心臓プロテオームおよびEGFR経路のチロシンリン酸化の変化が肥大型心筋症に寄与する

Communications Biology volume 5、記事番号: 1251 (2022) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

心臓プロテオームのセリン/スレオニンリン酸化の変化は、心不全の特徴です。 しかし、心肥大の病因に対するチロシンリン酸化 (pTyr) の寄与は不明のままです。 我々は、グローバルマッピングを使用して、2つの心肥大マウスモデル、すなわちErbB2（TgErbB2）およびαミオシン重鎖R403Q（R403Q-αMyHC Tg）の心臓過剰発現を、対照心臓と比較して部位特異的pTyrを発見および定量する。 このことから、TgErbB2 マウスでは、右室心筋症、肥大型心筋症 (HCM)、および拡張型心筋症 (DCM) 経路において重大なリンプロテオミクス変化が見られます。 一方、R403Q-αMyHC Tg マウスは、アンジオポエチン、ErbB、成長ホルモン、ケモカインシグナル伝達経路の活性化とともに、EGFR1 経路が心肥大の中心であることを示しました。 驚くべきことに、ほとんどの筋フィラメントタンパク質は、pTyr の上方制御ではなく下方制御を持っています。 キナーゼ基質濃縮分析 (KSEA) では、TgErbB2 マウスにおける k-Ras の下流の MAPK 経路活性の顕著な下方制御と、EGFR、接着斑、PDGFR、およびアクチン細胞骨格経路の活性化が示されています。 AG-825 による in vivo ErbB2 阻害は、心筋細胞の混乱を減少させます。 セリン/スレオニンおよびチロシン ホスホプロテオームは、上記の経路と AG-825 治療の有効性を確認します。 したがって、変化した pTyr は心肥大モデルにおいて調節的な役割を果たしている可能性があります。

家族性肥大型心筋症 (HCM) では、左心室 (LV) の壁の厚さが増加します。 異常な荷重条件ではこの変化を説明できません。 サルコメアタンパク質をコードする遺伝子の変異は、HCM 患者によく見られます (40 ～ 60%)1。 サルコメアタンパク質 (または Ca2+ ハンドリングタンパク質) の翻訳後修飾 (PTM) を研究することは、遺伝的疾患がどのように心機能不全につながるかをより深く理解し、治療の潜在的な標的を発見するまたとない機会を提供する可能性があります 2,3,4。 例えば、心筋の収縮調節に中心的に関与するサルコメアタンパク質である心筋トロポニン I (cTnI) の PTM は、特にプロテインキナーゼ A 依存性リン酸化の機能的役割について広く研究されています 5。 注目すべきことに、cTnI の最も関連性の高い調節部位の 1 つである cTnI-S22/23 のリン酸化は、ヒトの心不全 (HF) 6 において下方制御され、収縮機能不全を引き起こす 7 。

チロシンリン酸化 (pTyr) は、胎児形成中の心臓の構造発達と筋原線維の組織化に不可欠です 8,9。 たとえば、いくつかのチロシンホスファターゼは心臓病に関連しており、一部の症状の治療標的としても提案されています。 さらに、チロシンタンパク質ホスファターゼ非受容体タイプ 11 (PTPN11) の変異は、HCM または拡張型心筋症 (DCM) を引き起こす可能性があります 10,11。 心臓では、PTPN11 が圧力過負荷によって引き起こされる収縮機能不全に関与している可能性があります 12。 酸性ホスファターゼ 1 (ACP1) は、心臓の病態生理学に関連する別のチロシン ホスファターゼです。 したがって、その欠失はストレス誘発性心筋症から保護されます13。 私たちのグループは、cTnI-Y26 リン酸化が健康なヒトの心臓では容易に検出され、ヒトの HF および DCM14 では下方制御されていることを初めて示しました。 しかし、これらの変化が心疾患の発症と進行にどのように寄与するかは、依然としてよくわかっていない。 個々のチロシンリン酸化部位のさらなる部位特異的変化をよりよく把握することは、この方向に実質的に役立つであろう。

本研究では、ラベルフリーおよびタンデム質量タグ付け（TMT）定量的グローバルホスホチロシンプロテオミクスアプローチを適用して、2つの無関係なHCMモデルにおいて、どのサルコメア部位が特定部位のTyrリン酸化量を変化させたかを決定した。 最初のモデルは、チロシンキナーゼ受容体 ErbB215,16 の過剰発現に続発します。 2 番目は、ヒトの病気の特徴、より具体的には、家族性 HCM17 に特徴的な筋フィラメントタンパク質ミオシン重鎖の R403Q 変異を要約しています。 TgErbB2 マウスは最初に顕著な同心円状の心肥大を発症し、HCM を伴うびまん性線維症と筋細胞の乱れ 16 に発展します。 この系統のマウスはカルシウムの処理にも異常があり、不整脈を起こしやすく、肥大型閉塞性心筋症を発症しやすいです2。 同様に、R403Q-αMyHC マウスは、軽度の肥大および線維症から明らかな筋細胞の乱れ、心不全、および不整脈に進行することによって、ヒト家族性 HCM を再現します 17。

この研究の背後にある主な推進力は、さまざまなメカニズムによる HCM の誘発が心臓内の同様の pTyr 関連経路/調節部位を誘発するかどうかを判断することでした。 そうすることで、これらの pTyr 部位の操作は、今度は、さまざまな形態のヒト HCM における治療標的化の新たな機会を提供するでしょう。

まず、TgErbB2、R403Q-αMyHC、および非トランスジェニック (Ntg) マウスの心筋の免疫ブロット分析を実行して、pTyr を推定しました。 TgErbB2 (p = 0.0298) および R403Q-αMyHC (p = 0.003) マウスの全心臓ホモジネートでは、Ntg と比較して pTyr が全体的に減少しました (図 1a、b)。 pTyrシグナルをトロポニンI発現レベルに対して正規化しました（図1a）。 癌原遺伝子チロシンプロテインキナーゼ Src (c-Src) は ErbB2 シグナル伝達の下流にありますが、GAPDH ウェスタンブロットシグナルに対して正規化した場合、R403Q-αMyHC マウスにおけるその発現増加は予想されませんでした (図 1c、d、p = 0.0414)。 。 c-Src 活性 (c-Src Tyr416 リン酸化) は、Ntg と比較して R403Q-αMyHC マウスで増強されているようです。 ただし、統計的有意性には達しませんでした（図1e、f、一元配置分散分析を使用してグループを比較しました）。 これらのデータを総合すると、pTyr が心筋内に広く分布している PTM であることが示唆されます。 したがって、その上方制御または下方制御は、家族性心筋症（HCM）およびDCMの場合と同様、基礎疾患に対する病態生理学的反応の一部として、非虚血性心筋症の疾患進行において調節的役割を果たしている可能性がある。

a ウェスタンブロットは、TgErbB2 (p = 0.0298) マウスおよび R403Q-α-MyHC (p = 0.003) 心臓ホモジネートでの pTyr の減少を示します。 トロポニン I シグナルは、対応する総タンパク質負荷を示します。 b デンシトメトリー分析は、pチロシンシグナルが総cTnIに対して正規化された後、TgErbB2およびR403Q-α-MyHCマウスのpTyrが有意に減少したことを示しています。 c ウェスタンブロットは、総 Src および p-Src (Tyr 416) とローディングコントロールとしての GAPDH の発現レベルを示します。 d デンシトメトリー分析により、R403Q-α-MyHC では Src レベルが有意に上昇していることが明らかになりました (p = 0.0282)。一方、e および f は、R403Q-α-MyHC では p-Src リン酸化レベルが上昇しているが、統計的有意性には達していないことを示しています。 d および e のシグナルは総 GAPDH に対して正規化されましたが、f では pSRC は総 SRC に対して正規化されました。 Ntg (n = 3)、TgErbB2 (n = 3)、および R403Q-α-MyHC (n = 3)、エラーバーは SEM を表します。一元配置分散分析を使用してグループを比較しました。

次に、Ntg、TgErbB2、およびR403Q-αMyHCマウスの全心臓pTyrプロファイルを比較するために、グローバルTMTホスホチロシンプロテオミクスアプローチを採用しました（図2）。 我々は、公平な全心臓pTyrプロファイリングにより、必須の心臓特異的タンパク質およびチロシンキナーゼの特定のチロシン部位に関する完全な状況が得られ、したがってどのチロシンキナーゼが心臓pTyrを媒介するかについての手がかりが得られるのではないかと仮説を立てた。 合計 1,800 個のスペクトル一致ペプチド (PSM) が心室全体のプロテオームから収集され、50% が高い信頼性で同定され、213 (R403Q-αMyHC)、214 (Ntg)、217 (TgErbB2) の固有のチロシンリン酸化ペプチドが得られました。 499 個のタンパク質に相当します (図 2g)。 同定されたすべてのリンタンパク質およびリンペプチドを含む表は補足データ 3 に提供されています。中央値スイープ正規化後の質量分析データの品質、強度、分布は補足図 1a、b に含まれています。 アノテーションに関してリン酸化部位の局在化の信頼性が評価され、49% 以上のスコアが必要でした。 このデータセットは、他のアプローチと同様のアプローチを使用して、同等のペプチド同定収率、pTyr ペプチドの濃縮の再現性、および高品質の MS/MS データが達成されたことを示しています 18、19、20。

a 心室組織を PBS でリンスし、リン酸化保存を最大限にするために T1 組織スタビライザーを使用して熱安定化した後、液体窒素中で瞬間凍結し、さらに使用するまで -80 °C で保存しました。 b Ntg、TgErbB2、およびR403Q-αMyHCマウスの心臓（グループあたりn = 5）を並行して処理して、全心臓溶解物を取得しました。 各マウス心臓から 30 mg のタンパク質溶解物を溶液中トリプシン消化に使用し、遺伝子型ごとに合計 150 mg のトリプシン処理タンパク質を C18 脱塩し、-20 °C で 3 日間凍結乾燥しました。 c 合計150 mgのトリプシンペプチド（グループあたり5つの心臓からプールした材料）を免疫親和性沈殿（プロテインアガロースビーズ+ 300マイクログラムのmAb Anti-pTyr）を使用してpチロシンについて濃縮し、C18ステージチップ上で脱塩しました。 d RP-HPLC ESI (エレクトロスプレーイオン化) MS/MS は、LTQ Orbitrap Elite (Thermo Scientific) でアセトニトリル直線勾配 (4-40%) で 120 分間実行されました。 生データは Mascot 2.3 で検索され、MS1 抽出イオンクロマトグラムによるラベルフリー定量化は MaxQuant を使用して実行されました。 このアプローチは、3 つのグループすべてからのサンプルを並行して実行して 3 回繰り返されました。 3 つの技術的複製で遺伝子型ごとに 15 個の心臓。 e pTyr 濃縮のフロースルーの一部を 9-plexTMT に使用しました。 各遺伝子型 (Ntg、TgErbB2、および R403Q-αMyHC) の 3 つの複製をプールし、完全なプロテオーム定量化のために RPLC で分画しました。 f pTyrosine および Full Proteome からのデータを同様の方法で処理し、pTyrosine シグナルを正規化して総タンパク質発現を一致させました。データを正規化します。 分析は本文と補足データで詳しく説明されています。 g は 3 つのグループで見つかったリン酸化タンパク質の重複を示し、h は 3 つのグループ間で重複しているチロシンリン酸化ペプチドを示します。

グローバル TMT ホスホチロシン プロテオミクス アプローチにより、2 つの心肥大モデル (TgErbB2 および R403Q-αMyHC) から 499 の異なるチロシンリン酸化タンパク質、Ntg 間で重複する 294 のチロシンリン酸化タンパク質、および心筋が同定されました。 ペプチドレベルでは、178のチロシンリン酸化残基の重複を伴​​う217のpTyr部位が検出された(図2g、h)。

次に、筋フィラメント装置からの心臓特異的タンパク質に焦点が当てられました。 9 つの主要な筋フィラメントタンパク質がチロシンリン酸化されました。 それらには複数のpTyrアミノ酸部位があり、その多くは新規です（補足図2を参照）。 最良の例は、36 個の pTyr アミノ酸部位を持つタイチンです (補足図 3 を参照)。 また、17 のチロシンキナーゼには検出可能なチロシンリン酸化ペプチドが含まれていました。 したがって、それらは心筋フィラメントのpTyrの調節に潜在的に関与している可能性があります。

対照的に、2 つのチロシン ホスファターゼ (Ptpn11 と Ptpra) のみが検出可能なチロシンリン酸化ペプチドを持っていました。 したがって、それらはサルコメア内の心臓 pTyr レベルの調節に役割を果たしている可能性があります。 リン酸化ペプチドとともに見つかったチロシンキナーゼの数に加えて、15 個のセリン/スレオニンキナーゼが検出可能なチロシンリン酸化ペプチドを持っていました。 ただし、1 つのセリン/スレオニン ホスファターゼ (Ppp1r12b) だけがチロシンリン酸化ペプチドを示しました。 これらのデータは、pTyr が心臓プロテオーム (心臓サルコメアおよび他のサブプロテオーム) に広く分布していること、およびチロシンキナーゼ/ホスファターゼとセリン/スレオニンキナーゼ/ホスファターゼ間のクロストークが心臓サルコメア pTyr を制御している可能性があることを示しています。

次に、特定の pTyr 変化に対する ErbB2 心臓過剰発現と心臓ミオシン重鎖の R403Q 変異の影響を定義するために、バイオインフォマティクス分析を実施しました。 私たちは、2 つの無関係なタイプの HCM に関連するシグナル伝達経路を決定しました。 pTyrのスペクトルシグナル正規化は、完全なプロテオームを定量化する心臓全体のTMT等重プローブに対して実行され（図2e、f）、以前に記載されているように統計的手法が実行されました21、22。 次に、主成分分析 (PCA) と階層的クラスタリングを適用して、pTyr プロファイルがグループ内で類似しているかどうかを判断しました。 このアプローチにより、完全なプロテオーム定量化において 3 つのグループが主成分 1 (PC1 = 46%) によって分離されることが明らかになりました (図 3a)。 この発見は、pTyr を完全なプロテオームに正規化した後でも明らかでした。 3 つのグループは主成分 (PC1 = 52.2%) に沿って分離します (図 3b)。 注目すべきことに、R403Q-αMyHC の 1 つの技術的/生物学的複製は、他の 2 つの複製と比較して pTyr ペプチドが 50% 以上欠落しているため、削除されました。 したがって、これは技術的な失敗であると考えられました。 階層的にクラスター化された上方制御または下方制御された正規化pTyrペプチドのヒートマップは、心肥大の遺伝子型がpTyrプロテオームリモデリングにどのように大きな影響を与えるかの技術的な再現性と特異性を視覚化するのに役立ちました（図3c、ANOVAによるp <0.05）。 チロシンリン酸化ペプチドは、TMT 等重標識ペプチド MS2 強度に対して正規化された抽出クロマトグラム MS1 シグナル強度に従って色分けされています。 黄色は上方制御され、青色は下方制御されます。 このアプローチにより、世界的な心臓プロテオームのチロシンペプチドの豊富さが得られました。 これらの結果は、Ntg、TgErbB2、および R403Q-αMyHC マウスが、教師なし不偏統計手法における PCA およびヒートマップ クラスタリングによって証明される、明確な特徴を持つ pTyr プロテオームを持っていることを示しています。

a 非トランスジェニック、TgErbB2、およびR403Q-αMyHCマウスの完全な心臓プロテオームの教師なしPCAは、実験グループの明確な分離を示します。 グループは、最初の主成分 (PC #1) とともに分離します。これは、フル プロテオームの発現における総相関の 46% を占めます (正規化、平均 = 0、分散 = 1)。 b 完全なプロテオーム発現に対して正規化された pチロシンペプチドシグナルの教師なし PCA。 これらのグループは、第 1 主成分 (PC #1) とともに分離しており、相関関係全体の 52.2% を占めています。 c ヒートマップを使用して、ANOVA による p 値 < 0.05 で完全なプロテオーム発現に正規化された pチロシン ペプチドの教師なし階層クラスタリングを視覚化しました。 過小評価 (黄色) と過小評価 (青)。 d Ntg と TgErbB2 のペア比較における各 pTyr ペプチドの Log2 倍数変化と –Log10 p 値を示す火山プロット。 赤で強調表示されたデータ ポイントは強度が大幅に低いことを示し、一方、緑のデータは強度が大幅に高いことを示します。 いくつかのペプチド部位を標識するために、図では重要な部位を拡大してあります (点線の四角)。 マゼンタのデータ ポイントは、MsigDB 疾患経路に大きく関連する遺伝子と一致します。 シアンのデータポイントは、EGFR1 経路を示していますが、統計的有意性には達しませんでした。 e Ntg と R403Q-αMyHC のペア比較における各 pTyr ペプチドの Log2 倍率変化と –Log10 p 値を示す火山プロット。 赤と緑のデータ ポイントは上記のように色分けされました。 上記と同様の倍率で、シアンのデータポイントは、PTMsigDB による EGFR1 経路との有意な関連を示しています。 f グローバル pTyr データの分子シグネチャー DB (MSigDB) および分子 PTM シグネチャー DB (PTMsigDB) により、大幅に変化した経路が特定されました。

統計的に有意な変化（Log2倍変化>1、-Log p値<1.3）が、TgErbB2マウスの18のタンパク質に対応する23のリン酸化部位で検出され（図3d）、R403Q-αMyHC Tgマウスの35のタンパク質の45のリン酸化部位で検出されました（図3d）。 .3f) ANOVA を使用 (p < 0.05)。 α-ミオシン重鎖のいくつかのペプチド (Myh7-Y386、Y410、Y1375)、β-ミオシン重鎖の 1 つのペプチド (Myh6-Y1349)、およびタイチンの 2 つのペプチド (Ttn-Y2118、Y1375) の pTyr は注目に値します。 Y21190）は下方制御されるが、心臓Ttn Y-31324 pTyrはTgErbB2マウス心臓上で上方制御される（図3d）。 興味深いことに、Myh7-Y410リン酸化は、TgErbB2では下方制御され、R403Q-αMyHC Tgマウスの心臓では上方制御されます（図3e）。 対照的に、cTnI Y113 (Tnni3-Y113) pTyr は両方の HCM モデルで下方制御されていますが、R403Q-αMyHC Tg マウスの心臓でのみ統計的有意性に達しました。 タイチンリン酸化 (TtnY1881、Y1901、および Y33864) は、後者のモデルで大幅に下方制御されました。

我々は、分子シグネチャー データベース (MsigDB) 23 と、キナーゼ、摂動、およびシグナル伝達経路の PTM 部位特異的リン酸化シグネチャーの新しいデータベース (PTMsigDB) 24 を統合する、カスタムメイドの PhoshoEnrichment ソフトウェア (M. アヤティ) である MATLAB を使用しました。 Broad Institute は、注釈付きの遺伝子データセットと PTM の厳選されたコレクションを網羅するデータベースを作成しました。 PTMsigDB は、最も一般的な実験システムの生物学的摂動とともに、リン酸部位特異的な変化とその変化が特定の経路の活性化または阻害に及ぼす影響を説明します。 これらのバイオインフォマティクス ツールの利点は、超幾何検定を使用して各経路と摂動 (遺伝子レベルおよび部位レベル) の統計的有意性を評価できることです。 ここでは、すべての既知の遺伝子の代わりに、特定されたリン酸化サイトと遺伝子の数が超幾何モデル パラメーターの母集団として使用されます。

MSigDB による遺伝子タンパク質レベルを使用して、重要な遺伝子/部位に対して経路濃縮分析を実行しました。 TgErbB2 マウスの重要な経路は、不整脈原性右室心筋症 (ARVC)、HCM、DCM、およびインテグリン アルファ IIB ベータ 3 シグナル伝達です (図 3f)。 R403Q-αMyHC Tgの最も重要な経路は、アンジオポエチン受容体経路、ErbBシグナル伝達経路、成長ホルモン受容体シグナル伝達、およびケモカインシグナル伝達経路です（図3f）。

両方のTg動物モデルは、Y119部位でプラコフィリン-2（PKP2）pTyrの顕著な変化を示しましたが、TgErbB2心臓では下方制御され、R403Q-αMyHC Tg心臓では上方制御されました（図3e）。 プロテオーム全体を通る全体的な心臓全体の TMT フローの MsigDB 分析は、補足データ 3 に表示されます。PKP2 は、心筋のデスモソームの重要な構成要素です。 この遺伝子の変異は不整脈原性心筋症に関連しています25、26、27。 したがって、プラコフィリン 2 のリン酸化の乱れは機能的な影響を与える可能性があります。

比較すると、PTMsigDB は、リン酸化部位特異的レベルでの経路解析が、TgErbB2 マウスの EGFR1 経路について統計的有意性に達していないことを明らかにしました。 2 つの部位特異的リン酸化酵素のみが EGFR1 経路と一致しました。 それらは、Volcano プロット (図 3d) および PTMsigDB テーブル (図 3f) でシアン色で強調表示されます。 興味深いことに、R403Q-αMyHC マウスでは、同じ経路が統計的に有意でした。 火山プロットでシアンのデータポイント（図3e）およびPTMsigDBテーブル（図3f）として表される、EGFR1経路と一致する10の部位特異的変化（p = 0.001）を参照してください。 これらのデータは、特にこれまでデータセットが少ない pTyr などの十分に研究されていないリン酸化イベントにおいて、リン酸化プロテオミクスデータセット上の生物学的に関連する経路の検索を絞り込むためのリン酸化部位特異的データベースの有用性を示しています。

筋フィラメントのpTyr変化についてより具体的な洞察を得るために、TMT定量的標識プロテオミクスを使用しました。 より具体的には、筋フィラメントの濃縮により、筋フィラメントタンパク質、特に全体的なアプローチでは見逃されていた可能性のあるリン酸チロシン修飾が少ないタンパク質の部位同定の数が増加するのではないかという仮説を立てました。 この目的を達成するために、本発明者らは、「方法」２８に記載されているように、ＮｔｇマウスおよびＴｇＥｒｂＢ２マウスから新たに単離した筋フィラメントを若干の変更を加えて利用した。 心不全リンプロテオーム20について説明したように、遺伝子型ごとに3つの心臓を使用して、筋フィラメントpTyrプロテオームを特徴付けました（図4a、b）。 簡単に説明すると、大規模な 6 重 TMT 実験を実行しました。この実験では、ほとんどの TMT 標識ペプチドの pTyr が濃縮されました (図 4c)。 さらなる統計データ分析のために、全心臓TMTホスホチロシンプロテオミクスと同様のワークフローを採​​用しました（図4d）。 単一スペクトルで同定されたペプチドが除去され、24,727 PSM が得られました。 中央値スイープ正規化後、1,116 個のペプチドが 1,092 個のタンパク質に対応しました。 正規化前後のスペクトル強度分布については、補足図4a、bを参照してください（補足図4c、d）。 pTyr プロテオームの場合、4391 PSM が収集され、プロテオーム全体に対して同じ品質管理キュレーションが行われ、欠落データと固有のスペクトルが除去され、3064 PSM が得られました。 pTyrプロテオームスペクトル強度分布の生データを、正規化前（補足図5a、b）、正規化後（補足図5c、d）およびPCA（図5b）に示します。 中央値スイープ正規化後、832 個のペプチドが 184 個の異なるタンパク質に対応しました。 完全なプロテオームの発現データからの対応するペプチドがあったため、146 個のペプチドの特異的な pTyr が定量されました。

Ntg (n = 3) および ErbB2 (n = 3) トランスジェニックマウスの心臓からの筋フィラメントを、プロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル (Roche) を含む氷冷緩衝液上で新たに単離しました。 b すべての材料を TEAB に再懸濁し、還元してアルキル化しました。 トリプシンペプチドを脱塩し、6 重同重体タンデム質量タグ (TMT) で標識しました。 c 消化および標識されたペプチドをプールし、C18 SEP-PAK で脱塩しました。 ホスホチロシンの濃縮は、PTMScan Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) キット (Cell Signaling Technology) を使用して実行されました。 溶出されたペプチドサンプルは、Orbitrap Fusion Lumos Tribrid に接続された Easy-nanoLC 1200 ナノフロー液体クロマトグラフィー システムの C18 STAGE チップを使用して脱塩されました。

完全なプロテオームは TMT で標識されており、記録され要約されたタンパク質シグナル強度は、実験グループが最初の主成分 (PC #1) とともに分離していることを示しており、これが発現プロテオームの全相関の 53.9% を占めています (正規化、平均) = 0、分散 = 1)。 b リン酸化 Tyr プロテオームの PCA も同様の傾向を示し、グループは PC#1 に沿って分離しており、これが相関関係の 47.2% を占めています。 c ホスホ Tyr プロテオームのシグナル強度を完全なプロテオームタンパク質発現に対して正規化し、主成分分析によって分析しました。 pTyr の特徴的なサインは PC#1 によって依然として明らかであり、相関関係の 57% を占めています。 d ヒートマップを使用して、タンパク質発現と e pTyr プロテオーム発現の教師なし階層相関クラスタリングを視覚化しました（TgErbB2 と Ntg グループの LIMMA モデレート 2 サンプル t 検定比較による p < 0.05）。 f Ntg と TgErbB2 のペア比較における各 pTyr ペプチドの Log2 倍率変化と –Log10 p 値を示す火山プロット。 赤のデータ ポイントは大幅に低い強度を示し、一方、緑のデータ ポイントは大幅に高い強度を示しました。 表現を明確にするために、一部のペプチドのみを強調表示しました。 g 分子シグネチャーデータベース（MSigDB）は、図3のTgErbB2マウスでも見られる標的と拡張経路およびHCM KEEG経路の関与を確認しました。

分析の最初のステップでは、教師なし PCA と階層的クラスタリングが使用されます。 PCA分析では、同じグループのメンバー間の相関関係が示され（図5a〜c）、完全なプロテオーム、pTyrプロテオーム、および正規化されたpTyrプロテオームはPC1に沿ってよく分離されており、57.6％、82.4％、および62.1％の発現の相関関係を示しています。それぞれ。 階層的にクラスター化された発現のヒートマップは、TgErbB2 心臓の過剰発現が遺伝子型クラスター化にどのように大きな影響を与えたかを視覚化するのに役立ちました。 プロテオーム全体からのタンパク質（図5d）とpTyrプロテオームの正規化された強度（図5e）の両方のパターンは、ミラーリモデリングを示唆しました（プロテオーム全体の377個のタンパク質と51個のpTyrペプチドは、LIMMAで調節された2-サンプルの t 検定比較)。

完全なプロテオームにより、1092 個のタンパク質に対応する 1116 個のペプチドが検出されました。 Ntg/TgErbB2 の Log2 倍率変化 (FC) を比較すると、統計的に有意な差がある 377 個のタンパク質が示されました (Log2 FC > 1 および p 値 < 0.05)。 完全なプロテオーム データに正規化された全球心臓 TMT ホスホチロシンと同様に、統計的に有意なタンパク質発現の変化は経路解析のために MSigDB に供されました。 結果を補足データ 4 に示します。

我々は、50 のタンパク質に対応する 146 個のリン酸化部位を使用して、pTyr プロテオームのリン酸化または正規化された pTyr プロテオームを分析しました。 TgErbB2 マウスは、15 個のタンパク質に対応する 21 個の pTyr 部位に有意な変化を示しました（図 5g）。 pTyr の大幅な増加は、他のタンパク質の中でも MLC1-Y82、Y139、Myh6-Y1310、α-Tm-Y261、Actin-Y168、MyBP-C-Y544、および Actinin2-Y200 で検出されました。 MsigDB 経路分析では、心臓全体に対する包括的な TMT ホスホチロシン アプローチと同様の結果が得られました (図 3)。 TgErbB2 サルコメア pTyr データは、最も重要な経路が DCM および HCM であることも示しています (図 5g、h)。 興味深いことに、総 ErbB2 に対して正規化すると、ErbB2-Y1006 リン酸化レベルが減少します。 一方、多くのサイトが新しく、PTMsigDB データベースで報告されていないため、PTMsigDB パスウェイ分析ではどのパスウェイとも一致しませんでした。

私たちのデータは、サルコメアタンパク質の濃縮により、全心臓溶解物の全体的なアプローチでは見逃されていたより多くの筋フィラメントpTyrペプチドが検出されたことを示しています。 ただし、チロシンリン酸化ペプチドと対応するタンパク質の総数はそれよりも少なくなりました。

KSEA は、それぞれの Ntg グループを参照として使用し、全心臓 pTyr TMT および TMT 定量的サルコメア pチロシン プロテオミクス データを使用して、TgErbB2 および R403Q-αMyHC マウスにおけるキナーゼの相対活性を推定することにより、遺伝子型誘導性シグナル伝達変化を特徴付けるために使用されました。 KSEA29 は、基質の異なるリン酸化に基づいてキナーゼの異なる活性を推測し、各キナーゼの活性の方向性の変化を反映するスコアを計算する方法です。 この方法は、キナーゼの異なる活性がその基質のリン酸化変化と相関していると仮定しています。 正のスコアは、Ntg コントロールと比較した Tg マウスの基質がリン酸化されたキナーゼに対応します。 同様に、負のスコアは、Ntg コントロールと比較して Tg のリン酸化が低いことを示します。 キナーゼと基質の相互作用データは、PhosphoSitePlus30 Web サイトからダウンロードされました。 次に、これらの実験で特定されたすべての pTyr 部位に KSEA 法を適用しました。 PhosphoSitePlus で報告されているキナーゼと関連する 34 個のリン酸化サイトを特定しました。 ただし、結合されたデータセットでは 49 個の固有のキナーゼがスコア付けされました。 KSEAヒートマップにより、下方制御されたキナーゼ（青色スケール）または上方制御されたキナーゼ（赤色スケール）のクラスターが推定され、図6aに示されています。 TgErbB2 マウスは、MAP2K4、MAP3K6、MAP3K5、MAP2K3、および MAP2K6 の有意な下方制御と、EPHA4 の顕著な上方制御を示しました。 一方、R403Q-αMyHC Tgは、GSK3Bの実質的なダウンレギュレーションを示しました（図6aの強調表示された青い四角形を参照）。 R403Q-αMyHC Tgは、有意に上方制御されたキナーゼのより大きなクラスターを示しました（図6aの強調表示された赤い四角形を参照）。

全心臓 pTyr 濃縮データおよび TMT pTyr 筋フィラメント濃縮データに関する KSEA。 ヒート マップは、正規化されたスコア (つまり、TgErbB2/Ntg、R403Q-αMyHC/Ntg など) に従って KSEA の結果を報告します。 データセット間で共有されるキナーゼのみが含まれるため、Tg と Ntg に存在します。 アスタリスクは、p < 0.05 の統計的有意性を示します。 赤はプラスのスコアを表し、青はマイナスのスコアを表します。 赤い四角形は、クラスター化され、R403Q-αMyHC で優勢な活性化キナーゼのグループを強調表示します。一方、青い四角形は、クラスター化され、TgErbB2 心臓全体で優勢な抑制されたキナーゼを強調表示します。 b MoBaS は、成長因子シグナル伝達に関与する密接に相互接続されたサブネットワーク (ERBB、PDGFRA、および EGFR1) を特定しました。 モジュール 1 と呼ばれる最高スコアの PPI サブネットワークに代表されるものは、TgErbB2 全心臓 pTyr 濃縮で特定され、R403Q-αMyHC と比較されました。 c モジュール 1 の基板グループ、MsigDB および PTMsigDB 上の KSEA。 d モジュール 2 と呼ばれる 2 番目の最高スコアの PPI サブネットワークは、R403Q-αMyHC 全心臓 pTyr 濃縮で特定され、TgErbB2 と比較されました。 e モジュール 2 グループの基質上の KSEA は、R403Q-αMyHC で活性化されたキナーゼを示します。 PTMsigDB および MSigDB 分析の結果、EGFR1、アクチン細胞骨格、ERBB、および接着斑シグナル伝達が特定されました。 各ノードは、PPI モジュール上の最も重要なペプチドによって表されるリンタンパク質です。 ノードの色は、NTG に対する Log2 倍率変化に基づいています。 スケールは FC と青から赤に着色されたバーで示されます。

従来のパスウェイ分析では、パスウェイ アルゴリズムが事前に定義され、厳格であるため、タンパク質グループを見逃す可能性があります。 タンパク質間相互作用 (PPI) ネットワーク アプローチは、通常は経路解析では検出されないこれらのモデルのシグナル伝達応答をより適切に捕捉できる可能性があります。 これを行うために、MoBaS 分析 22,31 を使用して、関連し、Tg モデルで示差的なリン酸化を示す可能性のある密に接続されたサブネットワークを特定しました。 いくつかのモジュールが特定され、データセットを介した世界的な全心臓 TMT フローから統計的に有意な上位 2 つの PPI モジュールに焦点を当てました。 解釈の目的で、それらはモジュール 1 およびモジュール 2 として指定されました。モジュール 1 および 2 の基板は、それぞれ図 6b、d に示されています。

興味深いことに、PTMsigDB の部位レベルの分子シグネチャ分析により、モジュール 1 に EGFR1 経路の重要な部位特異的修飾が含まれていることが示されました。 さらに、MSigDB 遺伝子タンパク質レベル分析を使用すると、ErbB シグナル伝達、PDGFRA、接着斑経路などのいくつかの経路で統計的有意性が示されました。 モジュール1タンパク質間ネットワークのKSEAは、AURKB（オーロラキナーゼB）およびCSNK2A1の顕著な活性化を強調しています（図6c）。

同様に、モジュール 2 の PTMSigDB 分析では EGFR1 経路の関与が確認され、MsigDB ではアクチン細胞骨格、ErbB シグナル伝達、接着斑経路が検出されました。 モジュール2タンパク質-タンパク質ネットワークのKSEAは、R403Q-αMyHCマウスにおけるSRC、MAP2K1、HCK、LCK、SYK、JAK3、JAK2、FYN、PTK6、およびABL1の有意な活性化を強調します（図6e）。 これらのデータは、MoBAS が同定された pTyr ペプチドの中から機能的に関連する PPI モジュールを同定し、PTMsigDB が 2 つの無関係なマウス モデルからの HCM の共通経路として EFGR1 経路を指摘したことを裏付けています。

TgErbB2 マウスの心臓は同心円状の HCM を発症します。 この変化は急速に病的 HCM に進行し、線維症、心筋細胞の乱れ、Ca2+ の取り扱いの乱れ、不整脈、突然死などの特徴を示します 16。 これらの根拠に基づいて、我々は、AG-825 (ErbB2 阻害剤) を使用して、チロシンキナーゼ受容体である心臓 ErbB2 過剰発現の活性を薬理学的に抑制することで、組織病理学的表現型の進行を阻止できると仮説を立てました。 そのために、HCM および Ntg 対照が確立された TgErbB2 マウス（生後 6 ～ 9 か月）を、AG-825 または DMSO ビヒクルで 1 mg/Kg16 の用量で 1 日 2 回皮下で 2 週間治療しました。 次に、マッソントリクローム染色により心筋線維化を評価した。 未治療の TgErbB2 マウスは、さまざまな量の左心室の線維症を発症しました (図 7a、b)。 しかしながら、TgErbB2処置マウスは線維症をあまり示さなかった(図7b)。 対照的に、心臓の組織学は、Ntg マウスでは AG-825 治療による影響を受けませんでした。 心筋細胞の混乱に対する AG-825 の効果を特徴付けるために、Web グラフィック ユーザー間期である CytoSpectre32 を使用しました。 この間期は、シードマンの研究室によって以前に記載された分析と同様に、組織切片全体にわたる心筋細胞を含む構造の局所的な配向を決定する。 ランダムに選択された関心領域が図 7a に示されており、顕微鏡写真の倍率は 5 倍から 40 倍に増加します (図 7b)。 筋細胞の配向角度の分散を評価し、円分散と呼び、配向角度の分散を意味します。 すでに記載されているように、ビヒクルで処理した Ntg (図 7c) は、AG-825 で処理した Ntg (図 7c) と比較して有意な差はありませんでした (図 7d) 33。 対照的に、ビヒクルで処理した TgErbB2 マウス心筋細胞は、Ntg ビヒクル対照とは実質的に異なる配向角の分散を示しました。 図 7c の配向プロットの不均一でより広い形状を参照してください。 驚くべきことに、AG-825処理されたTgErbB2マウスからの心筋細胞は、円分散およびプロットの形状がNtg-溶媒またはAG-825処理された対照に有意に戻ったことによって実証されるように、著しく少ない乱れを示した（図7e、One-によるp = 0.0014）。方法 ANOVA)。 この分析は、円分散の減少によって示されるように、AG-825 で治療した TgErbB2 マウスの心筋細胞が示す筋細胞の乱れが大幅に少ないことを示唆しています。

a ビヒクル処理 Ntg マウスおよび AG-825 処理 Ntg マウス、ビヒクル処理 TgErbB2 マウスおよび AG-825 処理 TgErbB2 マウスのマッソントリクローム染色切片 (5X)、黄色の矢印は線維化領域を示します。 スケールバーは1mm。 b 代表的な関心領域からのマッソントリクローム染色切片（40X）は、TgErbB2 マウス心筋における線維症の増加を示し、AG-825 治療の 2 週間後に線維症が改善しました。 同じ領域を使用して、心筋細胞の乱れのレベルを決定しました。これは、Vehicle の CytoSpectre ソフトウェアおよび AG-825 で処理した Ntg および TgErbB2 マウス心臓切片を使用して細胞の配向を分析することによって達成されました (スケール バー 50 μm)。 c 心臓細胞の配向角度の分布のプロット。 AG-825 で治療したグループでは Ntg 角度が均一で変化しなかったことに注目してください。 対照的に、ビヒクルで処理したTgは、均一性が低く、異なる配向角を示し、心筋細胞の乱れが確認されました。 AG-825 治療により心筋細胞の乱れが減少し、配向プロットは AG-825 治療 NTG グループと同様です。 d 心筋細胞の平均配向角、および e AG-825 処理ありおよびなしの Ntg および TgErbB2 マウスにおける円分散、等方性の別の尺度 (条件あたり n = 5 匹)。 グラフバーは平均値±標準誤差として表されます。 統計的比較のために一元配置 ANOVA 検定を実行したところ、AG-825 で治療した TgErbB2 マウスの有意な改善が示されました (p 値 < 0.0014)。 f 4 つのグループの心臓心エコー検査では、14 日間の AG-825 治療により短縮率 % として推定される収縮機能が変化しなかったことが示されています。

次に、AG-825 による ErbB2 阻害の収縮性、心エコー図、および拡張機能を評価するための組織ドップラー画像検査に対する直接的な in vivo 影響を評価しました。 これらの研究は、ベースライン時および 2 週間の治療後に、意識のある (麻酔されていない) マウスを対象に実施されました。 40 MHz トランスデューサーを備えた Vevo 2100 高解像度イメージング システム (VisualSonics®、トロント) を使用しました。 その後、データは Advanced Cardiovascular Package ソフトウェアを使用して分析されました。 研究されたパラメータは、チャンバー寸法、短縮率、駆出率、および組織ドップラー速度ダイナミクスでした。 胸骨傍短軸心エコーイメージングによって得られた左心室機能データは、Ntgと比較して、ビヒクル溶液で処理したTgErbB2マウスの経時的な平均短縮率に有意な変化がないことを決定した（図7f）。 同様に、AG-825で処置したTgErbB2マウスは、Ntg AG-825で処置した場合と比較して、経時的に収縮機能に有意な変化を示さなかった(図7f)。 組織ドップラー画像検査では拡張機能に有意な差は検出されませんでした。 補足データ6の完全な心エコー検査データを参照してください。これらのデータは、ErbB2の薬理学的阻害が、線維化反応を軽減し、心筋細胞の整列を回復することにより、病理学的リモデリングを停止または逆転させたことを示唆しています。 しかし、この反応は、TgErbB2 マウスにおける LV 収縮機能の in vivo 保存と同等ではありませんでした。

我々は、KSEA の生物情報学的知見を検証し、プロテオームに対するチロシンキナーゼ阻害剤 AG-825 の影響を研究するために、TgErbB2 と NTg のリンプロテオミクスを再調査しました。 我々は、TMT 13-plex 標識アプローチを使用して、ビヒクルまたは AG-825 (ErbB2 阻害剤) で治療した Ntg マウスと TgErbB2 マウスの全心臓リン酸化プロファイルを比較しました。 簡単に言うと、TMT 13 プレックスは次のように実行されました。 Ntg-Vehicle (n = 3)、Ntg-AG-825 処理 (n = 3)、TgErbB2-Vehicle (n = 3)、および TgErbB2-AG-825 処理 (n = 4)。 全心臓タンパク質溶解物を熱的に安定化した心臓から単離し、図 2 および「材料と方法」に記載されているように処理しました。 材料の大部分は pS/pT/pY ペプチドを濃縮するために使用され、TMT で完全なプロテオームを定量するためにごく一部が標識されています。 図 2 の以前の実験で説明したように、pS/pT/pY ペプチドの強度は、完全なプロテオーム TMT シグナルの強度に対して正規化されています。 合計 6614 個のタンパク質、4732 個のリン酸化セリンおよびスレオニンペプチド、および 346 個の pTyr ペプチドが TMT レポーター イオンによって定量されました。 完全なデータセットは補足データ 7 で入手できます。

階層的にクラスター化された上方または下方制御された正規化セリン/スレオニンリン酸化またはチロシンリン酸化ペプチド強度のヒートマップは、すべてのリンプロテオームリモデリング、セリンおよびスレオニンリン酸化（図8a）およびpTyr（図8b）に対する遺伝子型の影響を確認します。 MSigDB および PTMSigDB を使用してデータを直接調べて、Ntg と TgErbB2 マウスを比較しました。 予想どおり、ビヒクル（図8c、d）またはAG-825（図8e、f）で治療したTgErbB2マウス心肥大におけるPTMSigDBによるEGFR1経路の関与を確認しました。 また、ビヒクル処置マウスにおける MSigDB による接着斑および細胞外マトリックス経路の関与、および AG-825 処置マウスにおける拡張型心筋症、HCM、および不整脈原性右室心筋症 (ARCV) の関与を確認しました。 しかし、14 日間の AG-825 治療は、TgErbB2 マウスにおいて、MsigDB や PTMsigDB では明らかではなかった微妙な効果をもたらしました。 すべてのリン酸化プロテオームを含めたので、セリンおよびスレオニンリン酸化ペプチドのキナーゼ活性を推定しました。 上位の上方制御および下方制御されたキナーゼは、KSEAを使用して同定されました。結果は図8gに示されています。 完全なKSEAおよび経路分析は補足データ5および補足データ7で利用できます。AG-825処理動物のキナーゼ活性を対照（ビヒクル処理）と比較しました。 我々は、ビヒクル処理ではなく、AG-825処理によって有意に阻害または下方制御されるキナーゼの小さなクラスターを特定した（図8gの強調表示された赤い四角形を参照）。 システム生物学の観点から機能的影響についてさらに洞察を得るために、シグナリング ネットワーク オープン リソース (Signor 2.0) 視覚化ソフトウェア 34 を使用して、これらのキナーゼの関係を調査しました。 図 8h は、こ​​れらのキナーゼのほとんどが EGFR の下流にあることを示しており、青い点線の円で強調表示されています。 まとめると、我々のデータは、EGFR1 が TgErbB2 の肥大の中心であり、AG-825 治療が ErbB2 と EGFR を阻害することを示しています。 したがって、EGFRシグナル伝達カスケードの下流にある標的の重要なサブセットが影響を受けます。

a ヒートマップを使用して Ser/Thr ペプチドの教師なし階層クラスタリングを視覚化し、 b p チロシン ペプチドを ANOVA によって p 値 < 0.05 で完全なプロテオーム発現に対して正規化しました。 過小評価 (黄色) と過小評価 (青)。 c 2週間のビヒクル処理後のNtgとTgErbB2のペアワイズ比較における各pSer / pThrペプチドおよびd pTyrペプチドのLog2倍率変化と-Log10 p値を示す火山プロット。 e AG-825 治療の 2 週間後の Ntg と TgErbB2 のペアワイズ比較における各 pSer / pThr ペプチドおよび f pTyr ペプチドの Log2 倍数変化および –Log10 p 値を示す火山プロット、(g) KSEA は赤色で示されます。四角形は、AG-825 によって有意に阻害されたキナーゼを示します。 KSEA および PTMSigDB を使用した Ser/Thr/Tyr リン酸化データを組み合わせた Pathway Enrichment Analysis により、EGFR1 経路が大きく関与していることが確認されました。 h Signaling Network Open Resource (Signor 2.0) 分析では、9 つ​​のキナーゼが EGFR 経路に関与していることが示されています。 ネットワークおよび KSEA でも見つかったキナーゼは、青い点線の円で囲まれています。 経路の横にネットワークのシンボルコードが表示されます。

本研究は、肥大型心筋症（HCM）の病因的に関連のない2つのモデル、すなわちErbB2の心臓特異的過剰発現とR403Q-αMyHC。 さらに、TgErbB2 マウス モデル心肥大では、心臓のセリン/スレオニン ホスホプロテオームも変化します。 まとめると、我々のデータは、EGFR経路の活性化が、2つの全く異なるマウスモデルから生じる心肥大に中心的に関与していることを示しています。

心不全の収縮機能不全は、部分的には筋フィラメントの Ca2+ 脱感作が原因です。 心臓サルコメアのセリン/スレオニンリン酸化の変化と筋フィラメントのCa2+感受性の低下は、心不全のヒトおよび実験モデルの特徴であり、HCMおよびDCMの病態生理学に役割を果たしています7,35,36。 我々は以前、ヒト心不全およびDCM14において下方制御されるヒト心臓トロポニンI Y26のpTyrを同定した。 しかし、心臓病の病因における全体的な調節不全の心臓 pTyr の影響に取り組んだ研究はまだありません。

今回、我々は、TgErbB2 マウスの心臓において、チロシンリン酸プロテオームが異なる様式で変化し、チロシンリンペプチドの上方制御および下方制御されるという証拠を示す。 MsigDB 経路解析により、TgErbB2 マウスの心臓における ARVC、HCM、DCM、およびインテグリン αIIB β3 シグナル伝達の関与が実証されました。 上方制御された Ttn-Y31324 を除き、Myh7-Y386、Y410、Y1375、Myh6-Y1349、および Ttn-Y2118、Y21190 など、ほとんどのサルコメアタンパク質は pTyr の有意な下方制御を示しました。 これらのサルコメアタンパク質における pTyr の方向性の変化は、心不全や DCM におけるヒト cTnI Y26 について報告されているのと同様に、ダウンレギュレーションです。 サルコメアタンパク質の pTyr の役割についてはほとんどわかっていません。 実際、cTnI をリン酸化する潜在的なチロシンキナーゼを調べたグループは 1 つだけ 37 です。 彼らは、c-Srcおよび別のSrcキナーゼファミリーメンバーであるLynがcTnIY26をリン酸化することをin vitroで実証し、この部位でのリン酸化および擬似リン酸化模倣により、筋フィラメントの力-カルシウム反応の変化によって証明されるように、筋フィラメントのCa2+感受性が低下することを報告した。 注目すべきことに、新規に発見された部位であるcTnI Y113リン酸化が、R403Q-αMyHCマウスでは下方制御されていた。 また、Ttn-Y1881、Y1902、および Y33864 における pTyr の有意な下方制御も実証しました。 TgErbB2 マウスとは対照的に、R403Q-αMyHC マウスでは Myh7-Y410 が上方制御されました。 Myh7-410 の pTyr は R403Q αMyHC の近くにあり、αMyHC の運動領域の先頭にあるため、機能に影響を与える可能性があります。 これらの変更によるサイト固有の影響については、さらに研究する価値があります。 ただし、それは現在の作業の範囲を超えています。 興味深いことに、R403Q-αMyHC 心臓では、pTyr プロテオームも異なるように変化します。 しかし、R403Q-αMyHC マウスでは、より多くのホスホチロシン ペプチドが統計的有意性に達しました。 TgErbB2 とは異なり、MsigDB 経路解析により、R403Q-αMyHC マウスではチロシンキナーゼ受容体経路、アンジオポエチン受容体、ErbB、および成長ホルモン受容体のシグナル伝達に変化があることが実証されました。 一方、PTMsigDB では、EGFR1 経路の変化と扁平上皮癌が明らかになりました。 我々は、TgErbB2 マウスの心臓における受容体チロシンキナーゼの過剰発現により、pTyr プロテオームのより重大な変化が生じると推論しました。 しかし、データは、R403Q-αMyHC マウスの場合のように、単一のサルコメア点突然変異が、心臓 pTyr プロテオームを大幅に変化させるのに十分なほど鋭敏であることを示唆しています。 トップダウンプロテオミクス 38 は、HCM 心筋層における cTnI、ENH2、およびその他の Z ディスクタンパク質のリン酸化の一貫した変化は、単一のサルコメア点の疾患原因変異に関係なく、表現型とよりよく相関することを実証しました。 ミオシン重鎖の病原性変異 (R403Q-αMyHC) が pTyr 制御に影響を与えるメカニズムは不明であり、さらなる研究が必要です。

TgErbB2 マウスモデルにおける全体的な pTyr 調節異常は、顕著な心肥大、サルコメア機能不全、カルシウム処理異常 16 をチロシンキナーゼ経路の変化と結びつけるため、不可欠です。 一方、ドキソルビシンで治療された乳がん患者において、阻害剤ラパチニブによる ErbB2 (HER2/neu) の薬理学的阻害は、ドキソルビシン単独で治療された患者と比較して、心不全を発症するリスクを増加させます 39。 これは、pTyr 恒常性の維持が心筋細胞の機能と恒常性の調節に必要である可能性を示唆しています。

この研究では、サルコメアタンパク質から Z ディスク、中間フィラメント (デスミンなど)、デスモソーム成分、接着斑、接着結合タンパク質、膜受容体、キナーゼ、ホスファターゼに至るまで、機能的に関連する他のさまざまな標的が pTyr を用いて同定されました。 。 たとえば、いくつかの z ディスク関連タンパク質の pTyr が注目されました (完全なリストについては、補足データ 2、3、および 6 を参照)。 Z ディスクタンパク質は、筋肉の収縮と機械的ストレス、成長、代謝シグナル伝達に重要です 40。 また、デスモソームの主要成分であるプラコフィリン 2 タンパク質 (Pkp2) ペプチド Pkp2-Y119 のリン酸化レベルの変化 (R403Q-αMyHC Tg の上方制御と TgErbB2 の下方制御) の変化が両方のマウス モデルで認められました。 Pkp2-Y119 リン酸化の上方制御または下方制御の機能的影響は不明です。 しかし、Pkp2 ホモ接合性欠失は心臓の構造を破壊し、胎児において致死的です 41。 心臓では、デスモソームと PKC 活性を組み立てるために Pkp2 が必要です 42。 この遺伝子の常染色体優性変異は、ARVC の 25 ～ 50% の原因となります。 興味深いことに、TgErbB2 マウスでは、ミオシン変異や HCM を持つ患者と同様に、不整脈や筋原線維の乱れに対する感受性が増加しています 16。 Pkp-Y119 リン酸化の変化は表現型に影響を与える可能性があります。

EGFR1 (ErbB1) 経路は、両方の Tg モデルにおいて心肥大において中心的な役割を果たします。 AG-1478 を使用した EGFR の薬理学的阻害は、インビトロおよびインビボでアンジオテンシン II 誘発性心肥大を防ぎます 43。 ErbB2 心臓特異的過剰発現に関連する同心円状肥大は、ErbB2 に加えて EGFR 受容体チロシンキナーゼ 12 を阻害するラパチニブの早期投与によって逆転する可能性があります。 この研究では、TgErbB2 成体マウスにおける AG-825 による ErbB2 受容体の薬理学的遮断により、筋細胞の乱れは減少しましたが、心機能は維持されず、心肥大も変化しませんでした。 反応の欠如は投与時のマウスの年齢に関連していると考えられます。今回の研究では成体マウスを使用しましたが、以前の研究では子マウスが使用されました15。 また、ビヒクルまたは AG-825 処理後の TgErbB2 における心臓のセリン/スレオニンおよび pTyr プロテオームも評価しました。 我々は、EGFR経路の関与を裏付けるリンプロテオームの全体的な変化を発見した(図8)。 さらに、接着斑、細胞外マトリックス、DCM、HCM、ARCV 経路の変化も確認しました。 KSEA を使用して、その結果と活性化キナーゼのサブセットを組み合わせ、Ntg および TgErbB2 マウスの心臓プロテオームで検出された最も代表的なセリン / スレオニンおよびチロシン キナーゼの上位 40 個に絞り込みました。 AG-825治療は、EGFR経路に対応する14のキナーゼの活性化を阻害または有意に低下させることができ(図8g、h)、AG-825治療が効果的かつ特異的であることを示唆している。 これらの所見を総合すると、心臓プロテオームの変化がセリン/スレオニンおよびpTyrに及ぶことを示しており、上記の経路の関与が確認されている。 さらに、これらのデータは、AG-825 治療によって誘発されるリンプロテオームの変化が心筋細胞の乱れの改善と相関していることを示唆しています。

KSEAは、TgErbB2マウスにおけるk-Rasの下流の標準MAPK経路のメンバーの顕著な下方制御に関与していることを示唆した。 逆に、R403Q-αMyHC マウスでは、接着斑および PDGFR-β シグナル伝達経路 (SRC、LYN、LCK、JAK2、INSR、MAPK1、および HCK) の上方制御が観察されました。 さらに重要なことは、モジュラリティベーススコアリング（MoBas）分析により、ErbB、PDGFRA、接着斑経路が豊富なタンパク質間相互作用サブネットワークと、オーロラキナーゼ B および CSNKA1 の活性化が同定されたことです。 これらのデータは、心肥大の両方のトランスジェニック モデルで多くの標的が重複していることを示しています。 ErbB2 とミオシン重鎖の上流制御因子には顕著な違いがありますが、多くの下流エフェクター分子は共通であり、心肥大をブロックするために小分子阻害剤 (最初は数種類の癌を治療するために設計された) の標的となる可能性があります。

MAPK 経路は、心臓肥大を引き起こす可能性のある適応反応および不適応反応に関与しています (レビュー用 44)。 RAS-RAF-MEK-ERK シグナル伝達経路は、腫瘍治療介入の魅力的な標的です。 いくつかの選択的 RAF および MEK 低分子阻害剤が臨床試験でテストされています 45。 本研究では、R403Q-αMyHC のキナーゼを活性化する MAPK1-Y185 のリン酸化の増加が見出され、MAPK1 活性は心臓肥大に直接関係しています 46。 そのファミリーの中心キナーゼである c-Src は、上流で EGFR 受容体をリン酸化し、とりわけ下流で Stat をリン酸化するため、R403Q-αMyHC で観察される pTyr プロテオーム変化の潜在的な調節因子の 1 つである可能性があります。 c-Src は、心筋細胞における肥大応答に向けた細胞内シグナル伝達のカスケードを引き起こすことにより、心筋細胞の機械的伸長に対する応答に影響を与えます 47,48。 また、c-Src は PXN-Y11849 をリン酸化し、この部位では R403Q-αMyHC マウスのリン酸化が 25 倍増加しました。 興味深いことに、c-Src は、圧力過負荷に応答して MAPK1 および MAPK3 の活性化を媒介します 47。 注目すべきことに、以前の研究では、R403-αMyHC Tg マウスでは圧過負荷誘発性心肥大が悪化することが示されており、R403-αMyHC 変異が心肥大を引き起こすメカニズムは、細胞を介して圧過負荷誘発性のシグナル伝達に対して感受性を高めることによるものであることが示唆されています。 -ソース

R403Q-αMyHC マウスは、活性化部位 (それぞれ Y570、Y694、および Y699) で JAK2、STAT5A、および STAT5B リン酸化の亢進を示しました。これは、MAPK シグナル伝達の活性化だけでなく、JAK-STAT シグナル伝達の活性化も示しています。 Jak-Stat シグナル伝達: IL-6 経路は、IL-6 ファミリーのサイトカイン (IL-6、カルジオトロフィン 1、および白血病阻害因子) に応答して活性化され、EGFR 経路とクロストークし、心肥大に関与します。 この経路には心臓保護効果がありますが、慢性的な活性化は心臓肥大を引き起こす可能性があります (参考文献 44 で概説)。 Vakrouらは、R403Q-αMyHCのmiRNAプロファイルについて経路解析を行った。 これらの著者らは、ケモカインシグナル伝達（CXCR4）、アクチン細胞骨格、心肥大シグナル伝達経路の過剰活性化など、この研究に記載されている発見との類似点を発見しました51。 これらの結果は、筋フィラメントおよび他の心臓タンパク質における pTyr 調節の本質的な関与を示唆しています。 これらの研究から得られた洞察は、サルコメア変異関連の HCM および HCM に関連する可能性のある他の症状における新しい治療アプローチに情報を提供する可能性があります。 研究は、心肥大を発症する 2 つのトランスジェニック マウス モデルに限定されました。 サルコメア突然変異や大動脈バンディングなどの圧力過負荷の他のモデルを調査し、比較することができます。 関連するチロシンリン酸化部位の一部は、化学量論比が低いことと技術的な課題により見逃される可能性があります。 この問題は、リンプロテオミクス研究で評価することが難しい膜結合タンパク質に特に当てはまります。

この研究は、pTyr パターンの変化が HCM の 2 つの異なるモデルで顕著であることを明らかにしました。 さらに、いくつかの共有部位にもかかわらず、病因的に異なる形態の HCM は、EGFR 経路が両方のトランスジェニック モデルの中心であることを示す特異的な pTyr サインを保持している可能性があります。 この証拠は、チルホスチン AG-825 を使用した特定の受容体チロシンキナーゼの阻害と組み合わせることで、心筋細胞の混乱を逆転させ、HCM の治療アプローチとして pTyr プロテオームを操作するアプローチを合理化できる可能性があります。 さらに、これらの研究は、現在癌治療に広く使用されているチロシンキナーゼ阻害剤が、心臓のチロシンキナーゼおよびセリン/スレオニンキナーゼのプロファイルを直接改変することによって心臓機能を変化させる可能性があることを示している。

熱安定化組織からの全心臓溶解物を 1% SDS バッファーに再懸濁し、10 ～ 15 μg を SDS-PAGE で分離し、ニトロセルロース膜に転写しました。 メンブレンをTBS-T緩衝液(20 mmol/L Tris pH 7.4、150 mmol/L NaCl、および0.1% Tween 20)中の5% BSAで室温で1時間ブロックし、その後、一次抗体希釈1:1000でインキュベートしました。 1% BSA-TBS-T中。 ホスホチロシンマウス mAb (pTyr-100、カタログ番号 9411SCST)、TnI ウサギ Ab (カタログ番号 4002SCTS)、Src ウサギ Ab (カタログ番号 2108SCST)、Phopsho-Src ファミリー (Tyr416) ウサギ mAb (D49G4) 、カタログ番号６９４３Ｔ ＣＳＴ）、ＧＡＰＤＨウサギＡｂ（１４Ｃ１０、カタログ番号２１１８Ｓ ＣＳＴ）を４℃で一晩。 5 回洗浄した後、二次抗体を 1% BSA-TBS-T (抗ウサギ IgG-HRP 結合 (カタログ番号 7074S CTS)、抗マウス m-IgGk BP-HRP (カタログ番号 7074S CTS)) で 1:10,000 に希釈しました。 No. sc-516102、Santa Cruz) を使用し、室温で 1 時間インキュベートした後、膜を super signal West Pico 化学発光基質 (Thermo) で発色させ、免疫反応性バンドを iBright 1500 (Invitrogen) を用いた化学発光によって検出しました。画像は取得され、Image J ソフトウェアで分析され、一元配置分散分析を使用してグループを比較し、統計的有意性を決定しました。

すべてのプロトコールは、国立衛生研究所によって発行された「実験動物の使用と管理に関するガイド」および施設内動物管理使用委員会の承認に従って実行されました。 TgErbB2 (B6SJLF1/J 染色) マウスと R403Q-αMyHC (C57/Bl6) マウスは、それぞれ K. Gabrielson 博士と LA Leinwand 博士から入手して 16,17 、繁殖コロニーを確立しました。 雄または雌のマウス (6 ～ 9 か月) をペントバルビタール ナトリウム IP (75 mg/kg) またはイソフルラン (5%) の過剰摂取で麻酔しました。 心臓をすぐに解剖し、熱安定化（Denator T1 Heat Stabilizer、スウェーデン）し、分析するまで-80℃で保存しました。 TgErbB2 および R403Q-αMyHC マウスの心臓 (グループあたり n = 5) を並行して処理しました。 全心臓ライセートを得るために、心室（約 200 mg）を氷冷バッファー：20 mM HEPES、pH 7.6、1 mM、1.5 mM ピロリン酸ナトリウム、PhosStop、および 10 μl/mg（湿重量）の 9 M 尿素でホモジナイズしました。組織の）。 ホモジネートを氷上で冷却し、続いて氷上で短時間マイクロチップ超音波処理し、10,000 × g で 15 分間、4 °C で遠心分離しました。 上清を回収し、Lowry法（Bio-Rad）によりタンパク質濃度を測定した。

心臓溶解物からのタンパク質を、5 mM ジチオスレイトール (DTT) 中で 60 °C で 20 分間還元し、10 mM ヨードアセトアミド (IDA) 中で室温、暗所で 15 分間アルキル化しました。 各サンプル (マウスあたり 30 mg、遺伝子型あたり n = 5 マウス) を、2 M 尿素、20 mM HEPES 緩衝液、pH 8.0 中で、プロテオミクス グレードのトリプシン (Promega) を用いて 1:200 の比率で室温で一晩消化しました。 消化はトリフルオロ酢酸(1% TFA)で停止させた。 サンプルを遠心分離し（１８００ｇで５分間）、上清を固相抽出（ＳｅｐＰａｋ Ｃ１８ １０ｃｃカートリッジ、Ｗａｔｅｒｓ）によって脱塩した。 溶出液は-20℃で3日間凍結乾燥されました。

前述のように、遺伝子型ごとに合計 150 mg のトリプシン処理ペプチドがプールされ、pチロシンが濃縮されました 52。 凍結乾燥したペプチドを１．４ｍｌの免疫沈降緩衝液（ＩＡＰ緩衝液、５０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で混合した。 プロテインアガロースGビーズのストック溶液（Santa Cruz Biotechnology）80μLのスラリーを300μgのホスホチロシンマウスモノクローナル抗体（p-Tyr-100、Cell Signaling Technology）と結合させた。 ビーズ-抗p-Tyr抗体複合体をペプチドのチューブに移し、穏やかに回転させながら4℃で2時間インキュベートしました。 ビーズを洗浄し、それぞれ55μlおよび45μlの0.15%トリフルオロ酢酸(TFA)で溶出した。 2 つの溶出収量をプールしました。 得られたペプチド混合物を固相抽出（ステージチップ C18、Thermo Scientific）によって精製しました。 サンプルを真空遠心分離により乾燥させた。 このアプローチは、3 つの技術的反復で遺伝子型ごとに 15 個の心臓を使用して、3 つのグループすべてからのサンプルを並行して実行して 3 回繰り返されました。 免疫沈降バッファーのフロースルーは、その後の TMT 9 プレックスのために -80 °C で保存されました。 製造業者の指示に従って、トリプシンペプチドを脱塩し、9-plex 等重 TMT (Thermo Scientific) で標識しました。 標識反応を室温で１時間実施し、続いて１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でクエンチした。

リンペプチドを10μlの0.1% TFA、2% ACN (v/v)に溶解し、続いてRF-HPLC-ESI-MS/MS分析を行った。 リンペプチドは、アセトニトリルの直線勾配 (4 ～ 40%) を使用した C18 逆相カラムで 120 分間分離し、次に中性子損失誘発 HCD を備えた LTQ-Orbitrap Elite MS (ThermoFisher Scientific) で分析しました。

生の MS データは Mascot 2.3 で検索され、MS1 抽出イオンクロマトグラムによるラベルフリー定量化は MaxQuant ソフトウェアを使用して実行されました。

ペプチドは、Easy-nanoLC 1200 ナノフロー液体クロマトグラフィー システム (Thermo Scientific) と組み合わせた Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific) で分析されました。 各画分からのペプチドを 10% ギ酸で再構成し、5 μm C18 粒子を充填した Acclaim PepMap100 Nano Trap カラム (100 μm × 2 cm) (Thermo Scientific) に流速 5 μl/分でロードしました。 ペプチドは、EASY-Spray カラム (50 cm × 75 µm ID、PepMap RSLC) 上で 10 ～ 35% 溶媒 B (95% アセトニトリル中 0.1% ギ酸) の直線勾配を使用して 250 nl/min の流速で 120 分間かけて分離されました。 C18、および 2 μm C18 粒子) (Thermo Scientific)。 これは、2.0 kV の電圧で動作する EASY-Spray イオン源に取り付けられました。 質量分析分析は、m/z 350 ～ 1500 のフルスキャンを使用してデータに依存した方法で実行されました。MS と MS/MS の両方は、Orbitrap 質量分析装置を使用して取得および測定されました。 フル MS スキャンは、m/z 200 で 120,000 の分解能で測定されました。前駆体イオンは、高エネルギー衝突解離法 (35) を使用してフラグメント化され、m/z 200 で 30,000 の質量分解能で検出されました。Proteome Discoverer 2.4 が使用されました。 uniport_mouse_120119_UP000000589 に対する識別と定量化用。 使用した検索パラメーターは次のとおりです: (a) トリプシン (最大 2 つの切断ミス)、(b) 最小アミノ酸長: 6、(c) タンパク質の最小ペプチド: 1、(d) 任意の N- 上の固定修飾 TMT6plex末端と溶解残基、システインのカルバミドメチル化、(e) 動的修飾: メチオニンの酸化、N 末端のアセチル、M の Met 損失および M の Met 損失 + アセチル、(f) ペプチドおよびタンパク質の誤発見率 1%レベル。

筋フィラメントが豊富な調製物は、新たに単離した心臓を氷冷PBS (プロテイナーゼ阻害剤Roche 1XおよびPhosStop 1X、Roche)ですすぐことによって得られ、耳介組織を除去し、氷冷標準緩衝液(60 mM KCl、30 mM イミダゾール pH 7.0)中で心室組織を切り刻んだ。 、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、プロテイナーゼ阻害剤Ｒｏｃｈｅ １ＸおよびＰｈｏｓＳｔｏｐ １Ｘ（Ｒｏｃｈｅ製））。 心室組織をホモジナイザー（オムニ組織ホモジナイザー TH）を使用して最高速度で 10 秒のパルスを 2 ～ 3 回、氷上で溶液をホモジナイズし、12,000 g で 15 分間遠心分離しました。 筋フィラメントペレットをスキニング溶液（10 mK EGTA、8.2 mM MgCl2、14.4 mM KCl、60 mM イミダゾール pH 7.0、5.5 mM ATP、12 mM クレアチンリン酸、10 U/mL クレアチンホスホキナーゼ、1% Triton 100X、プロテイナーゼ阻害剤）に再懸濁しました。 s Roche 1X および PhosStop 1X (Roche 製) を使用し、氷上で 30 分間インキュベートしました28。 筋フィラメントペレットを1100gで15分間遠心分離し、標準緩衝液で洗浄した。 新たに単離した筋フィラメントペレットを標準緩衝液で希釈し、Lowery アッセイで定量しました。 各マウスの心臓からの筋フィラメントタンパク質（約 7 mg）を 8 M 尿素および 50 mM 重炭酸トリエチルアンモニウム (TEAB) (Sigma) に再懸濁し、続いて 10 mM ジチオスレイトール (Sigma) で室温で 1 時間還元し、30 mM ヨードアセトアミドでアルキル化しました。 (Sigma) を暗闇の中で 20 分間放置、図 4a ～ d を参照。 次に、シーケンスグレードのトリプシン (1:50) (Promega) を使用して、タンパク質サンプルを 37 °C で一晩消化しました。 トリプシンペプチドを脱塩し、製造業者の指示に従って6-plex同重体タンデム質量タグ(TMT)(Thermo Scientific)で標識した。 標識反応を室温で１時間実施し、続いて１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）でクエンチした。 消化および標識されたペプチドをプールし、C18 SEP-PAK (Waters) で脱塩した後、PTMScan® Phospho-Tyrosine Rabbit mAb (P-Tyr-1000) キット (Cell Signaling Technology) を使用して pTyrsoine を濃縮しました。図 4c を参照してください。 簡単に説明すると、脱塩ペプチドを、50 mM MOPS pH 7.2、10 mM リン酸ナトリウム、50 mM NaClを含む1.4 mlのイムノアフィニティ精製(IP)緩衝液中で再構成した。 抗ホスホチロシン抗体 (p-Tyr-1000、Cell Signaling Technology) をペプチド溶液と混合し、ローテーター上で 4 °C で 2 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、ビーズをIP緩衝液および水でそれぞれ2回および3回洗浄した。 ホスホチロシンペプチドは、0.1% TFA を使用して溶出されました。 溶出されたペプチドサンプルは、LC-MS 分析前に C18 STAGE チップを使用して脱塩され、真空乾燥され、-80 °C に保たれました。 フロースルーから、完全なプロテオームの定量化が行われ、pTyr プロテオーム所見の参照として機能しました。

ホスホチロシンペプチドおよび非リン酸化ペプチドは、Easy-nanoLC 1200 ナノフロー液体クロマトグラフィー システム (Thermo Scientific) と組み合わせた Orbitrap Fusion Lumos Tribrid (Thermo Scientific、米国カリフォルニア州サンノゼ) で分析されました。 各画分からのペプチドを 10% ギ酸で再構成し、5 μm C18 粒子を充填した Acclaim PepMap100 Nano Trap カラム (100 μm × 2 cm) (Thermo Scientific) に流速 5 μl/分でロードしました。 EASY-Spray カラム (50 cm × ID 75 µm、PepMap RSLC) で 95 分間かけて 10 ～ 35% 溶媒 B (95% アセトニトリル中 0.1% ギ酸) の直線勾配を使用して、流速 250 nl/min でペプチドを分離しました。 C18、および 2 μm C18 粒子）（Thermo Scientific）を使用し、2.0 kV の電圧で動作する EASY-Spray イオン源に取り付けました。 質量分析は、m/z 350 ～ 1500 の範囲でフルスキャンを行い、データに応じて実行されました。MS と MS/MS の両方は、Orbitrap 質量分析装置を使用して取得および測定されました。 フル MS スキャンは、m/z 200 で 120,000 の分解能で測定されました。前駆体イオンは、高エネルギー衝突解離法を使用してフラグメント化され、m/z 200 で 30,000 の質量分解能で検出されました。

MaxQuant 1.5 は、頻繁に観察される汚染物質が追加されたマウス RefSeq データベース (バージョン 78) に対する定量と同定に使用されました。 使用した検索パラメーターは次のとおりです。 (a) タンパク質分解酵素としてのトリプシン (最大 2 つの切断が失敗)。 (b) 10 ppm のペプチド質量誤差許容度。 (c) フラグメント質量誤差許容値 0.02 Da。 (d) 固定修飾としてのリジン残基およびペプチド N 末端上のシステイン (+57.02 Da) および TMT タグ (+229.16 Da) のカルバミドメチル化、メチオニンの酸化 (+15.99 Da) およびセリン/スレオニン/チロシンのリン酸化 (+79.96 Da) Da) 変数の変更として。 2 つの切断ミスが許可され、「実行間の一致」が有効になりました。 ペプチドとタンパク質は 1% の誤検出率でフィルタリングされました。 q値が0.05未満のタンパク質は、統計的に有意な発現差があるとみなされます。

心臓の形態と機能は、意識のあるマウスの 40 MHz 超音波プローブを備えた高解像度高周波システム (Vevo 2100、VisualSonics、カナダ) を使用した経胸壁心エコー検査によって評価されました 22,53。 機械的および化学的な胸毛除去は、剃毛と市販の脱毛剤を使用することによって行われました。 中核温度は、直腸プローブを介して監視され、加熱ランプを使用して 36.5 ～ 37 °C に維持されました。 心臓の胸骨傍の長軸および短軸のビューは、最適化されたフレーム レートで B モードと M モードの両方でキャプチャされました。 LV 拡張末期 (LVIDd、mm) および収縮末期 (LVIDs、mm) の内径、心室中隔 (IVS、mm) と LV 後壁の両方の拡張末期壁厚 (LVPW、mm)、LV 駆出率 ( EF、%) および短縮率 (FS、%) は、M モードを使用して長軸像で測定されました。 肥大の尺度である相対壁厚 (RWT) は、IVSd+LVPWd/LVID として計算されました。 僧帽弁流入、左心室流出および基底中隔におけるパルスドップラー記録を記録した。 デジタル画像を保存し、市販の Vevo LAB ソフトウェア (VisualSonics、カナダ) を使用してオフラインで分析しました。 実験グループを知らされていない経験豊富な心エコー検査技師がすべての測定を実行しました。

ImageJ ソフトウェアを使用してバンドの密度を測定し、pSRC、SRC、GAPDH、TnI、および総 pTyr のバンドに対応する曲線の下の面積を計算しました。 次に、pTyr/TnI、SRC/GAPDH、pSRC/GAPDH、および pSRC/SRC 比を計算し、一元配置分散分析を使用してグループ間で比を比較しました。

心筋細胞の乱れに対する AG-825 の効果を特徴付けるために、Web グラフィック ユーザー間期 CytoSpectre32 を使用して、組織切片全体にわたる心筋細胞の局所的な配向を決定しました。 ランダムに選択された領域において、筋細胞の平均配向角円分散が計算されました。 群(Ntg+媒体、Ntg+AG825、TgErbB2+Veh、TgErbB2+AG825)間の統計的比較は、一元配置分散分析を用いて行われた。

ラベルフリーのデータセットの統計分析は、Perseus ソフトウェア 54 を使用して実行されました。 検出率が 50% 未満のペプチドはフィルタリングされ、思い出させるペプチドの強度の欠損値が k 最近傍で埋められました。 次に、log2 強度を中央値減算、ANOVA、誤検出率計算によって正規化しました。 ヒートマップを使用して、ANOVA 検定による p 値 <0.05 でタンパク質の教師なし階層クラスター化を視覚化しました。 収集された TMT 標識プロテオミクス データの統計分析については、Foster et al.21 のワークフローにいくつかの変更を加えたものに従いました。 まず、Partek ソフトウェアを使用して、各ペプチドの強度の p 値、q 値、倍率変化、および比率を計算しました。 欠損密度値が 50% 未満のリン酸化サイトは統計解析の対象となり、思い出させた欠損値が k 最近傍で埋められました。 次に、中央値の減算によって Log2 密度を正規化し、データセットの選択した各リン酸化サイトから変化倍数、比率、および統計的有意性 (q および p 値) を決定しました。 火山プロットは GraphPad Prism 7® を使用して作成されました。 教師なし PCA は、Partek® ソフトウェアを使用して両方のデータセットで個別に使用されました。 データセットは、pTyr 存在量に関する各コンポーネントとともに分離されました (正規化、平均 = 0、分散 = 1)。

log2 強度の減算によって完全なプロテオームへの正規化が行われ、その後、両側 t 検定と、Herbrrich らによって開発されたアルゴリズムを使用した緩和された p 値と q 値の計算が行われました 55。 この分析には R ソフトウェアを使用しました。

超幾何 p 値を使用して、症例サンプルと対照サンプル間で差次的にリン酸化されるタンパク質およびリン酸化部位の有意に濃縮されたプロセスを特定しました。 この目的のために、MsigDB23 を使用してタンパク質レベルの経路を分析し、PTMsigDB24 を使用してサイトレベルでのプロセスを分析しました。 濃縮が計算される集団/バックグラウンドは、広く知られているすべてのタンパク質/リン酸化サイトではなく、リンプロテオミクス実験でその部位が定量化されるすべてのタンパク質に限定されます。

KSEA は、特定の条件下でリン酸化レベルの大幅な変化を標的とするキナーゼの同定を目指しています。 KSEA は、次のように基質 S のセットを使用して各キナーゼ k をスコア付けします。

ここで、\({\bar{P}}_{S}\) はキナーゼ k のすべての基質の倍数変化の平均 log2 を示し、\(\bar{P}\) と σ は平均値と標準値を表します。データセット内のすべての同定されたリン酸化サイトの変化倍数の log2 の偏差。 KSEA は、データセット内のすべての基質ではなく、モジュール内の基質に S を制限することにより、特定されたモジュールに対して実行されました。 PhosphoSitePLUS30 によって提供されたデータは、キナーゼと基質の関連性の参照として使用されました。 このツールは、M. アヤティ博士の Web サイトから入手できます: https://faculty.utrgv.edu/marzieh.ayati/software.html

まず、ノードがタンパク質を表し、エッジが BioGRID22,56 から取得した PPI を表すネットワークが作成されました。 実験から個別に得られた各タンパク質（すなわち、Ntg、TgErbB2、およびR403Q-αMyHC Tg）上に存在するリン酸化サイトの平均倍率変化を計算することにより、タンパク質にネットワーク内のスコアを割り当てました。 次に、MoBaS22 を適用して、高度に接続され、異なるリン酸化を受けたタンパク質のサブネットワークを特定しました。 サブネットワークを視覚化するために、さまざまな条件におけるタンパク質の平均倍率変化に基づいてタンパク質が色付けされます。 あるデータセット内のタンパク質が別のデータセットで識別されない場合、ノードは灰色で表されます。

一元配置分散分析を使用してグループ間の差異を比較し、心エコー検査データを分析しました。 AG-825 またはビヒクル治療、治療前後の効果については、t 検定を使用しました。

実験は反復して行われました (「方法」セクションを参照)。 MS 生データからのペプチドの同定には Mascot (バージョン 2.3) を使用し、定量には MaxQuant (バージョン 1.5) を使用しました。 統計分析は、R (バージョン 4.0)、Partek Genomics Suite (バージョン 7.0)、GraphPad Prism 7.0、および Perseus (バージョン 1.5) を使用して実行されました。 データ処理の詳細については、「方法」セクションで説明します。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

質量分析プロテオミクス データは、データセット識別子 PXD036506 とともに PRIDE57 パートナー リポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。 補足データ 1 には、図および図に示されているグラフの数値ソースが含まれています。 補足の図6には、図1の切り取られていないウェスタンブロットが含まれています。

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記載されているプロジェクトは、GARC への助成金番号 K01-HL13368-01、NIH からの 5 T32 HL 7227-43、T32HL125239-05、T32HD044355、AMM への AHA 15GRNT25720026、R01 HL1 によって支援されました。 3691 から NP、R01 KG への HL088649 および MA への R01LM012980 その内容は著者のみの責任であり、必ずしも NIH の公式見解を表すものではありません。トランスジェニック マウス R403Q-αMyHCTg を促進してくださった Leslie Leinwand 博士に感謝します。 中国国家科学財団 (81870364)、深セン龍崗区科学開発研究財団 (LGKCYLW2021000020)、中国広東省自然科学財団 (2022A1515012468) が MX をサポート

これらの著者は同様に貢献しました: Mingguo Xu、Kevin C. Bermea、Marziehayati。

米国メリーランド州ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学医学部小児科/心臓病科

ミングオ・シュウ、ケビン・C・バーメア、アミール・ヘラヴィ、アレン・D・エヴェレット、アン・M・マーフィー、ヘナロ・A・ラミレス＝コレア

518115 中国深セン市龍崗区第三人民病院小児科

徐明国

テキサス大学リオグランデバレー医学部、コンピューターサイエンス学部/工学およびコンピューターサイエンス学部、米国テキサス州エディンバラ

マルズィエ・アヤティ

ジョンズ・ホプキンス大学医学部、神経内科/細胞工学研究所、米国メリーランド州ボルチモア

[ダウンロード] をクリックして Han Byeol Kim - Chan Hyun Na mp3 youtube com を保存します

中国済南市、山東大学Cheeloo医科大学Qilu病院麻酔科

ヤン・シャオメイ

分子科学部門/UT Health リオグランデバレー、マッカレン、テキサス州、米国

アンドレス・メディナ & ヘナロ・A・ラミレス＝コレア

米国メリーランド州ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学医学部小児科/血液内科

フー宗明

中国済南市、山東大学Cheeloo医科大学Qilu病院心臓病科

張新宇

米国メリーランド州ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学医学部生物化学部門/マキューシック・ネイサンズ遺伝医学研究所

チャン・ヒョナ

米国メリーランド州ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学医学部分子・比較病理学部門

キャスリーン・ガブリエルソン

米国メリーランド州ボルチモアのジョンズ・ホプキンス大学医学部医学部/循環器内科

D. ブライアン・フォスター & ナザレノ・パオロッチ

パドバ大学生物医科学部（イタリア、パドバ）

ナザレネ・パオロッチ

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MX、AM、HBK、XY、XF、AH、XZ、CHN が実験とデータ分析を実施、AE、KG、DBF、NP が統計サポートと批判的レビューを提供、KCB、MA がバイオインフォマティクスと統計サポートを提供、MX、KCB、 NP、AMM、および GARC が原稿を執筆し、AMM と GARC が研究を設計し、作業を監督しました。

アン・M・マーフィーまたはヘナロ・A・ラミレス＝コレアへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Brian Delisle と他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Tami Martino と Joao Manuel de Sousa Valente。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Xu、M.、Bermea、KC、Ayati、M. 他。 心臓プロテオームおよび EGFR 経路のチロシンリン酸化の変化は、肥大型心筋症の一因となります。 Commun Biol 5、1251 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04021-4

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受信日: 2020 年 11 月 9 日

受理日: 2022 年 9 月 22 日

公開日: 2022 年 11 月 15 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04021-4

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