皮質の新しいモデル

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7809 (2023) この記事を引用

1316 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ヒト人工多能性幹細胞 (iPSC) に由来するヒト皮質オルガノイド (hCO) は、複雑な三次元組織におけるヒトの脳の発達と疾患のメカニズムを解明するためのプラットフォームを提供します。 しかし、現在の hCO 開発方法には、正常な皮質形成と脳の発達に不可欠であることが示されている周囲の髄膜層などの重要な非神経組織が欠けています。 ここでは、最初に単一のロゼットから hCO を生成し、5 日目までに約 250 μm の一貫したサイズを持つより均質なオルガノイドを作成しました。次に、3D 共培養システムを利用して、脳オルガノイドを最初から髄膜細胞の薄層でカプセル化しました。皮質発達の初期段階。 免疫染色分析を実行して、発生のさまざまな段階でさまざまな皮質層マーカーを表示しました。 IncuCyte を使用したオルガノイド発生のリアルタイムモニタリングでは、時間の経過とともに強化された形態と増加した成長速度が示されました。 われわれは、髄膜にカプセル化されたオルガノイドが、カハール・レツィウスニューロンによるREELINのより高い発現を示すことにより、より良好な層状組織化を示すことを発見した。 髄膜細胞の存在により、TBR2 中間前駆細胞 (IPC)、皮質深部層 (CTIP2)、および皮質上部層 (BRN2) がさらに拡大しました。 最後に、髄膜に包まれたオルガノイドは、それぞれHOPXおよびGFAPマーカーのより強力な発現によって示される、外放射状グリアおよび星状膠細胞の形成を増強した。 この研究は、生体内皮質脳構造をより厳密に模倣する新しい 3D 共培養プラットフォームを提示し、胚発生中の神経発達障害の根底にあるメカニズムをより適切に調査できるようにします。

人間の脳は、ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、稀突起膠細胞などの複数の細胞タイプで構成されています。 多能性幹細胞に由来する現在の脳オルガノイドシステムは、人間の皮質の発達を再現するための重要な in vitro モデルを提供し、健康な状態と病気の状態の両方での脳の発達を研究することを可能にします 1,2,3,4,5。 ただし、現在の in vitro モデル システムには、再現性と適用性に影響を与える可能性のあるいくつかの制限があります。 そのような制限の 1 つは、出発細胞集団、培養条件、細胞の自己組織化特性の違いによって生じる可能性があるバッチ間の変動です 6,7。 この制限に対処することは、人間の脳を研究するための信頼できるモデルとしてオルガノイドを開発するために重要です。 単一ロゼットベースのアプローチを導入することにより、より一貫性と再現性のあるオルガノイドを生成することができ、その結果、初期の脳発達の側面をよりよく模倣する、より均質で明確なオルガノイドが得られます。

オルガノイド モデルのもう 1 つの限界は、人間の脳に見られる完全な細胞多様性の欠如です 8。 オルガノイドは人間の脳にある細胞タイプの一部を生成できますが、すべての細胞タイプが表現されるわけではありません。 これにより、人間の脳の発達および構造的側面を適切な複雑さで完全に再現するために必要な適切な信号伝達が制限される可能性があります。 この限界を克服するために、私たちのアプローチは、脳の発達において極めて重要な役割を果たす重要な細胞型として髄膜細胞を組み込むことです。 非神経脳細胞の一種である髄膜は、皮質発達の非常に初期の胎児段階から存在し、正常な皮質形成と脳構造の形成に必要であると考えられています9、10、11、12。 最近の研究では、in vitro および in vivo で新しいニューロンを生成できる神経前駆体マーカーを発現する髄膜内の NSC 集団の非実質ニッチが特定されました 13,14。 脳の発達中、髄膜は皮質形成に必要なさまざまな形態形成因子を放出することで、hCO の発達に重要な役割を果たします。 インビトロ研究では、髄膜細胞が適切な皮質形成に不可欠な FGF-215、IGF216,17、CXCL1218,19,20,21 およびレチノイン酸 22,23,24 を分泌できることが示されています。 また、in vivo 研究では、髄膜が腹側前脳の発達に重要な役割を果たすソニック ヘッジホッグ (Shh) や背腹側を制御する骨形成タンパク質 (BMP) ファミリーなど、非常に多くのシグナル伝達分子を分泌していることも実証されています。神経管のパターニング25． 髄膜によって分泌されるその他の因子には、線維芽細胞成長因子 (FGF) ファミリーのメンバー、Wnt、および Notch が含まれます。これらは、神経新生を含むさまざまな発生プロセスにおける細胞の増殖、分化、生存の制御に関与します 1,26,27,28。 29. 髄膜のラミニンが豊富な領域は、これらの因子の放出を制御するために不可欠であるという仮説が立てられています。 したがって、髄膜の存在は脳オルガノイドの発生にとって重要であると考えられます 30。

単一のオルガノイド組織内で異なる脳領域を組み合わせる共培養法は、異なる領域間の複雑な相互作用をモデル化し、神経発達欠陥を研究することが以前に示されています 31。 例えば、蛍光レポーターを使用することにより、CXCR4依存性GABA作動性介在ニューロンが腹側前脳から背側前脳に移動することが証明されており、これは神経疾患の研究や潜在的な治療法の試験に使用されています32。 しかし、髄膜細胞を脳オルガノイドと組み合わせて使用​​して、脳オルガノイドの発生に対するこれらの細胞の影響を研究した人は誰もいません。 この研究では、共培養システムを利用して髄膜細胞と組み合わせて皮質脳オルガノイドを生成し、モデルシステムにおける初期脳発達の層状組織化の進行における髄膜細胞の役割を研究しました。

この研究では 3 つの人工多能性幹細胞 (iPSC) 細胞株が使用されました。 CC1 および CHD2 はさまざまな個人の皮膚生検から取得され、PCDH19-WT (市販の包皮線維芽細胞) は研究室のメンバーによって事前に生成されました 20,21。 すべての iPSC 細胞株は、ミシガン医学の治験審査委員会による事前の承認を得て実施されました。 iPSC は、Geltrex でコーティングされた (Fisher Scientific) 30mm ディッシュの 1:200 希釈液と TeSR™-E8™ (StemCell Technologies) で培養されました。 細胞は週に 1 回定期的に継代され、すべての実験で 35 回目の継代数になる前に使用されました。

ヒト髄膜細胞はヒト軟髄膜に直接由来しており、市販されています (ScienCell カタログ #1400)。 軟髄膜細胞は継代 1 で凍結保存され、冷凍状態で配送されました。 各バイアルには、1 ml 容量中に 5 × 105 個を超える細胞が含まれています。 HMC は免疫蛍光によって特徴づけられました。 それらはすべてフィブロネクチンについては陽性であり、GFAPおよびα-平滑筋アクチンについては陰性です。 5 × 105 細胞/ml、継代 0 で購入（1 ml/バイアル）し、500 ml の基礎培地、10 ml のウシ胎児血清および 5 ml の髄膜細胞増殖サプリメントからなる髄膜細胞培地 MenCM で増殖させました。ペニシリン／ストレプトマイシン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌカタログ＃１４０４）培地を３継代まで使用した。

皮質オルガノイドを生成するには、70〜80％のコンフルエンスで未分化iPSCを使用しました。 プレートの準備から始めるために、30 μl の 100% 濃縮 Geltrex を 12 ウェル プレートの各ウェルの中央に滴下し、インキュベーター内に 20 分間放置して泡として固化させました。 次に、DMEM/F12 (1:100) で希釈した Geltrex を使用して、Geltrex バブルの周囲の表面の残りの部分をコーティングしました。 次に、iPSC 細胞を Accutase (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) によって Geltrex コーティングプレートで解離し、TeSRTM-E8TM 培地中の 8 × 105 個の細胞をバブルに直接ではなくバブルの周囲に添加し、インキュベーター内に 24 時間放置しました。解決する。 次に細胞培地を、いくつかの修正を加えて 22 に記載されているように、1 μM ドルソモルフィンおよび 10 μM SB431542 を含む神経誘導培地 3N ビタミン A に変更しました。 (3N 媒体の詳細は補足データ表 1 に示されています)。 培地を毎日2mlの新鮮な培地と交換した。 24 時間後、Geltrex バブルの近くで単一のロゼットが発生し始め、ロゼットのサイズが日ごとに増加していることが観察されました。 ゲルトレックス固体バブルに最も近い単一のロゼットは、他のロゼットよりも明らかに大きかった。 5日後、これらの大きな単一ロゼットを手作業で拾い上げ、3N + ビタミンAの神経誘導培地を含む96ウェル丸底プレートの単一ウェルに個別に移しました。培地は3日間、1日おきに更新しました。

細胞継代後 4 日目に、髄膜細胞を Accutase (Innovative Cell Technologies) を使用して剥がし、懸濁液中の単一ロゼットに加えました (iPSC 細胞 8 日目?)。 iPSC 細胞と同時インキュベートする髄膜細胞の最適数を決定するために、ウェルの半分に 8 × 103 個の髄膜細胞を入れ、残りの半分には対照として髄膜細胞を入れずに残しました。 培地は、５０％髄膜細胞培地および５０％３Ｎ＋ビタミンＡであった。２％ＦＢＳを含有する髄膜培地に３Ｎを半分ずつ加え、ＦＢＳ濃度を１％まで下げた。 FBS を含むこの培地は 3 日間のみ (9 ～ 11 日目の間) 添加され、同じ条件が対照条件として考慮されました。 9日目に、オルガノイドと髄膜細胞の共培養物を、インキュベーションとイメージングのためにIncuCyte Zoomシステム(Essen BioScience、米国ミシガン州アナーバー)に加えました。 最初の 3 日間 (9 ～ 11 日目) は 3 時間ごとにイメージングを取得し、その後 42 日目までは 8 時間ごとにイメージングを取得しました。 12 日目から、培地を 3N + ビタミン A + 10 ng/ml BDNF + で 1 日 1 回更新しました。 10 ng/ml NT3。 42 日目の終わりに、IncuCyte の画像サイズ制限により、オルガノイドを同じ培地を含む 48 ウェル丸底プレートに移し、IncuCyte なしでインキュベーターに置きました。 オルガノイドは、さらなる画像解析のためにそれぞれ42日目、56日目、および70日目に固定されました。

オルガノイドを、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（DPBS）中の冷4%パラホルムアルデヒド（PFA）で20分間固定し、その後、PBSで5分間2回洗浄しました。 次に、固定されたオルガノイドを、PBS 中の 30% スクロース中で 4 °C で一晩インキュベートしました。 翌日、オルガノイドをスクロースから取り出し、Tissue-Tek 最適切断温度化合物 (OCT、Sakura) に包埋して凍結し、厚さ 20 μm で凍結切片化し、Superfrost Plus スライド (Fisher Scientific) 上に収集しました。 スライドを0.1% Triton-X100 (Sigma)で室温で20分間リンスして透過性を高め、その後切片をICCブロッキング緩衝液(0.05% Tween-20、5%正常ヤギ血清および1% BSAを含むPBS)中でインキュベートした。 ）室温で1時間。 次に、切片を一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 抗体種、希釈度、供給者名およびカタログ番号は補足データ表 2 に含まれています。 次に細胞を PBST (PBS 中の 0.05% Tween 20) で 10 分間 3 回洗浄し、その後ブロッキング溶液で希釈した二次抗体とともにインキュベートしました。室温で90分。 次いで、スライドをＰＢＳＴで１０分間１回洗浄し、ビスベンズイミドを含むＰＢＳ中で５分間インキュベートして核を標識した。 最後に、スライドを PBST で各 10 分間 3 回洗浄し、グリセルゲル封入剤にマウントし、共焦点顕微鏡 (下記) を使用してイメージングし、さらなるイメージングのために一晩乾燥させました。

IncuCyte Zoom システムは、ラベルフリーまたはデュアルカラー蛍光を使用してスフェロイドのリアルタイム イメージングを可能にし、形態を観察し、経時的なスフェロイドの成長を研究できるプラットフォームです。 ここで、システムはロゼットの成長を監視しました。 分化にわたるさまざまな時点での各オルガノイドの形態および平均断面を観察し、IncuCyte Zoom システム ソフトウェアを使用して分析しました。 すべての IncuCyte データは、各条件で少なくとも 6 つのサンプルを使用した 5 つの独立した実験から得られました。

切片は、Leica TCS SP5 共焦点レーザー走査型顕微鏡正立 + 倒立システム (Leica Microsystems、マンハイム、ドイツ) で順次走査手順を使用して検査されました。 共焦点画像は 10 倍および 20 倍のレンズで撮影され、データは ImageJ によって分析されました。 共焦点画像は、電動ステージと Zen ブラックまたはブルー エディション ソフトウェアを備えた Zeiss LSM 700、LSM 780、または Zeiss LSM 800 共焦点顕微鏡を使用して取得しました。 タイル化された画像は、Zen Tiles and Positions モジュールを使用して組み立てられました。 明視野イメージングには、EVOS 顕微鏡 (Advanced Microscopy Group) を使用しました。 すべての画像は Adob​​e Photoshop で編集され、画像調整は画像全体に適用され、明るさ、コントラスト、レベルに制限されています。 比較として図に示した画像は、同一の設定を使用して取得され、並行して処理されました。

すべての統計分析には Prism バージョン 8.4.2 (GraphPad) を使用しました。 他のすべての研究では、両側の対応のないスチューデントの t 検定を使用して、テスト グループ間の有意差を評価しました。 AP 値 < 0.05 は統計的に異なるとみなされました。 これらの実験は、3 つの異なる細胞株を使用して 4 回繰り返されました。 (CC1 n = 2、PCDH19 n = 1 & CDH2 n = 1)。 それらすべてについて免疫染色を実施した。 補足データS1に示すように、異なる細胞株ではオルガノイドのサイズにわずかな違いがありましたが、すべての細胞株は分化段階と異なるマーカーで同じ傾向を示しました。 この研究では、3 つの細胞株すべてからデータが収集および使用されました。 各実験から少なくとも n = 4 個のオルガノイドが選択されました (合計で n = 4 個の生物学的複製、および図の凡例で詳細に記載されているオルガノイドの数 n = 12)。 したがって、各グラフは、18 個の個々のオルガノイドの分析後の平均および標準偏差を表します。

すべての実験と方法は、関連するガイドラインと規制に従って実行されました。 すべての被験者からインフォームドコンセントが得られ、すべての方法は REC の関連ガイドラインおよび規制に従って実行されました。

我々は、3つのiPSC（CC1、PCDH19-WT、CHD2）すべてから単一の神経ロゼット構造を生成し、皮質脳領域を複製する方法を設計しました。 神経ロゼット自体には、別個の神経層に空間的に組織化する能力がありませんが、3D 脳オルガノイドの出発点であり、共培養システムをサポートする可能性のある細胞を同定するための有用な代用品となり得ます。 さまざまな成長因子と阻害剤については、Yichen Shi33 が記載した方法を修正しました。 簡単に説明すると、iPSC を二重 SMAD 阻害 (ドルソモルフィンおよび SB431542) で処理しました。これは、iPSC から神経前駆細胞を誘導するための十分に確立された方法です。 培養方法の模式図を(図1a)に示します。 単一のロゼットは 2 日目から固体 Geltrex バブルと希釈 Geltrex/DMEM の間の界面付近で上昇し始め (図 1b)、時間の経過とともに成長しました。 データは、GFP標識CC1細胞からの4つの独立した実験から取得され（図1d）、総数n = 18のロゼットが分析されました。 2日目のCC1細胞株の平均ロゼット直径は170±20μmで、5日目までに> 250μmに増加しました（図1c）。 形態学的観察により、ロゼットの中央に明確な内腔構造が示されました（図1c、g）。 全体として、単一ロゼットは 3 日目から 5 日目にかけてサイズが 1.8 倍を超えて増加しており、これは有意であることが示されました (p < 0005)。 (図1f)。 これらのデータは、追加の 2 つの iPSC 株 (PCDH19 および CHD2) で確認されました。 これら 2 つのラインからのデータを (補足図 S1) に示します。 神経ロゼットの出現を特徴付けるために、さまざまな神経幹/前駆細胞 (NPC) マーカーの経時的分析を実施しました。 二重SMAD誘導からわずか2日後、iPSC由来ロゼットは、神経外胚葉マーカーPAX6およびNESTIN NPCおよび頂端膜マーカーPKC-Zの発現を示し始めました（図1e1）。 5 日目には、明確に分極した神経上皮様構造が観察され、脳室帯 (VZ) では PAX6 および NESTIN NPC の顕著な発現が見られ、心尖部領域では N-カドヘリンと PKC-Z の接着結合マーカーが強力に発現していました。神経管（図1e2、g）。

単一神経ロゼットの生成と特性評価。 (a) ヒト皮質オルガノイドを生成するための培養方法の概略図、(b) バブルと希釈ゲルトレックスの間の界面での 5 日間にわたる単一ロゼットの出現と成長、(c) 単一ロゼットの代表画像は、それぞれの平均サイズを示しています。約 255 μm の単一ロゼット、(d) GFP 標識ロゼットの代表的な画像、(f) 2 日目から 5 日目までの単一ロゼットの成長のマイクロメートル単位の定量分析。 データは平均±SDとして表されます。 統計分析により、3 日目から 4 日目および 4 日目から 5 日目のサイズに有意な差が示されました (****p < 001、n = 4 の独立した実験および n = 4 つのロゼットが各実験から選択されました)、(e1、e2) NPC (PAX6 および NETIN) および頂端膜 (NCAD/APKC) の 2 日目と 5 日目の単一ロゼット、(g) 単一ロゼットは PAX6 および N-カドヘリンを発現、スケール バー 100 μm、(h) IncuCyte Zoom の代表画像9 日目から 22 日目までのさまざまな時点での 96 ウェル プレートでのオルガノイドの増殖。 (i) 9 日目から開始して、ロゼットが周囲の 3D に順応した後の単一ロゼット サイズの定量化 (n = 3 の CC1 細胞株と CC1 細胞株からの独立した実験) n = 合計 9 個のオルガノイド)。 エラーバー±SD。 スケールバーは400μm。

5日目に単一のロゼットを96ウェル丸底プレートに移し、IncuCyte Zoomシステムを使用して形態学的変化を14日間分析しました。 各ロゼットの画像を 12 時間ごとに撮影しました。 ロゼットは時間の経過とともにサイズの成長を示し、9〜24日でロゼットの断面積がほぼ4倍になりました（図1h）。 ロゼットが3D環境に順応した後の9日目から開始した単一ロゼットのサイズの定量化では、24日目までにサイズ直径が約800μm以上増加したことが示されました（図1i）。 単一のロゼットから皮質オルガノイドを生成する我々のアプローチは、均一なオルガノイドを迅速に生成し、明確に定義された組織化された神経上皮ロゼットを生成するようです。

プロトコルをさらに評価するために、私たちの方法がさまざまな皮質領域を生成し、ヒト胎児皮質を再現できるかどうかを調べました（図2b）。 我々は、さまざまな時点で特定の皮質マーカーの免疫組織化学的分析を実行しました。 21日目に、神経前駆細胞マーカーPAX6およびBLBP、前脳マーカーFOXG1の明らかな発現、および神経マーカーTUJ1の出現を観察しました（図2a）。 これまでの研究では、TBR2 が発達中の皮質における中間基底前駆細胞 (IPC) の特定にとって重要な因子であることが示されています。 TBR2 は各皮質層の形態形成を調節することが知られています 34、35、36。 42日目に、オルガノイド内の細胞は、脳室下帯（SVZ）に顕著なTBR2 IPCを有するVZ内の異なるPAX6前駆細胞に分離しました（図2c）。 42日目には、前脳マーカーFOXG1および神経マーカーTUJ1の明確な発現も観察されました（図2d）。 さらに、ニューロン集団の指標であるMAP2発現は42日目に始まり、70日目までに有意に増加しました（P < 0.005）（図2e、f）。

領域特異的マーカーおよび神経細胞の同一性の免疫染色。 （ a ）21日目にイムノアッセイした単一ロゼットは、一般的な放射状グリア（RG）マーカー（PAX6およびBLBP）、前脳マーカーFOXG1および神経マーカーTUJ1の発現を示しました。 (b) さまざまな脳領域の概略図。 （ c ）42日目のオルガノイドの免疫染色は、VZにおけるRG（PAX6）およびIPC（TBR2）iSVZの明らかな発現を示しました。 （ d ）42日目にVZで同定された前脳マーカーFOXG1および神経マーカーTUJ1。（ e ）42日目（W6）および70日目（W10）に、脳オルガノイドを神経マーカーMAP2およびPAX 6について共染色した。 （ f ）MAP2発現の定量化により、W10とW8の有意差が示されました（ P < 0.005）、（ g ）脳オルガノイドは、神経上皮マーカー（NESTIN）および外側RGマーカー（HOPX）について共染色されました。 （ h ）HOPXの相対的な厚さの定量化により、W6、W8、W10の3つの異なる時点間の有意差が示されました（ P < 0.005）、（i）大脳オルガノイドは、下層ニューロンマーカー（CTIP2）および外層について共染色されました42、56、および70日目のニューロンマーカー（SATB2）、（j、k）各層の相対的な厚さの統計的定量化は、3つの異なる時点、W6、W8、およびW10の間で有意性を示しました（P <0.005）。 (合計 n = 4 生物学的複製、n = 2 CC1、n = 1 PCDH19 および n = 1 CHD2、n = 12 総オルガノイド数を分析しました)。 エラーバー±SD。 スケールバーはすべての図で 100 μm です。

さらに、細胞培養システムにおける HOPX の発現を評価しました。 ヒトでは、ヒト新皮質の成長に重要な役割を果たしている SVZ は、それぞれ iSVZ および oSVZ と呼ばれる内部セクションと外部セクションに分かれています 37。 最近の研究では、外放射状グリア細胞 (oRGC) の存在が、在胎 15 ～ 2038 週の人間の発育中の皮質と同様に、oSVZ 層でのほとんどの皮質ニューロンの生成に関与していることが示されています。 HOPX は、oRGC の重要な特徴マーカーの 1 つです 4,39。 42日目にはHOPX発現はほとんど検出されませんでしたが、56日目には脳室帯(VZ)とSVZの両方でHOPXの明らかな出現が検出されました。 70日目までに、HOPX発現は大幅に拡大し（ P < 0.005）、内側SVZ（iSVZ）領域から分離されているように見える外側脳室下帯（oSVZ様領域）でより多く検出されました（図2g、h）。 さらに、42 日目には、プレプレート (PP) に似た VZ および SVZ の上に形成された下層マーカー CTIP2 ニューロンの明らかな発現があり、その発現は 56 日目 (W8) から 70 日目 (W10) にかけて有意に増加しました (p < 0.005)。 ）（図2g）。 最後に、上層マーカー SATB2 は 42 日目あたりに出現し、W8 と W10 の間で大幅に増加しました (p < 0.005) (図 2g)。 すべてのマーカーのヒト皮質オルガノイド（hCO）全体の追加のズームアウト画像を補足図に示します。 S2とS3。 まとめると、これらの結果は、単一のロゼットから生成された我々のオルガノイドシステムが、生体内でのヒトの皮質発達と重要なヒト発達マーカーのパターン化された発現を再現していることを実証している。

ヒト皮質オルガノイドの in vitro 形成をよりよく模倣するために、我々はさらに、ヒト髄膜細胞を単一ロゼット形成法と共培養して使用し、ヒト脳の発達を助ける非神経細胞の効果を調査しました。 この実験には、ヒト軟髄膜細胞を使用しました。 髄膜細胞は、皮質の分化と成熟を調節する発生の合図の源であることが示されています14。 異なる髄膜層からの信号は、異なる脳領域の適切な形成に重要であることも示されています40、41、42。 たとえば、中間髄膜層からのレチノイン酸などの神経原性シグナルは、皮質ニューロンの生成を調節します22。 我々は、髄膜細胞の共培養とこれらの細胞からのガイダンスキューの存在が、RG遊走のためのより良い足場を提供し、神経オルガノイドの別個の層への成熟を促進できるかどうかを確認したいと考えました。 この目的を達成するために、9 日目に単細胞髄膜細胞 (約 8,000) を丸底 96 ウェルプレートの単離した単一ロゼットに添加し、2、3、6 時間でそれらの付着をモニタリングしました。 IncuCyte Zoomによるインターバル。 これらの実験に最適な細胞数を定義するために、最初にさまざまな髄膜細胞数が検査され、より多くの細胞 (16,000、32,000、および 100,000 個の髄膜細胞) を追加すると、おそらくはオルガノイドが成長するためのスペースが少なくなります（補足図S4a、b）。 したがって、オルガノイドと共培養するための最適な細胞数として 8000 個の髄膜細胞が選択されました。 実験手順の概略図を(図3a)に示します。 最初の 24 時間でほとんどの髄膜細胞が単一のロゼットに付着し、それを覆うことが観察されました (図 3b1) および (補足ビデオ 1)。 髄膜細胞を含まないコントロール条件を図 3b2 に示します。 12日間にわたる視覚的観察により、髄膜細胞の存在下で「hCOM」と呼ばれるhCOが、hCO（図3d）および（補足図S5）と比較して、より明確で丸みを帯びた回転楕円体の形状を示すことが明確に実証されました。 さらに、単一オルガノイドのリアルタイムモニタリングで2つの条件を比較すると、hCOとhCOMではより多くの破片がオルガノイドの端から培地に放出されることが示されました（赤い矢印、図3b2）。 培地を交換することによって破片を洗い流した。 さらに、IncuCyte Zoomソフトウェアを使用したさらなる定量分析により、21日間にわたるオルガノイドのサイズが、対照hCOと比較してhCOMで著しく増加した（> 1.5倍の変化）ことが示されました（図3c）。 CC1細胞株の4つの別々の実験と合計18個のオルガノイドからデータが分析され、補足図S6では追加の2つの細胞株（PCDH19およびCHD2）を使用して結果が再現されました。 まとめると、これらの結果は、ヒトiPS細胞と髄膜細胞を一緒に使用する我々の新しい共培養システムが、皮質オルガノイド形成の形態と表現型を効率的に強化し、特定の時間経過での成長を増加させることができることを示しています。

ヒト脳オルガノイド生成のための3D共培養システム。 (a) 概略図は、iPSC からヒト皮質オルガノイド (hCO) を生成し、髄膜細胞と共培養して 9 日目から開始する主な手順を示しています。 (b1、b2) IncuCyte Zoom でのオルガノイドの成長の代表的な画像。当日の 6 枚の画像を示しています。共培養（9 日目）、18 日目と 21 日目のさらなる画像、および髄膜細胞を含まない hCO からの代表的な画像。 (c) IncuCyte Zoom 定量化ソフトウェアを使用したオルガノイドのサイズの成長は、5 日目から 23 日目の間のオルガノイドの成長の顕著な違いを示しました。 （ d ）明視野顕微鏡を使用したhCOMとhCOの形態を示す代表的な画像、スケールバー400μm（合計n = 4の生物学的複製、n = 2 CC1、n = 1 PCDH19およびn = 1 CHD2、n = 12数）オルガノイドが分析されました）。 赤い矢印は、培地交換中に洗い流された破片を示します。 明視野画像の場合、スケール バーは 400 μm です。

hCO と hCOM の皮質オルガノイドをさらに比較するために、さまざまな時点でさまざまなニューロン サブタイプのマーカーの発現分析を実行しました。 6週目と10週目の終わりまでに、hCOと比較してhCOMのより広い領域でより多くのニューロンが深層皮質ニューロンマーカーCTIP2を発現していることが観察され（図3a）、定量測定により、この差が10週間後に有意であることが示されました（図3a）。 .4b)。 6週目の終わりには、内腔付近にPAX6 NPCが密集し、VZ上にTBR2 IPCが形成された、明確なVZ様構造も観察されました。これは、hCOとhCOMの両方におけるヒト皮質発達におけるプレプレート（PP）を彷彿とさせます。 。 ただし、TBR2 IPC は hCOM で大幅に拡張されました (P < 0.005) (図 4)。 BRN2 は新皮質ニューロンの位置決めに重要な役割を果たしていることが示されており 35、第 III 層外側ニューロンのマーカーです。 SVZ領域における基底前駆細胞の拡大の増強を観察した後、BRN2を発現するニューロンの拡大をさらに評価したところ、hCOと比較してhCOMで有意に拡大していることがわかりました。 (p < 0.005) (図 4e、f)。 各図のズームアウト画像を補足図S2およびS3に示します。 まとめると、我々のデータは、我々の新しい3D共培養システムで成長した皮質オルガノイドが明確に定義された皮質積層を示していることを明らかにしています。

共培養システムは皮質形成の良好な発達をもたらしました。(a) 6 週間および 10 週間後の hCOM と hCO における下層マーカー CTIP2 および上層マーカー SATB2 の免疫染色。 (b) hCO および hCOM における 6 週目と 10 週目の皮質板 (CP) の相対的な厚さ。 各皮質構造について、45°の角度で 3 回の測定を行い、平均値を取得しました。 相対 CP 厚さは、心室表面から軟膜表面までの総厚に対する CP 厚さの比率です。 CP の厚さは、hCO と比較して hCOM で 10 週間後に統計的に有意に拡大しました (p < 0.05)。 エラーバー±SD、すべてのスケールバー：100μm、(c)PAX6およびIPCマーカーTBR2について免疫染色した皮質オルガノイドは、hCOM対hCOで比較的拡大したSVZ領域を示し、(d)TBR2発現の統計的定量化は、 W6 における hCOM 対 hCO (P < 0.005)。 （ e ）上層マーカーBRN2について免疫染色された皮質オルガノイドは、hCOと比較してhCOMの拡張されたより明確な領域を示しました。 （ f ）BRN2発現の統計的定量化により、W10におけるhCOMとhCOの有意差が示されました（合計n = 4の生物学的複製、n = 2 CC1、n = 1 PCDH19およびn = 1 CHD2、n = 12のオルガノイド数が分析されました） ）。 エラーバー±SD。 スケールバー、100 μm。

他の層の他の神経マーカーを探索するために、さらに免疫染色アッセイを実行しました。 外放射状グリア層（oSVZ）のマーカーであるHOPXは、hCOと比較してhCOMでより拡大しました（図5a）。 画像分析により、この増加が有意であることが示されました (図 5b)。 70 日目に、hCOM と hCO では辺縁ゾーン (MZ) での REELIN 発現領域の拡大が観察されました。 REELIN は皮質 MZ に存在し、カハル・レツィウス ニューロンによって分泌されます。 REELIN は皮質板の放射状組織の進化における重要な構成要素であり 36、REELIN の発現の破壊は新皮質の適切な層状組織に影響を与えることが示されています 37。 70日目に、REELINを発現する層の厚さがhCOと比較してhCOMで著しく増加していることを観察しました（図5c）。 この拡大を特徴付けるために、hCOとhOMの両方のリーリン層の厚さを測定したところ、データは共培養システムの周縁領域のほぼ2倍の増強を実証しました（図5d）。 ズームアウトした代表的な図を補足図S3に示します。

さまざまな前駆ゾーンの組織とマーカー発現、(a、b) hCOM および hCO での 10 週間後の oRGC マーカー HOPX の免疫染色のサンプル画像と、10 週目での oSVZ 領域の相対的な厚さの定量化は、hCO と比較して hCOM の有意な増加を示しています。 (p < 0005) (4 つの独立した実験からの n > 10 の皮質構造)。 エラーバー±SD、すべてのスケールバー：100μm、（c、d）hCOMおよびhCOで10週間後のプレプレートCajal-RetziusマーカーREELINの代表的な免疫染色​​画像および10週目のMZ領域の相対厚さの定量化。皮質構造では、平均値を得るために 45°の角度で 3 回の測定が行われました。 MZ の厚さは、hCO と比較して hCOM で 10 週間後に統計的に有意に拡大しました (p < 0.0005) (合計 n = 4 生物学的複製、n = 2 CC1、n = 1 PCDH19 および n = 1 CHD2、n = 10 オルガノイドの数分析されました）。 エラーバー ± SD、スケールバー: 100 μm。

次に、髄膜細胞からのシグナル伝達合図が、3D 大脳オルガノイドシステムにおける皮質形成におけるヒト NP 増殖の増強に影響を与える可能性があるかどうかを調査しました。 既存のヒト遺伝学的証拠は、FGF などの成長因子シグナル伝達がヒトの皮質形成を調節していることを強く示唆しています。 現在の研究では、対照および共培養ヒトオルガノイドの両方に、初期発生皮質を彷彿とさせる定型的な様式で組織化された神経上皮が含まれており、そこではKi67+ NPが脳室帯の頂端面で増殖していました。 対照と比較して、hCOMは8週目と比較して10週目でより多くのKi67+細胞を保持していましたが、対照条件では8週目から10週目まで時間の経過とともに減少しました（補足図S7）。 hCOM では増殖の増強が延長され、8 ～ 10 週目に最も顕著でしたが、対照 hCO では時間の経過とともに減少しました。 ヒトおよび他の逆脳哺乳類の発達中の皮質には、より大きな VZ および SVZ が存在し、これらは実質的により多くの放射状グリア細胞と中間前駆細胞で構成されています 43。 したがって、我々の共培養システムにおける IPC の増殖増加は、ヒトのより優れた in vitro モデルを示唆しています。しかし、定量データに基づくと、hCO と hCOM の間の Ki67+ 発現の差は有意ではありませんでした。

次に、私たちの共培養システムがアストロサイトの分化にどのような影響を与えるかを尋ねました。 星状膠細胞は、哺乳動物の脳で最も多くの細胞型を構成しており、神経伝達物質のリサイクリング 44、シナプス形成の制御 45、機能 46 など、CNS において重要な役割を果たしていることが示されています。 研究では、髄膜が発達中の脳におけるアストロサイト誘導因子の重要な供給源であることも示されています。 我々の免疫染色の結果は、hCOおよびhCOMの両方において56日目および70日目におけるアストロサイトの発現を示しており、これはhCOMにおいてある程度多かった。 （補足図S8）。

hiPSC が 3D 脳様構造物を生成する能力により、新しいパーソナライズされた神経学的モデリング プラットフォームを開発し、ヒトの脳の発達と疾患の根底にあるメカニズムを調査することが可能になります。 脳オルガノイド開発における現在の高度な技術にもかかわらず、多くの技術的課題が残されています。 この研究では、5 日後に約 250 μm に達することができる iPSC からの単一ロゼット形成に基づく効率的な方法を確立しました。 わずか 5 日間で、これらのロゼット構造は、頂端領域で PKC-Z と N-CADHERIN、基底領域で神経前駆細胞マーカー PAX6 と NESTIN を発現する管状の細胞構造を示しました。 我々の結果は、これらのオルガノイドが21日後に前脳および神経マーカーを発現することを示しました。 さらに、異なる時間経過での免疫染色分析により、発達中のヒト皮質内の主要な発達マーカーの組織学的組織と発現パターンを効率的に再現することができました。

文献にある実験法のほとんどは、最初から複数のロゼットを生成し、それぞれが独立した形態形成中心として機能することによってオルガノイドの作製を開始することに注意することが重要です4、5、47。 単一ロゼットの作成は、最近大きな注目を集めています48,49。 単一ロゼットベースのプロトコルには、成長因子やその他のシグナル伝達分子を使用して誘導される、よく形成された神経ロゼットを手動で単離および培養することが含まれます。 このアプローチにより、より一貫性と再現性のあるオルガノイド形成が可能になり、その結果、初期の脳発達の側面をよりよく模倣する、より均質で明確なオルガノイドが得られます。 ただし、このアプローチは労働集約的であり、拡張性が低くなります。 対照的に、胚様体ベースのプロトコルなどの他の技術には、手動操作を行わずに多能性幹細胞を三次元構造に凝集させることが含まれます。 このアプローチはよりシンプルで労働集約性が低いため、ハイスループット研究用に多数のオルガノイドを生成できますが、より多様なオルガノイドが得られます。50,51。 今回我々は、オルガノイド形成法により、実験を繰り返してもサイズのばらつきが少ない単一ロゼットを形成し、250±20μmの前脳オルガノイドの形態と表現型の一貫性を高めることができることを示す。 ただし、私たちの方法は分化の最初の段階での単一のロゼット形成に基づいていますが、42日目のオルガノイドの解剖では、hCOが成熟するにつれてより多くのVZが観察できることを示す複数のVZが示されたことに注意することが重要です（補足図。 9)。

我々は、髄膜細胞と組み立てられたiPSC由来hCOMを使用した3D共培養システムを使用した方法をさらに開発し、皮質脳オルガノイドの形態と表現型に対する髄膜細胞との共培養の影響を評価しました。 多くの研究により、FGF215、インスリン様成長因子 17,52、CXCR1219 およびレチノイン酸 22,23 を含むいくつかの栄養因子の供給源として髄膜が重要な役割を果たしていることが示されています。 これまでの研究で、ニューロンの発達、中間前駆細胞の産生、および神経上皮の伸長における髄膜の重要な役割が明らかに示されていることを考慮すると、オルガノイド培養で髄膜細胞を利用して、皮質形成と脳構造の形成を強化できるかどうかを判断したいと考えました。 実際、髄膜細胞、そしておそらくこれらの細胞からのシグナル伝達因子の存在により、単一ロゼットの分化と成熟が大幅に改善され、前脳オルガノイドの形態と皮質表現型が強化されたことが観察されました。 in vivo 研究では、髄膜が SDF1 を分泌し、カハール・レツィウス細胞と皮質介在ニューロンの皮質辺縁帯に沿った接線方向の移動を誘導し、皮質形成中のそれらの正しい分布を確保することが示されています 42,53。 我々の in vitro 共培養システムでは、REELIN 発現の増加によって示される、著しく大きく明確に定義された辺縁帯領域が観察されました。これは、髄膜細胞からの因子の分泌により、より明確に定義された辺縁帯が生成され、したがって皮質形成が促進されたことを示唆しています。 また、IPC TBR2、深層マーカーCITIP2、上層マーカーBRN2の拡大領域も観察されました。 さらに、ヒト皮質オルガノイドの主な特徴であり、げっ歯類から分離するoSVZ層は、我々の共培養システムでは大幅に拡張され、明確に定義されました。 さらに、我々は我々の系においてアストロサイトの早期成熟を観察したが、これは髄膜が発達中の脳におけるアストロサイト誘導因子の重要な供給源であることを示した以前の研究と一致している54。 9〜11日目のオルガノイドの生成中に、オルガノイドが1％FBSに曝露されたことに言及することが重要です。 研究によれば、FBS は GFAP 発現を再活性化し、増加させることができます 55。 しかし、最初のアストロ サイトが 40 日目頃に分化するという事実 (1% FBS に曝露した後、培地を約 15 回完全に交換したこと) を考慮すると、これは、70 日目に観察された成熟アストロ サイトが培地の効果の結果として生成された可能性が低いことを示唆している可能性があります。 ただし、GFAP の発現増加が培地中の FBS の存在によって観察されたのか、それともさらなる分化と成熟の結果として発現したのかを調べるには、さらなる実験が必要でした。 また、グルタミン合成酵素、BLBP（脳脂質結合タンパク質）、S100β、ビメンチン、CD49fなどの他のアストロサイトマーカーを使用すると、将来の研究にとってより有益となるでしょう。 さらに、理想的には、適切な分化と発生に必要な遺伝的およびエピジェネティックな互換性を維持するために、皮質オルガノイドの生成に使用したものと同じ多能性幹細胞 (PSC) 株から髄膜細胞を誘導することが推奨されます。 しかし、私たちの研究室は髄膜細胞と iPSC の区別に焦点を当てておらず、それは私たちの研究でも考慮されていませんでした。 また、遺伝子発現、細胞増殖、分化の変化など、hCO 発生に対する髄膜共培養の潜在的な長期的な影響を考慮することも重要です。 これらの効果は、hCO の発生と成熟、および神経障害を正確にモデル化する能力に影響を与える可能性があります。 ただし、hCO の発生に対する髄膜共培養の長期的な具体的な影響を判断するには、さらなる研究が必要です。 電気活動を生成し、外部刺激に応答する能力など、髄膜にカプセル化された hCO の機能的特性を分析することにより、神経疾患の研究や創薬のモデルとしての可能性を理解するための貴重な情報が得られる可能性があります。 電気生理学的記録とカルシウムイメージングは​​、hCO の機能特性評価のための潜在的な方法です。 これらのアプローチは今後の研究で検討されます。

私たちの共培養システムは、ロゼットオルガノイドの層構造を著しく改善し、オルガノイドと天然のヒト組織とのより良い比較を可能にしました。 髄膜細胞は、新皮質の形成と成熟を含め、生体内での脳の発達において重要な役割を果たしています。 hCOM の場合、3D 共培養システムに髄膜細胞を含めることで、生体内状態をよりよく再現する、より生理学的に適切な環境を作り出すことができます。 髄膜細胞は、神経発達、細胞増殖、分化を調節する成長因子とサイトカインを分泌し、これにより特定のニューロン サブタイプの発達と hCOM におけるその発現レベルが促進される可能性があります 50,56。 これは、hCOM が hCO と比較して特定の神経サブタイプ マーカーのより高い発現レベルを示した理由を説明する可能性があります。 ただし、皮質オルガノイドの発生における髄膜細胞の役割を完全に理解するには、さらなる研究が必要です。 最近の研究では、mTOR シグナル伝達が、oRG 細胞の細胞骨格組織と放射状グリア足場を維持することによって、発達中のヒト皮質の構造を調節できることが示されています 53。 したがって、より明確に定義され強化されたoRG層を有する私たちの共培養システムは、in vivo状態を再現するためのより優れたin vitroモデルと、発達中の脳の細胞構造と積層の改善を提供します。

さらに、将来の研究では、脳オルガノイドの血管新生を可能にするために、髄膜細胞と組み合わせて内皮細胞などの追加の細胞タイプを追加することを検討する可能性があります。 組織工学において、血管新生オルガノイドの生成は、その持続的な成長と複雑な生体内微小環境の模倣にとって極めて重要です。 多能性幹細胞由来のオルガノイドには血管構造が欠如しており、オルガノイドの血管新生に対する現在の戦略は、生体内での共同開発を完全には再現できません。 この課題に対処するために、研究者らは、空間的に決定された方法でヒト多能性幹細胞由来のオルガノイドを血管細胞と共培養するための3Dプリントマイクロ流体チップを開発した。 オンチップの周皮細胞と内皮細胞は、組織化された血管ネットワークに自己集合し、大脳オルガノイドと統合され、統合された神経血管オルガノイドを形成しました57,58。 さらに、分解性材料で作られたマイクロ流体チャネルは、オルガノイド血管新生をさらに強化し、生体内微小環境をよりよく模倣する可能性があります59。 これは、さまざまな神経障害、特に自閉症スペクトラム障害 (ASD)、注意欠陥多動性障害 (ADHD)、知的障害 (ID)、発達遅延、統合失調症、てんかん、そしてさらなる将来の治療への応用。 これらのモデルは、皮質の発達中に発生する複雑な細胞相互作用を再現することで、これらの疾患の根底にあるメカニズムに対する新たな洞察を提供し、新しい治療戦略の開発に役立つ可能性があります。

関連するデータはすべて原稿に含まれています。 論文内で説明されている資料、データ、プロトコルは、責任著者への合理的な要求に応じて入手できます。

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また、実験を実施するための設備を提供してくださったミシガン大学神経学部にも感謝したいと思います。 原稿の改訂にあたって洞察力に富んだアドバイスをくださったイリノイ大学シカゴ校生体医工学部のカムラン・アヴァナキ博士に感謝いたします。

国立衛生研究所、国立トランスレーショナルサイエンス推進センター、助成金 KL2TR002002 のもと。

ミシガン大学医療センター神経科、アナーバー、ミシガン州、48109、米国

エルマイラ・ジャリリアン

ハーバード大学医学部医学工学部、ブリガム アンド ウィメンズ病院、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、02139、米国

Su Ryon Shin

イリノイ大学シカゴ校眼科・視覚科学科、シカゴ、イリノイ州、60612、米国

エルマイラ・ジャリリアン

リチャードとローン・ヒル イリノイ大学シカゴ校生物工学部、シカゴ、イリノイ州、60607、米国

エルマイラ・ジャリリアン

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EJはデザイン、監修、研究のすべての部分を実行し、原稿を書きました。 SRS は科学的サポートを提供し、原稿の出版版を読み、同意しました。

エルミラ・ジャリリアンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Jalilian, E.、Shin, SR 皮質-髄膜オルガノイド共培養システムの新しいモデルは、ヒト皮質脳オルガノイドの細胞構造を改善します。 Sci Rep 13、7809 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35077-9

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受信日: 2023 年 1 月 23 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 14 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35077-9

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