュネット。 A 161A、3087–3094 (2013)。

論文 PubMed Google Scholar

Alexanian, M. & Ounzain, S. 心臓発達における長い非コード RNA。コールドスプリングハーブ。視点。バイオル。 https://doi.org/10.1101/cshperspect.a037374 (2020)。

ヤン、L.ら。 CHDGKB: 非症候性先天性心疾患に関連する遺伝的変異を体系的に理解するための知識ベース。データベース (オックスフォード)。 https://doi.org/10.1093/database/baaa048 (2020)。

Quinlan、AR & Hall、IM BEDTools: ゲノムの特徴を比較するための柔軟なユーティリティスイート。バイオインフォマティクス 26、841–842 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu、G.、Wang、LG、Han、Y.、He、QY クラスタープロファイラー: 遺伝子クラスター間で生物学的テーマを比較するための R パッケージ。オミックス 16、284–287 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hao、Y.ら。 NPInter v3.0: ノンコーディング RNA 関連相互作用のアップグレードされたデータベース。データベース (オックスフォード)。 https://doi.org/10.1093/database/baw057 (2016)。

Chou, CH et al. miRTarBase update 2018: 実験的に検証されたマイクロRNAとターゲットの相互作用のリソース。核酸研究所 46、D296–D302 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Vlachos、IS et al. DIANA-TarBase v7.0: 実験的にサポートされた 50 万以上の miRNA:mRNA 相互作用のインデックスを作成します。核酸研究所 43、D153–D159 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kopylova, E.、Noe, L. & Touzet, H. SortMeRNA: メタトランスクリプトームデータ内のリボソーム RNA の高速かつ正確なフィルタリング。バイオインフォマティクス 28、3211–3217 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ドービン、A.ら。 STAR: 超高速ユニバーサル RNA-seq アライナー。バイオインフォマティクス 29、15–21 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Liao, Y.、Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: シーケンスリードをゲノム特徴に割り当てるための効率的な汎用プログラム。バイオインフォマティクス 30、923–930 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Love, MI、Huber, W. & Anders, S. DESeq2 を使用した RNA-seq データの倍数変化と分散の適度な推定。ゲノムバイオル。 15, 550 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Cardoso-Moreira、M. et al. 哺乳類の器官発達における遺伝子発現。ネイチャー 571、505–509 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ストロバー、BJ 他細胞分化中の遺伝子発現の動的遺伝的調節。サイエンス 364、1287–1290 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ケント、WJら。 UCSC のヒトゲノムブラウザ。ゲノム研究所 12、996–1006 (2002)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tonidandel, S. & LeBreton, JM RWA Web: 相対重量分析のための、無料の包括的な Web ベースの使いやすいツールです。 J.バス。サイコル。 30、207–216 (2015)。

記事 Google Scholar

シッコ、RJ 他心筋発達経路に関与する孤立性エブスタイン異常における遺伝子変異。 PLoS ONE 11、e0165174 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

八木洋ほかヒトdel22q11.2症候群におけるTBX1の役割。ランセット 362、1366–1373 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

参加者の皆様には、本研究にご協力いただきまして誠にありがとうございます。また、この原稿の草稿の英語テキストを編集していただいたフレゼニウスメディカルケアの MJ Zhou 氏にも感謝いたします。この研究は、中国国家重点研究開発プログラム [2021YFC2701104 to Qh.F.] によって支援されました。中国国家自然科学財団 [82172352 to BW、82072372 to Qh.F.]; 浦東科学技術経済委員会 [PKJ2022-Y04 to BW]; 国立トランスレーショナル医療施設 (上海) [TMSK-2021-133 to BW]; および上海市科学技術[20JC1418500、21Y31900300および20dz2260900からQh.F]。

これらの著者は同様に貢献しました: Yibo Lu、Qing Fang、Ming Qi。

中国上海市、上海交通大学医学部、上海小児医療センター小児トランスレーショナル医学研究所

Yibo Lu、Qing Fang、Ming Qi、Xingyu Zhang、Yuwan Lin、Ying Xiang、Qihua Fu、Bo Wang

上海交通大学医学部、上海小児医療センター、医療遺伝学および分子診断研究室、中国、上海

リー・シャオリアン

上海小児臨床分子診断重点研究所（中国、上海）

イン・シャン、チーフア・フー、ボー・ワン

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

Yb.L. BW は文献レビュー、研究デザイン、データ収集、データ分析、データ解釈、原稿草稿に貢献しました。 QF、MQ、XL、Yw.L.、および XZ は、データ収集、実験検証、データ解釈、および原稿の準備に貢献しました。 YX、Qh.F.、および BW は、研究と原稿の準備のあらゆる側面の監督に貢献しました。著者は最終原稿を読んで承認しました。

Ying Xiang、Qihua Fu、または Bo Wang に対応します。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Marlin Touma と他の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: George Inglis。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Lu、Y.、Fang、Q.、Qi、M. 他。コピー数変異に関連する lncRNA は、先天性心疾患の病因に寄与している可能性があります。 Commun Biol 6、189 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04565-z

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 6 月 23 日

受理日: 2023 年 2 月 8 日

公開日: 2023 年 2 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04565-z

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。

ニュース