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免疫療法

白血病 (2023)この記事を引用

7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

HLA ハプロ同一移植では、制御性 T 細胞 (Treg) を従来の T 細胞 (Tcon) と同時注入すると、移植片対白血病効果 (GvL) を維持しながら移植片対宿主病 (GvHD) から保護します [1、2、3] 。 GvHD の予防は、樹状細胞 (DC) 上の CD80/CD86 の CTLA-4 依存性下方制御によるものである可能性があります [4]。一方、GvL 効果は、T 細胞の増殖を抑制する Treg の能力に関連している可能性がありますが、T 細胞の活性化には関連していません。 5]。ここでは、移植患者の骨髄における CD161+ Treg の選択的局在について説明しました。この集団は、炎症誘発性サイトカインを産生できることがすでに記載されている[6]が、GvL効果を維持できる微小環境を開発するための基礎となる可能性がある。 20人の患者が募集され（補足方法）、2×106/kgのTreg、1×106/kgのTcon、および大量のCD34+細胞を含むハプロHSCTを受けました[1、2、3]。移植後 1、3、6、および 12 か月目に末梢血 (PB) および骨髄 (BM) サンプルを収集しました。

BM-DC および PB-DC は、補足表 1 にリストされている抗体を使用して、BD FACS Lyric System (BD Biosciences、カリフォルニア州ラホーヤ) で分析されました。 DC は、抗 CD123 (形質細胞様 DC、pDC の場合) および抗 CD123 を使用して分類されました。 CD11c Abs (骨髄性 DC、mDC 用) (補足表 1)、リアルタイム RT-PCR によりインドールアミン 2,3-ジオキシゲナーゼ 1 (IDO-1)、インターロイキン (IL)-6、IL の発現を分析-10、プログラムされたデスリガンド 1 (PD-L1) およびトランスフォーミング成長因子ベータ 1 (TGFB1) (補足表 2)。 BM および PB-CD11c+ DC を患者から収集し、自己 CD3+ 細胞と共培養しました。 CD161+ Treg を生成するために、健康なドナー (HD) の PB から細胞を精製し、IL-2、IL-6、および TGF-β とともに培養し、機能アッセイに使用しました (補足方法を参照)。

スチューデントの t 検定と ANOVA 分析を実行し、続いて Tukey および Sidak の多重比較検定を実行しました。すべての統計テストは、Stata バージョン 13 (StataCorp、テキサス州カレッジステーション、米国、RRID:SCR_012763) および GraphPad Prism ソフトウェアバージョン 9 (RRID: SCR_002798、カリフォルニア州サンディエゴ、米国) を使用して、α レベル 0.05 で評価されました。。

登録された患者の臨床転帰 (GvHD、再発率、TRM) は、公表されているデータと一致していました [3]。登録されたすべての患者は完全なドナーキメラ現象を持っています。フローサイトメトリー分析により、移植後最初の 1 か月で、mDC の割合が PB (範囲 0 ～ 0.18%) サンプルよりも BM (範囲: 0.16 ～ 2.03%) サンプルで有意に高かったことが明らかになりました (図 1A)。 BM由来のmDCは、移植後12か月で、より高いレベルの共刺激受容体CD86を発現しました（MFI範囲PB：411〜548、BM：603〜859）（図1B）。 pDC には差異は見られませんでした。 RT-PCRにより、PB-mDCではIL-6およびTGF-βの発現が移植後に徐々に減少するのに対し、BM-mDCではほとんど変化しないことが示されました（図1C、D）。このため、移植から 12 か月後、PB-mDC における IL-6 分泌は BM-mDC よりも大幅に減少しました (図 1C)。一方、免疫チェックポイント制御因子PD-L1の発現は、BM-mDCと比較して、PB-mDCでは極めて高いままでした（図1E）。これは、PB-mDC に免疫抑制サインが存在することを示しています。共刺激分子と免疫チェックポイントの発現は、Carenza らと同様でした。 [7]。

A 移植後最初の 1 か月では、mDC の割合は PB よりも BM の方が高かった (*Student の t 検定: p < 0.05)。 B BM由来のmDCは、PB由来のmDCと比較して、より高いレベルの共刺激受容体CD86を発現しました（MFI値として表示）（**スチューデントのt検定：p < 0.01）。 C、D リアルタイム RT-PCR では、移植後、PB-mDC では IL-6 および TGF-β の発現が徐々に減少する一方、BM-mDC ではレベルが安定していることが示されました。 (*スチューデントの t 検定: p < 0.05)。 E リアルタイム RT-PCR は、BM-mDC と比較して PB-mDC で有意に高い PD-L1 レベルを示しました (* スチューデントの t 検定: p < 0.05; *** スチューデントの t 検定: p < 0.001)。すべてのデータ (A ～ E) は平均値 ± SD として表されます。 F CD3+、CD4+、および CD8+ T 細胞のパーセンテージは、BM と PB 間、および初期および後期追跡段階間で同等でした (スチューデントの t 検定: p > 0.05) (ANOVA: p > 0.05)。データは平均として表されます。 G 左パネル。 BM 由来 CD8+ T 細胞は、PB 由来 CD8+ T 細胞よりも高い共刺激受容体 CD28 の発現を示しました (30.3% ± 18.8 vs 9.2% ± 4.9; *Student の t 検定: p < 0.05)。データは平均±SDとして表されます。右パネル。免疫チェックポイント阻害剤 PD-1 の発現は、PB 由来 CD4+ (69% ± 29 vs 24% ± 11; *Student の t 検定: p < 0.05) および CD8+ (65% ± 25 vs 4% ±) で有意に高かった。 3; *スチューデントの t 検定: p < 0.05) BM 由来 T リンパ球よりも T 細胞。データは平均±SDとして表されます。 H CD3+/CFSE+-mDC の共培養では、BM-mDC の存在下で T 細胞を培養した場合に有意に高い T 細胞増殖率が示されました (25% ± 7.2 vs 6.7% ± 8.7; *Student の t 検定: p < 0.05) ）。データは、3 回の独立した実験の平均 ± SD として表されます。

T 細胞コンパートメントの分析により、BM と PB の CD3+、CD4+、および CD8+ 細胞の割合は同等であったが (図 1F)、BM 由来の CD8+ T 細胞は 3 か月目に、co PB 由来 CD8+ T 細胞と比較した - 刺激受容体 CD28 (30.3 ± 18.8 vs 9.2 ± 4.9; Student の t 検定: p < 0.05) (図 1G 左パネル)。さらに、免疫チェックポイント阻害剤 PD-1 の発現は、PB 由来 CD4+ (69% ± 29 vs 24% ± 11) と CD8+ (65% ± 25 vs 4% ± 3) の両方で 3 か月目に有意に高かった。 ; スチューデントの t 検定: p < 0.05) T 細胞は BM 由来 T リンパ球よりも優れています (図 1G 右パネル)。 BM と PB の両方の T 細胞は、非常に低レベルの T 細胞枯渇マーカー TIM3 を発現します (CD8+: PB で 1.93% ± 1.46 対 BM で 1.87% ± 1.45、CD4+: PB で 1.10% ± 1.22 対 5.43% ± 5.35 インチ) BM)、2 つのコンパートメント間に有意差はありません (スチューデントの t 検定: p > 0.05)。 PD-1 ターゲティングによる CD8+ 細胞の救済は CD28 依存性であり、T 細胞共刺激受容体は PD-1 阻害の主な標的です [8]。

移植患者のBMまたはPB微小環境におけるT細胞の活性化/阻害におけるmDCの役割を調査するために、我々は、CD3+ T細胞（移植後3か月目に患者から得た）をリンパ球とともに培養する混合リンパ球培養を実施した。自家BMまたはPB由来のmDC。これらの in vitro 研究は、T 細胞を BM 由来 mDC の存在下で培養すると、T 細胞の増殖が有意に高くなる (25% ± 7.2 vs 6.7% ± 8.7; Student の t 検定: p < 0.05) ことを実証しました (図 1H)。。

これらのデータは、Treg/Tcons免疫療法と関連したハプロ同一移植が、BMにおける活性化表現型とPBにおける寛容原性活性を有するDCの再構成を促進することを示している。さらに、T-Rex (追跡応答者拡大) アルゴリズムを使用して、BM および PB サンプルからのフローサイトメトリーデータを分析しました。この教師なし機械学習分析により、移植後最初の数か月から移植患者のBM内で、CCR4、CD161、およびHLA-DR陽性を特徴とするTreg細胞の特定のクラスターを特定することができました（図2A〜C）。。この集団 [6] は、Treg 細胞の他の部分集団と同様の表現型特徴を持っていますが、炎症性サイトカインの存在下で Th17 細胞の表現型プロファイルを発現するように誘導できます。特に、これらの Treg 細胞は、末梢血と比較して、炎症性関節炎患者の炎症を起こした関節内に豊富に存在することが判明しました。しかし、インビトロ分析は、「IL-17潜在力」を持つこのTreg細胞亜集団によるIL-17産生が必ずしも炎症誘発性機能の獲得を伴わないことを示唆している[9]。興味深いことに、CD161 + Tregの割合は、急性骨髄性白血病患者と急性リンパ芽球性白血病患者の間で差がありませんでした（補足図1C）。リアルタイム RT-PCR により、BM-mDC における IL-6 および TGF-β の一定の発現が示され、これらのサイトカインの両方がナイーブ T 細胞において Th17 表現型を誘導できることがすでに実証されているため [10]、本発明者らは次のような仮説を立てた。彼らはまた、この Treg 亜集団の発達にも役割を果たす可能性があります。これらの仮説を確認するために、HD の PB から精製した活性化 Treg を、IL-6、TGF-β、またはその両方で in vitro で刺激したところ、2 つのサイトカインの組み合わせで刺激された細胞は、10 日間の培養後に次のような反応を示したことがわかりました。未処理の細胞、またはIL-6もしくはTGF-β単独で処理した細胞と比較すると、CD161の発現が有意に高かった（一元配置分散分析、Tukey HSD検定：p < 0.01）（図2D）。

アッパーパネル。細胞表現型の変化が 95% 以上の統計的閾値に基づいた骨髄および末梢血 Treg の T-REX 分析による UMAP プロット。ピンクと赤色は、T-REX によって同定された表現型変化の領域を示し、骨髄サンプルでの発現率が高くなります。青い領域は末梢血が豊富です。 (明るい色: 85 ～ 95% の変化、暗い色: ≥95% の変化)。下部パネル。 95% 以上の変化の領域に対する DBSCAN クラスタリング。 B DBSCAN クラスターにおける Treg マーカーの MEM 濃縮を示すヒートマップ。 C 骨髄および末梢血サンプル中の CCR4、CCR6、CD161、CD39、HLA-DR の高発現を示す Treg の割合。各患者は線で表されます。 *p < 0.05 (両側のペアのあるウィルコクソン検定)。 D IL-6 と TGF-β の両方で処理した PB 由来 Treg (CD4+CD25highCD127-/low) は、培養 10 日後に CD161 の有意に高い発現を示しました (一元配置 ANOVA、Tukey HSD 検定: *)未処理の細胞、またはIL-6もしくはTGF-β単独で処理した細胞と比較した場合、p < 0.05、**p < 0.01)。未処理 = T Cell TransAct™ と IL-2 でのみ活性化された細胞。データは、3 回の独立した実験の平均 ± SD として表されます。 E グラフは、CD161+ Tregs の機能活性を示します。左パネル。 4日間実施した混合リンパ球反応におけるTrans Act刺激Tconの増殖に対するCD161+ Tregおよび拡張Treg（Tregと呼ばれる）の抑制活性。データは、3 つの独立した実験の平均 ± SD として表示されます (二元配置 ANOVA、Sidak の多重比較検定; ****p < 0.0001; ***p = 0.0009)。右パネル。 TconsによるK562細胞株の死滅、エフェクター:ターゲット比1:20。示されている場合、Tcon は、異なる Treg:Tcon 比、それぞれ 1:2 および 1:5 で、CD161+ Tregs および拡張 Tregs (Treg と呼ばれる) と共培養されました (3 回の実験の平均 ± SD; 一元配置 ANOVA、Tukey の多重比較)テスト: Tcon 単独 vs + CD161+ Tregs 比 1:2 **p = 0.001; vs + Tregs 比 1:2 ****p < 0.0001; vs + CD161+ Tregs 比 1:5 *p = 0.021; vs + Tregs 比1:5 ****p < 0.0001; + CD161+ 対 Tregs 比 1:2 *p = 0.011; + CD161+ 対 Tregs 比 1:5 *p = 0.015)。 F CD45+CD3+CD4+CD25highCD127-/lowCD161+ として定義される CD161+ Tregs および拡張 Treg（Treg と呼ばれ、CD45+CD3+ として定義される）上の RORγt、FOXP3、HLA-DR、CCR4、および CCR6 の発現のフローサイトメトリー分析CD4+CD25highCD127-/low (3 回の実験の平均 ± SD; 二元配置分散分析、Sidak の多重比較検定、**p = 0.005; ****p < 0.0001)。

さらに、in vitro で生成された CD161+ Treg をより詳しく調査するために、同じドナーに由来する増殖 Treg 細胞の集団を対照として使用して抑制および細胞毒性アッセイを実施しました (n = 3 例) [11、12]。抑制アッセイでは、Tcon を自己 CD161+ Treg または増殖した Treg と 1:2 および 1:5 の Treg/Tcon 比で培養しました。培養 4 日後、Treg/Tcon 比 1:2 および 1:5 の両方で、CD161+ Treg 対増殖 Treg を介した抑制活性がそれぞれ有意に低いことが示されました (28.7% ± 2.1; 17.3% ± 3.8; 44.2% ± 7.2; 26.7% ± 1.1; 一元配置分散分析: ****p < 0.0001; ***p = 0.0009、図 2E 左パネル)。逆に、細胞毒性アッセイは、K562 腫瘍細胞株の存在下で、自己 CD161+ Treg 細胞または増殖 Treg 細胞 (Treg/Tcon 比 1:2 および 1:5) の両方と Tcon を共培養した 24 時間後に実行されました (補足方法)。 CD161+ Treg は、Treg/Tcon 比がそれぞれ 1:2 および 1:5 の両方で、増殖した Treg 細胞と比較して、Tcons を介した腫瘍死滅率が有意に高いことを実証しました (38.9% ± 7.0 vs 22.2% ± 5.5; 46.7% ± 4.3 vs 30.9% ± 2.3; 一元配置分散分析: *p = 0.0108; *p = 0.015、図 2E 右パネル)。全体として、CD161+ Treg細胞は、増殖したTreg細胞と比較してTconの増殖をより低い程度に抑制し、Tconを介した「許容的な」殺傷能力を好むことがわかりました。これらのデータは、GvL 方向への偏りを媒介する際の CD161+ Treg の役割を示唆しています。

さらに、CD161+ Treg 表現型の詳細な分析により、増殖した Treg と比較して CCR4、CCR6、および HLA-DR の発現が高いことが示されました。 CD161+ Tregs は、Th17 系統の転写因子である RORγt の発現も高かった [13]。反対に、FOXP3 発現は 2 つの細胞集団間で差がなく、これらが両方とも Treg であるという証拠が裏付けられました (図 2F)。

CD161+ Treg が GvL に対して許容的な役割だけを果たしているのか、それとも骨髄微小環境で炎症促進作用を発揮する積極的な役割を果たしているのかを明らかにするには、さらなる研究が必要です。しかし、我々の結果は、CD161+ Treg が、IL-6 および TGF-β を産生する BM 由来 mDC と Treg の相互作用に由来することを示唆しています [14]。

これらの発見は、Ruggeri らによって観察されたものと一致しています。彼らは、ドナーTregがGvL反応性を維持しながらGvHDを妨げる能力は、蔓延しているCD45RO+CXCR4-表現型によるものであり、これによりTregが骨髄に局在して抑制活性を発揮することが妨げられるのではないかと仮説を立てている。したがって、Ruggeri らによって提案されたメカニズムは、移植後の最初の数週間は、GvL 反応性が蔓延している可能性がありますが、その後の数か月間、効果的な GvL 反応性が維持されているのは、骨髄における CD161+ Treg 集団の発生による可能性があります。

Treg と DC の相互作用をより深く理解することは、BM で GvL を選択的に促進し、末梢組織で免疫抑制的な微小環境を誘導し、GvHD の発症を阻止できる将来の治療戦略の基礎となる可能性があります。

ディ・イアンニ M、ファルゼッティ F、カロッティ A、テレンツィ A、カステリーノ F、ボニファシオ E 他 Treg は GVHD を予防し、HLA ハプロ同一移植における免疫再構成を促進します。血。 2011;117:3921–8。

論文 PubMed Google Scholar

マルテッリ MF、ディイアンニ M、ルッジェリ L、ファルゼッティ F、カロッティ A、テレンツィ A 他 HLA ハプロ同一性移植と制御療法および従来の T 細胞養子免疫療法は、急性白血病の再発を予防します。血。 2014;124:638–44。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ピエリーニ A、ルッジェリ L、カロッティ A、ファルゼッティ F、サルディ S、テレンツィ A 他急性骨髄性白血病に対するハプロ同一の年齢適応骨髄破壊的移植および制御性 T 細胞およびエフェクター T 細胞。血液Adv. 2021;5:1199–208。