単球

Scientific Reports volume 5、記事番号: 15857 (2015) この記事を引用

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ニコチンアミド ホスホリボシルトランスフェラーゼ (Nampt) は、ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド (NAD+) 生合成のサルベージ経路における律速段階を触媒し、それによってサーチュインの脱アセチラーゼ活性を制御します。 今回我々は、単球由来細胞外Nampt（eNampt）による心筋NAD+の調節調節を示す。これは、圧力過負荷に対する血行力学的補償に不可欠である。 細胞内Nampt（iNampt）発現は圧力過負荷の心臓では減少しましたが、心筋NAD+濃度とSirt1活性は維持されました。 対照的に、iNampt は脾臓と単球で上方制御され、循環 eNampt タンパク質と NAD+ の重要な前駆体であるニコチンアミド モノヌクレオチド (NMN) が大幅に増加しました。 FK866によるNamptの薬理学的阻害、またはクロドロネートリポソームによる単球/マクロファージの枯渇は、心筋NAD+レベルおよびNAD+依存性Sirt1活性の恒常性維持機構を破壊し、圧力過負荷マウスにおいて心筋細胞アポトーシスおよび心臓代償不全に対する感受性をもたらした。 これらの生化学的および血行力学的欠陥は、NMN の全身投与によって予防されました。 私たちの研究は、圧過負荷に対する心筋の適応における単球由来の eNampt の重要な役割を明らかにし、心不全に対して心筋 NAD+ を制御する介入の可能性を強調しています。

ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチド (NAD+) は、解糖、脂肪酸 β 酸化、TCA サイクル、ミトコンドリアの酸化的リン酸化など、多くの代謝反応の酸化還元酵素補因子です1。 NAD+ は、ポリ (ADP-リボース) ポリメラーゼ 2 やサーチュイン 3 などの酵素の必須基質としても機能します。 サーチュインは、複数の細胞コンパートメントにあるヒストンおよびさまざまなタンパク質の脱アセチル化を触媒する NAD+ 依存性酵素であり 4、哺乳類のサーチュイン (Sirt1 ～ Sirt7 を含む) は、エネルギー恒常性の維持と老化関連疾患の予防の極めて重要な調節因子として機能します 4。 したがって、細胞内 NAD+ レベルの厳密な制御は、病態生理学的条件下での細胞および生物の生存にとって重要です。 NAD+ は新たに合成できますが、NAD+ の大部分は、その前駆体であるニコチン酸、ニコチンアミド (NAM)、または NAM リボースからのサルベージ経路によって合成されます 5。 哺乳動物細胞では、NAM ホスホリボシルトランスフェラーゼ (Nampt) による NAM から NAM モノヌクレオチド (NMN) への変換がこの経路の律速段階です 6。 興味深いことに、Nampt は細胞内型 (iNampt) としてだけでなく、酵素的に活性な二量体の細胞外型 (eNampt) としても存在し7、以前はプレ B 細胞コロニー増強因子またはビスファチンと呼ばれていた eNampt は脂肪細胞によって産生および分泌されます。単核細胞、肝細胞および心筋細胞7-9。 マウス血漿中には高濃度の NMN が存在し、eNampt を介した NMN の細胞外産生は、高脂肪食誘発糖尿病マウスの肝臓や白色脂肪組織などの代謝組織における細胞内 NAD+ 生合成を調節します 10。

心臓では、虚血、虚血/再灌流、圧力過負荷などの病理学的条件下で、Nampt タンパク質の発現レベルが下方制御されました 11。 しかし、Nampt が心臓の病態生理にとって有益であるか有害であるかについては議論があり、病理学的条件下で心筋 NAD+ 生合成が iNampt および eNampt によってどのように調節されるかは依然として不明である。 今回我々は、横行大動脈狭窄（TAC）後のマウスにおけるiNampt発現の低下にもかかわらず、心筋NAD+濃度が維持されていることを実証する。 機構的には、単球由来の eNampt は、圧力過負荷に対する機能的補償に十分な心筋 NAD+ レベルの維持に貢献します。 私たちの研究は、骨髄由来単球が関与する心臓恒常性の組織間調節に関する機構的な洞察を提供し、心不全の治療のためにこの経路を操作する治療戦略の方向性を示しています。

我々はまず、新生ラットの培養心筋細胞における傷害に対するストレス応答に対するNampt依存性のNAD+生合成の影響を調べた。 アントラサイクリン系抗がん剤であるドキソルビシン (DOX) は、酸化ストレスの増加、筋原線維の劣化、細胞内 Ca2+ 調節不全など、複数のメカニズムを通じて心毒性を示します 13。 DOX による刺激により、NAD+ 濃度と Sirt1 の酵素活性が大幅に低下し、逆に心筋細胞の核タンパク質のアセチル化が増加しました。これは、選択的 Nampt 阻害剤 14 である FK866 の併用治療によってさらに強調されました 14 (図 1a-c)。 Sirt1 はミトコンドリアの機能とエネルギー利用を調節し、心筋細胞を細胞死や変性から保護することが報告されています 15,16。 一貫して、DOXによる細胞生存率の低下と、Sod2、Ppargc1a、Pparg、mt-Co3などのミトコンドリア機能に関連する遺伝子の発現レベルの低下は、FK866での処理によってさらに強調されました（図1d、e）。 逆に、DOX刺激された心筋細胞をNMNで処理すると、NAD +濃度、Sirt1の酵素活性が大幅に増加し、核タンパク質のアセチル化が減少し、細胞生存率とミトコンドリア遺伝子の発現レベルが回復しました（図1f-j）。 これらの結果は、Nampt 依存性の NAD+ 生合成が培養細胞における DOX 誘発性心毒性から保護されていることを示唆しています。

ラット新生児心筋細胞におけるDOX誘発毒性に対するNampt依存性のNAD+生合成およびSirt1活性化の保護的役割。

(a) モック (n = 7)、DOX (n = 7)、または DOX + FK866 (n = 11) で処理した心筋細胞の NAD + 濃度。 **P < 0.01。 (b) モック (n = 4)、DOX (n = 5)、または DOX + FK866 (n = 5) で処理した心筋細胞における Sirt1 デアセチラーゼ活性。 *P < 0.05、**P < 0.01。 (c) モック、DOX、または DOX + FK866 で処理した心筋細胞の核画分におけるアセチル化リジン (Ac-K) およびヒストン H3 の免疫ブロット分析。 Ac-K/ヒストン H3 の定量を棒グラフとして示します (各グループの n = 8)。 **P < 0.01。 （ d ）モック、DOX、または DOX + FK866 で処理した心筋細胞の細胞生存率（各グループ n = 6）。 **P < 0.01。 （ e ）モック（n = 7）、DOX（n = 7）、またはDOX + FK866（n = 5）で処理した心筋細胞のミトコンドリア関連遺伝子のmRNAレベル。 *P < 0.05 対モック、**P < 0.01 対モック、#P < 0.05 対 DOX、##P < 0.01 対 DOX。 (f) モック (n = 4)、DOX (n = 3)、または DOX + NMN (n = 4) で処理した心筋細胞の NAD + 濃度。 *P < 0.05、**P < 0.01。 (g) モック (n = 4)、DOX (n = 5)、または DOX + NMN (n = 5) で処理した心筋細胞における Sirt1 デアセチラーゼ活性。 *P < 0.05、**P < 0.01。 (h) モック、DOX、または DOX + NMN で処理した心筋細胞における Ac-K およびヒストン H3 の免疫ブロット分析。 Ac-K/ヒストン H3 の定量を棒グラフとして示します (各グループの n = 8)。 *P < 0.05、**P < 0.01。 (i) モック、DOX、または DOX + NMN で処理した心筋細胞の細胞生存率 (n = 6、各グループ)。 **P < 0.01。 (j) モック (n = 7)、DOX (n = 5)、または DOX + NMN (n = 5) で処理した心筋細胞のミトコンドリア関連遺伝子の mRNA レベル。 **P < 0.01 対モック、#P < 0.05 対 DOX、##P < 0.01 対 DOX。

次に、Nampt 依存性 NAD+ 生合成と心不全の間の病態生理学的関連を調べるために、TAC を産生することによってマウスに圧力過負荷を与えました。 このモデルでは、術後 2 週間で収縮機能が維持された適応性心肥大を誘発し、8 週間で不適応および心不全を誘発することができました (補足表 1)。 手術後8週間では、偽手術心臓と比較して、TAC手術心臓ではNamptのmRNAおよびタンパク質レベルが大幅に減少しました（図2a、b）。 しかし驚くべきことに、酵素活性、Sirt1のmRNAおよびタンパク質レベル、フォークヘッドボックスタンパク質O1（FoxO1）のアセチル化レベルは、TAC手術した心臓と偽手術した心臓の間で変化しませんでした（図2c〜f）。 iNamptタンパク質レベルの減少にもかかわらず、HPLCシステムを使用した直接測定によって明らかになったように、TAC手術した心臓ではNAD +濃度が維持されていました（図2g）。 また、TAC手術した心臓では、偽手術した心臓よりもNMN濃度が有意に高いこともわかりました（図2h）。 これらの結果は、心筋への NMN 供給の増加が iNampt 依存性の NMN 合成の減少を補い、TAC 手術心臓における NAD+ の安定した濃度を達成する可能性があることを示唆しています。

TAC手術した心臓ではNampt発現が減少したにもかかわらず、心筋NAD+濃度とSirt1活性が補償されました。

(a) TAC または偽手術後 8 週間後の心臓における Nampt の mRNA レベル (n = 5)。 (b) 手術後 8 週間の心臓における Nampt の免疫ブロット分析。 Nampt/GAPDH の定量は棒グラフとして示されています (n = 5)。 (c) 手術後 8 週間後の心臓における Sirt1 の mRNA レベル (n = 5)。 (d) 手術後 8 週間の心臓における Sirt1 の免疫ブロット分析。 Sirt1/GAPDH の定量を棒グラフで示します (n = 5)。 （ e ）手術後8週間の心臓におけるSirt1デアセチラーゼ活性（TAC、n = 5;偽; n = 8）。 （ f ）手術後8週間の心臓におけるアセチル化FoxO1（Ac-FoxO1）およびFoxO1の免疫ブロット分析。 Ac-FoxO1/FoxO1 の定量を棒グラフで示します (n = 4)。 （ g ）手術後8週間の心臓のNAD +濃度（TAC、n = 10;偽、n = 11）および（ H ）NMN濃度（TAC、n = 5;偽、n = 4）。 *P < 0.05、**P < 0.01、NS、有意ではありません。

TAC手術マウスでは、偽手術マウスと比較して、eNamptタンパク質とNMNの両方の血漿レベルが大幅に増加しました（図3a、b）。これは、血漿NMNのeNampt依存性生合成の増加が増加に寄与している可能性があることを示唆していますTAC手術マウスの心筋NMNレベルの変化。 さらに、TAC手術マウス血清によるラット新生児心筋細胞の処理は、偽手術マウス血清を用いた場合よりも有意に高いSirt1の脱アセチラーゼ活性を誘導した（図3c）。これは、血漿NMNのeNampt依存性生合成の増加が活性化に十分であることを示唆している心筋におけるSirt1の変化。

CD11b + 単球は、TAC 手術マウスの末梢血における増加した eNampt タンパク質の原因となる可能性があります。

（ a ）TAC（n = 16）または偽（n = 17）手術後8週間の血漿中のeNamptの免疫ブロット分析。 eNampt の定量は棒グラフとして表示されます。 (b) 手術後 8 週間の血漿中の NMN 濃度 (n = 6)。 （ c ）TAC（n = 10）または偽（n = 3）手術後8週間目にマウスの血清で処理したラット新生児心筋細胞におけるSirt1デアセチラーゼ活性。 （ d ）TAC（n = 8）または偽（n = 9）手術後8週間で末梢血から単離された単核細胞におけるNamptのmRNAレベル。 (e) 末梢血中の CD11b – および CD11b + 細胞における Nampt の mRNA レベル (n = 3)。 データは、CD11b – 細胞に対する誘導倍数として示されています。 （ f ）TAC（n = 10）または偽（n = 5）手術後8週間の末梢血中のCD11b + 細胞におけるNamptのmRNAレベル。 *P < 0.05。

血漿 eNampt 増加の考えられる原因を探索する試みとして、TAC または偽手術後のマウス組織における Nampt タンパク質の発現レベルを調べました。 調べた組織の中で、TAC手術後に脾臓のみがNampt発現の有意な増加を示しました（補足図1）。 また、TAC手術マウスの末梢血から単離した単核球では、Nampt mRNAの発現レベルが大幅に増加していることもわかりました（図3d）。 どの部分集団が末梢単核細胞におけるNampt発現の増加に潜在的に寄与しているかを決定するために、骨髄単球系譜マーカーCD11bを使用して未手術マウスの末梢単核細胞から細胞を分離し（補足図2a）、Nampt mRNA発現はCD11b +細胞でのNampt mRNA発現がCD11b +細胞での細胞よりも有意に高いことがわかりました。 CD11b - 細胞内（図3e）。 さらに、TAC手術マウスのCD11b + 細胞におけるNampt mRNA発現は、偽手術マウスのCD11b + 細胞よりも有意に高かった(図3f)。 末梢単核細胞から単離された CD11b + 細胞は、Emr1 mRNA の高い発現レベルを示したので (補足図 2b)、CD11b+、F4/80+ 単球であると考えられました。 脾臓は心筋虚血に反応して動員される髄外単球の貯蔵庫であるため 17 、単球が血漿 eNampt タンパク質の増加源である可能性があると推測しました。

圧力過負荷に対する血行力学的代償におけるNamptの機能的重要性を調べるために、本発明者らは、TACまたは偽手術マウスにFK866またはモックを腹腔内投与した。 TAC手術後1週間という早い時点で心臓iNampt発現の減少と血漿eNampt発現の増加が観察されたため（補足図3）、手術当日にFK866の投与を開始しました。 心エコー検査により、FK866を1週間投与すると、TAC手術マウスでは左心室拡張末期寸法（LVEDD）の有意な増加と短縮率（FS）の有意な減少が誘導されたが、偽手術マウスではこれらのパラメータは変化しなかったことが明らかになった。 (補足表 2)。 結果として、TAC手術マウスの約65％がFK866による治療後1週間以内に死亡した（図4a）。 TAC手術マウスでは、FK866治療はNAD+の心筋濃度（図4b）とSirt1の脱アセチラーゼ活性（図4c）の有意な減少、およびFoxO1のアセチル化レベルの増加（図4d）を誘導しましたが、これらの変化は偽手術マウスでは観察されませんでした（図4b-d）。 結果として、FK866によるNAD +の減少は、Tfam、Pparg、Esrraなどのミトコンドリア機能に関連する遺伝子の発現レベルの大幅な低下をもたらし（図4e）、TUNEL陽性心筋細胞の数の大幅な増加を引き起こしました（図4f、g)。 これらの結果は、Nampt の機能的阻害が心筋 NAD+ レベルと NAD+ 依存性 Sirt1 活性の恒常性維持機構を破壊し、それによって圧過負荷マウスの心臓代償不全を誘発したことを示唆しています。

圧力過負荷マウスにおけるFK866による治療による心臓代償不全。

（a）TACまたは偽手術後にFK866（FK）またはモックで処理したマウスのカプランマイヤー生存曲線（偽+モック、n = 5;偽+FK、n = 5;TAC +モック、n = 8;TAC + FK、n = 17)。 （ b ）手術後7日目の心臓内のNAD +濃度（偽+モック、n = 3;偽+ FK、n = 3;TAC +モック、n = 8;TAC + FK、n = 5）。 （ c ）手術後7日目の心臓におけるSirt1デアセチラーゼ活性（偽+モック、n = 4;偽+ FK、n = 4;TAC +モック、n = 7;TAC + FK、n = 5）。 （ d ）手術後7日目の心臓におけるAc-FoxO1およびFoxO1の免疫ブロット分析（偽+モック、n = 3;偽+ FK、n = 3;TAC +モック、n = 7;TAC + FK、n = 5 ）。 Ac-FoxO1/FoxO1 の定量を棒グラフで示します。 （ e ）手術後7日目の心臓のミトコンドリア関連遺伝子のmRNAレベル（TAC +モック、n = 12;TAC + FK、n = 6）。 （ f ）TAC手術後4日目のFK866またはモックで処理したマウスの心筋細胞の輪郭を示す、DAPIによる核染色（青）およびWGA染色（赤）を伴うTUNEL染色（緑）。 スケールバー、40μm。 （ g ）手術後4日目の心臓のTUNEL陽性心筋細胞の定量（TAC +モック、n = 6;TAC + FK、n = 5）。 *P < 0.05、**P < 0.01、NS、有意ではありません。

心筋NMNおよびNAD+レベルの低下がFK866処置TAC手術マウスの心臓代償不全を引き起こすかどうかをさらに評価するために、これらのマウスにNMNまたはモックを腹腔内投与しました。 NMN治療により、LVEDDや%FSなどの心エコー検査パラメータが大幅に改善され（補足表3）、FK866治療されたTAC手術マウスの早期死亡が防止されました（図5a）。 NMN治療により、NAD+の心筋濃度（図5b）、Sirt1の脱アセチラーゼ活性（図5c）、FoxO1のアセチル化レベル（図5d）、Sod2、Ppargc1a、Tfamなどのミトコンドリア機能に関連する遺伝子の発現レベルが回復しました。 Pparg、Esrra、およびmt-Co3（図5e）およびTUNEL陽性心筋細胞の数（図5f、g）。 まとめると、これらの結果は、Nampt 依存性の NAD+ 生合成が、マウスの心筋 Sirt1 デアセチラーゼ活性と圧力過負荷に対する機能的補償に不可欠であることを示唆しています。

圧力過負荷マウスにおけるNMN投与によるFK866誘発性心臓代償不全の予防。

(a) FK866 (FK) + NMN (n = 9) または FK + モック (n = 8) で処理した TAC 手術マウスのカプランマイヤー生存曲線。 (b) 手術後 7 日目の心臓内の NAD+ 濃度 (n = 5)。 (c) 手術後 7 日目の心臓における Sirt1 デアセチラーゼ活性 (FK + NMN、n = 7; FK + モック、n = 6)。 （ d ）手術後7日目の心臓におけるAc-FoxO1およびFoxO1の免疫ブロット分析（FK + NMN、 n = 5; FK + モック、n = 5）。 Ac-FoxO1/FoxO1 の定量を棒グラフで示します。 (e) 手術後 7 日目の心臓のミトコンドリア関連遺伝子の mRNA レベル (n = 4)。 （ f ）TAC手術後4日目にFK + NMNまたはFK + モックで処理したマウスの心筋細胞の輪郭を示す、DAPIによる核染色（青）およびWGA染色（赤）を伴うTUNEL染色（緑）。 スケールバー、40μm。 (g) 手術後 4 日目の心臓内の TUNEL 陽性心筋細胞の定量化 (n = 5)。 *P < 0.05、**P < 0.01。

単球におけるNampt発現および血漿eNampt濃度の増加は、単球由来のeNamptと圧力過負荷に対するNampt依存性の機能的補償との間の因果関係を示唆した。 このプロセスにおける単球由来の eNampt の重要性をテストするために、マウスをクロドロン酸リポソーム (CloLip) で処理して単球/マクロファージを枯渇させました 18。 フローサイトメトリー分析により、未手術のマウスにおいて、CloLipが治療開始後1日で循環CD11b +、F4 / 80 + 単球の割合の約3.2倍の減少を誘導したことを確認しました（図6a、補足図4a）。 CD11b +、F4 / 80 + 単球の割合は、TAC手術後5日目で約3.1倍増加しましたが、CloLipの併用治療により約1.6倍減少しました（図6a、補足図4b）。 対照的に、CD11b+、F4/80 - 細胞および CD11b -、F4/80 - 細胞の集団は、CloLip 処理後に有意な変化はありませんでした (補足図 4)。 CloLip処理マウスは無気力になり、CloLip処理マウスの約75％がTAC手術後5日以内に死亡しましたが、対照リポソーム（CntrlLip）処理マウスは正常に見えました（図6b）。 心エコー検査により、CloLip 処理マウスでは LVEDD の有意な増加と %FS の有意な減少が明らかになりましたが、CntrlLip 処理マウスではこれらのパラメーターは変化しませんでした (補足表 4)。 CloLip処理は、心臓iNamptタンパク質（図6d）の有意な変化を伴わずに、血漿eNamptタンパク質の有意な減少（図6c）を誘導し、NAD +濃度（図6e）およびSirt1のデアセチラーゼ活性（図6e）の有意な減少をもたらしました。 6f）およびFoxO1のアセチル化レベルの増加（図6g）。 CloLip による NAD+ の減少により、TUNEL 陽性心筋細胞の数が大幅に増加しました (図 6h、i)。 これらの結果は、クロドロネート リポソームを介した CD11b + 細胞の減少が血漿 eNampt タンパク質を減少させ、それによって圧力過負荷マウスの心臓代償不全を誘発したことを示唆しています。

圧力過負荷マウスにおける CloLip による治療による心臓代償不全。

(a) クロドロン酸リポソーム (CloLip) または対照リポソーム (CntrlLip) による治療 1 日後のマウスおよび手術および治療 5 日後の TAC 手術マウスの末梢血中の CD11b+、F4/80 + 単球を示す代表的なフローサイトメトリー分析。 CloLip または CntrlLip。 (b) CloLip (n = 12) または CntrlLip (n = 8) で治療した TAC 手術マウスのカプランマイヤー生存曲線。 （ c ）TAC手術後5日目の血漿中のeNamptの免疫ブロット分析（CloLip、n = 5; CntrlLip、n = 4）。 eNampt の定量は棒グラフとして表示されます。 （ d ）TAC手術後5日目の心臓におけるiNamptの免疫ブロット分析（CloLip、n = 5; CntrlLip、n = 4）。 Nampt/GAPDH の定量は棒グラフとして表示されます。 （ e ）TAC手術後5日目の心臓のNAD +濃度（CloLip、n = 5; CntrlLip、n = 7）。 （ f ）TAC手術後5日目の心臓におけるSirt1デアセチラーゼ活性（CloLip、n = 5; CntrlLip、n = 4）。 （ g ）TAC手術から5日後の心臓におけるAc-FoxO1およびFoxO1の免疫ブロット分析（CloLip、n = 4; CntrlLip、n = 4）。 Ac-FoxO1/FoxO1 の定量を棒グラフで示します。 （ h ）手術およびクロドロン酸リポソーム（CloLip）または対照リポソーム（CntrlLip）による治療の2日後のTAC手術マウスの心筋細胞の輪郭を示す、DAPI（青）およびWGA染色（赤）による核染色を伴うTUNEL染色（緑）。 ）。 スケールバー、40μm。 (i) TAC 手術後 2 日目の TUNEL 陽性心筋細胞の定量 (CloLip、n = 5; CntrlLip、n = 6)。 *P < 0.05、**P < 0.01、NS、有意ではありません。

我々はさらに、NMN治療が圧力過負荷マウスにおけるCloLip誘発性心臓代償不全を予防するかどうかを評価した。 NMN治療により、LVEDDや%FSなどの心エコー検査パラメータが大幅に改善され（補足表4）、CloLip治療したTAC手術マウスの早期死亡が防止されました（図7a）。 NMN治療により、NAD +の心筋濃度（図7b）、Sirt1の脱アセチラーゼ活性（図7c）、FoxO1のアセチル化レベル（図7d）、およびTUNEL陽性心筋細胞の数（図7e、f）が回復しました。 まとめると、これらの結果は、単球由来の eNampt が、マウスの圧力過負荷に対する機能的補償に十分な NAD+ の心筋合成に重要であることを示唆しています。

圧力過負荷マウスにおけるNMN投与によるCloLip誘発性心臓代償不全の予防。

(a) CloLip + NMN (n = 12) または CloLip + Mock (n = 24) で治療した TAC 手術マウスのカプランマイヤー生存曲線。 （ b ）TAC手術後5日目の心臓内のNAD +濃度（CloLip + NMN、n = 3; CloLip + Mock、n = 5）。 (c) TAC 手術後 5 日目の心臓における Sirt1 デアセチラーゼ活性 (n = 4)。 （ d ）TAC手術後5日目の心臓におけるAc-FoxO1およびFoxO1の免疫ブロット分析（n = 4）。 Ac-FoxO1/FoxO1 の定量を棒グラフで示します。 （ e ）DAPIによる核染色（青）およびWGA染色（赤）を伴うTUNEL染色（緑）は、手術およびCloLip + NMNまたはCloLip +モックによる治療の2日後のTAC手術マウスの心筋細胞の輪郭を示しています。 スケールバー、40μm。 (f) TAC 手術後 5 日目の心臓内の TUNEL 陽性心筋細胞の定量 (n = 5)。 *P < 0.05、**P < 0.01。

増加した作業負荷に対する心筋の代償は、多くの細胞内シグナル伝達経路だけでなく、細胞間および組織間通信のクロストークネットワークを含む複雑で統合的なプロセスを通じて達成されます。 我々の現在の研究は、循環単球による心臓恒常性の組織間調節のこれまで知られていない機構を実証する。 我々は、単球由来のeNamptの上方制御によって媒介される循環NMNの増加が、心筋iNampt発現の減少を補って、圧力過負荷マウスの心筋NAD+レベルを維持するという証拠を提供する（図8）。

圧力過負荷に対する心臓の代償における単球由来のeNampt依存性の心筋NAD+生合成の恒常性維持機構。

(a) 圧力過負荷は心臓の iNampt 発現を低下させますが、心筋 NAD+ 濃度と Sirt1 デアセチラーゼ活性は変化しません。 単球由来の eNampt の上方制御は、心筋 NAD+ レベルの維持と圧力過負荷に対する機能的補償に貢献します。 （b）FK866によるNamptの薬理学的阻害またはCloLipによる単球の枯渇は、単球由来のeNamptの代償性上方制御を抑制し、心筋NAD+レベルおよびSirt1活性の恒常性機構を破壊し、圧過負荷誘発性心臓代償不全を引き起こす。 (c) NMN の全身投与は、心筋 NAD+ レベルと Sirt1 活性を回復し、FK866 または CloLip 誘発性の圧力過負荷に対する心臓の代償不全を防ぎます。

Nampt の下方制御により、培養新生児ラット心筋細胞のアポトーシス細胞死が増加することが報告されており 11、Nampt に依存する NAD+ 生合成が DOX 誘発性心毒性から保護されることも観察されました。 Nampt の心臓特異的な過剰発現または NMN の投与は、マウスの心筋 NAD+ レベルを増加させ、虚血または虚血/再灌流傷害から心臓を保護しました。このことは、Nampt がストレスを受けた心臓における心筋 NAD+ 合成と心臓保護に重要であることを示しています 11,12。 一方、Pillai et al。 らは、Nampt の心臓特異的過剰発現がマウスの心肥大と間質性線維症を自発的に誘発し、Nampt のヘテロ接合ノックアウトがイソプロテレノールおよびアンジオテンシン II 誘発性の心肥大を軽減したことを報告し、Nampt が有害な心臓リモデリングの正の制御因子であることを示しています9。 Pillaiらによって報告されたマウスにおける心筋Namptの発現レベルがはるかに高いことを考慮すると、Namptの過剰な産生は心臓の病態生理学に有害である可能性があります。 我々の今回のデータは、血行動態過負荷に対するストレス反応におけるこれまで物議を醸してきたNamptの役割についての我々の理解を明らかに前進させ、Namptの阻害が圧過負荷の初期段階で心臓の代償不全を誘発することを実証している。

最近、eNampt はサイトカインや成長因子と同様に細胞に直接作用することが報告されていますが、心筋細胞に対する eNampt の作用は謎に包まれています。 eNampt による治療は、H9c2 心筋細胞における H2O2 誘発アポトーシスを軽減し 19、再灌流時の eNampt の静脈内投与は、虚血/再灌流のマウスモデルにおける心筋梗塞サイズを縮小しました 20。 それどころか、Montecucco et al。 は、Nampt の薬理学的阻害により、再灌流の初期段階における好中球媒介心筋損傷が軽減されることを報告しました 21。 単球由来 eNampt が心筋細胞に生物学的影響を与えるかどうかは不明のままであったが、TAC 手術マウスでは血漿 NMN が有意に増加し、TAC 手術マウス血清によるラット新生児心筋細胞の処理により Sirt1 の脱アセチラーゼ活性が有意に高くなることが判明した。 したがって、NMN は全身レベルで eNampt によって NAM から細胞外変換され、心臓内の未確認の NMN トランスポーターを介して細胞内に輸送フラックスが送られた後、NAD+ 生合成の基質として使用される可能性があります。 圧力過負荷および虚血/再灌流にさらされた心臓におけるiNamptおよびeNamptによる心筋NAD+の協調的調節を詳細に解明するには、心筋細胞または単球においてNamptを特異的に欠失させるための精巧な遺伝子モデルを用いたさらなる研究が必要となるであろう。

Nampt 依存性 NAD+ 生合成は、サーチュインの脱アセチラーゼ活性の重要な決定因子です 6。 Sirt1 デアセチラーゼ活性の分析により、それが in vitro および in vivo の両方で常に心筋 NAD+ 濃度と相関していることが明らかになりました。 虚血/再灌流のマウスモデルでは、Sirt1の心臓特異的な過剰発現はFoxO1とマンガンスーパーオキシドジスムターゼの活性化を通じて梗塞サイズを縮小させたが、Sirt1の心臓特異的なノックアウトは心筋損傷を悪化させた22。 しかし、導入遺伝子の遺伝子量に起因する矛盾した表現型が、心臓で Sirt1 を過剰発現したマウスの心肥大の発症において観察されました。 低レベルから中程度の Sirt1 過剰発現は、加齢に依存した心臓リモデリングと機能不全の進行を軽減しますが、高レベルの Sirt1 過剰発現は酸化ストレスとアポトーシスを増加させ、心臓機能不全を引き起こします 23,24。 Sirt1 の有益な効果は、ミトコンドリア機能を調節するためのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体 - γ コアクチベーター -1α の脱アセチル化 16,25、ROS を除去するためのマンガンスーパーオキシドジスムターゼのアップレギュレーション 22,26、アポトーシス細胞死 27 とオートファジー誘導のための FoxO1 の脱アセチル化を阻害します 28。 逆に、岡ら。 は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体αと複合体を形成することにより、過剰発現した Sirt1 がエストロゲン関連受容体経路を抑制し、ミトコンドリアの機能不全と心不全の進行を引き起こすことを報告しました 29。 TAC 手術マウスでは、ミトコンドリア機能に関連する遺伝子の発現レベルは、FK866 による治療によって減少した場合、または NMN による治療によって回復した場合に、Sirt1 デアセチラーゼ活性と相関しており、Nampt 依存性の心筋 NAD+ はミトコンドリア機能の調節に関与しています。 Sirt3 および Sirt7 と Sirt1 は心臓において有益な役割を果たしていることが報告されている 15 が、eNampt 依存性の NAD+ 生合成および NAD+ 依存性の Sirt1 などの活性化によって促進される代償機構の全体像を理解するにはさらなる研究が必要である。圧力が過負荷になった心臓のサーチュイン。

脳と膵臓では、iNampt の基礎発現レベルは極めて低く、血漿 eNampt によって維持される循環 NMN は細胞内 NAD+ 生合成の必須基質として機能します 7。 最近の研究では、これらの組織における NAD+ の回復に対する NMN 補給の有効性が実証されています 7、10、30、31。 循環NMNレベルが低下する病的状態では、NMNの補給が治療効果をもたらす可能性があります。 NAD+ だけでなく Nampt タンパク質のレベルも、複数の組織で加齢とともに低下することが報告されています 10,32。 心筋iNamptタンパク質のレベルは変化していなかったものの、老齢マウスは若いマウスと比較して心筋NAD+および血漿eNamptタンパク質のレベルが大幅に減少していることを観察しました（補足図S5）。 心不全の有病率は年齢とともに増加し、心不全を患う高齢患者の予後は若い患者よりも悪いことがよく知られています 33。 eNamptを介したNMN供給の年齢依存的な減少が心筋NAD+の減少を引き起こし、高齢者の罹患率と死亡率の上昇を伴う心不全への感受性の増加につながる可能性があるという仮説は理にかなっています。 さらに、最近の研究では、高レベルの血漿 eNampt が拡張型心筋症患者の良好な臨床転帰と関連していることが実証されており 34 、我々の研究は血漿 eNampt と心不全表現型との相関関係についてのメカニズム的な説明を提供する可能性があります。 私たちの研究は、ストレス条件下で循環する eNampt を介した心筋 NAD+ 調節の新規機構を強調し、心筋 NAD+ の回復に心不全の治療可能性があるかどうかを探る機会を切り開きました。

すべての実験は大阪大学の施設内動物管理使用委員会によって承認され、大阪大学のガイドラインに従って実施されました。 C57BL/6J マウスは日本クレア株式会社から購入しました。TAC 手術のために、塩酸メデトミジン (0.3 mg/kg)、ミダゾラム (4 mg/kg) およびブトルファノール ( ５ｍｇ／ｋｇ）３５を投与し、つま先をつまむことによって麻酔を監視した。 呼吸は、一回換気量0.2mlおよび呼吸数110回/分で人工的に制御した。 胸骨正中切開後、右腕頭動脈と左総頚動脈の枝の間の横大動脈を、鈍化した27ゲージ針を添え木で結紮することにより7-0絹糸で収縮させ、結紮後に抜去した。 次に胸を閉じ、体温を 37 °C に保ちながらマウスを麻酔から回復させました。 術後鎮痛剤（メロキシカム、5 mg/kg/24 時間）を 48 時間皮下投与しました。 外科医はこの研究で使用されたマウスについての情報を持っていませんでした。 in vivo で Nampt 依存性の NAD+ 生合成を阻害するために、実験期間中、マウスに FK866 (10 mg/kg/日) またはモック (コーン油) を腹腔内注射により投与しました 36。 NMN 治療では、実験期間中 1 日 2 回、NMN (500 mg/kg) またはモック (生理食塩水) を腹腔内注射により投与しました 10,30。 クロドロネートおよびコントロールリポソーム（クロフォソーム、コンボキット）はFormuMax Scientific, Inc.から購入しました。単球およびマクロファージの枯渇を誘導するために、25μlの用量のクロドロネートまたはコントロールリポソームを腹腔内投与しました。 心臓の寸法と収縮性を評価するために、意識のあるマウスに対して、25 MHz リニア プローブ (Visual Sonics Inc.) を使用する Vevo 770 Imaging System を使用して経胸壁心エコー検査を実施しました。 24時間飢餓状態にした後、マウスを屠殺し、組織サンプルを収集した。

心筋細胞の初代培養実験は大阪大学動物研究委員会の承認を得て、大阪大学のガイドラインに従って実施した。 簡単に説明すると、動物の安楽死に関する米国獣医師会のガイドラインに従って、生後 1 日の Wistar ラットの心臓組織を採取する前に、訓練を受けた担当者によって頸椎脱臼安楽死が行われました。 心室を細かく刻み、０．１％トリプシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および７０ｕ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．）を含有するＣａ ２＋ を含まないハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で消化した。 プレプレーティング後に心筋細胞を濃縮し、1 × 105 細胞/cm2 のフィールド密度でプレーティングし、10% ウシ胎児血清 (BGS) を添加した DMEM で 24 時間培養しました。 24 時間の血清飢餓（1% BGS）後、心筋細胞を DOX（1 μM、3 時間）およびアロステリック Nampt 阻害剤 FK866（500 nM、24 時間）または NMN（500 μM、24 時間）で刺激しました10。 DOX は Sigma-Aldrich から購入し、FK866 と NMN はそれぞれ Cayman Chemical と Sigma-Aldrich から購入しました。 細胞生存率は、生細胞によるテトラゾリウム化合物 MTS の有色生成物への代謝変換に基づく CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega) を使用して測定しました。

細胞を溶解し、組織を緩衝液(20 mM Tris、pH 7.4、150 mM NaCl、5 mM EDTA、pH 8.0、100 mM Na3VO4、0.5% Nonidet P-40およびComplete Miniプロテアーゼ阻害剤(Roche Applied Science))中でホモジナイズした。 Ac-FoxO1 の検出のために、組織を 10 mM NAM および 1 μM トリコスタチン A を含む緩衝液中でホモジナイズしました。核分画のために、細胞を緩衝液（10 mM HEPES、pH 7.9、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl、0.5 mM DTT）中で溶解しました。 、0.05% Nonidet P-40、10 mM NAM、1 μM トリコスタチン A および Complete Mini プロテアーゼ阻害剤) を加え、4 °C で 10 分間インキュベートし、4 °C で 800 g で 10 分間遠心分離しました。 ペレットを緩衝液（50 mM Tris、pH8.0、150 mM NaCl、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、1% Nonidet P-40 および 0.1% SDS、10 mM NAM、1 μM トリコスタチン A および Complete Mini プロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、インキュベートしました。 4℃で30分間遠心分離し、4℃、10.400gで20分間遠心分離した。 上清を核画分として等分した。 マウス血漿、過剰血漿タンパク質（アルブミン、IgM、IgG、IgA、ハプトグロビン、トランスフェリン、α1-アンチトリプシン、フィブリノーゲン、α2-マクログロブリン、α1-酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質AI、アポリポタンパク質AII、補体C3、トランスサイレチン）からのタンパク質サンプルの調製用）を、製造業者の指示に従って、Multiple Affinity Removal Spin Cartridge System (Agilent Technologies) を使用して除去しました。

タンパク質サンプルをSDS-PAGEで分画し、PVDF膜(GE Healthcare Biosciences)に転写した。 ブロットした膜を一次抗体、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギ IgG 抗体 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) とインキュベートしました。 免疫反応性シグナルは、ECL Plus ウェスタンブロッティング検出システム (GE Healthcare Biosciences) で検出され、ルミノイメージアナライザー (ImageQuant LAS 4000 mini; GE Healthcare Biosciences) を使用して視覚化されました。 以下の一次抗体を使用した：ウサギポリクローナル抗PBEF抗体（Bether Laboratories, Inc.）、ウサギポリクローナル抗Sirt1抗体（Merck Millipore）、ウサギポリクローナル抗GAPDH抗体（Abcam）、ウサギポリクローナル抗Ac-FoxO1抗体（ Santa Cruz Biotechnology, Inc.）、ウサギモノクローナル抗FoxO1抗体（Cell Signaling Technology, Inc.）、ウサギポリクローナル抗Ac-K抗体（Cell Signaling Technology, Inc.）、およびウサギモノクローナル抗ヒストンH3抗体（Cell Signalingテクノロジー株式会社）。

TRIzol 試薬 (Life Technologies, Inc.) を使用して全 RNA を抽出し、TURBO DNA-free Kit (Life Technologies, Inc.) を使用して DNase で処理して汚染ゲノム DNA を除去しました。 一本鎖cDNAは、製造業者のプロトコールに従って、The SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (Life Technologies, Inc)を使用して転写されました。 メーカーの指示に従って、Light Cycle TaqMan Master Kit (Roche Applied Science) と、Universal ProbeLibrary System (Roche Applied Science) によって設計されたターゲット特異的プライマーおよびマッチング プローブを使用して、定量的リアルタイム PCR 分析を実施しました。 増幅条件は、95 °C で 10 分間の初期変性、その後 95 °C で 10 秒および 60 °C で 25 秒の 45 サイクルでした。 個々の PCR 産物は融点分析によって分析されました。 遺伝子の発現レベルは、比較 Ct 法を使用することにより、マウス Gapdh およびラット 28S rRNA の発現レベルに対して正規化されました。 プライマー配列およびユニバーサルプローブ番号は、ProbeFinder ソフトウェアを使用して次のように設計しました。マウス Nampt、5'-cctgttccaggctattctgttc-3' および 5'-atggtctttcccccaagc-3'、No. 84。 マウス Sirt1、5'-cgtggagacatttttaatcaggta-3' および 5'-gcttcatgatggcaagtgg-3'、No. 104。 マウス Gapdh、5'-tgtccgtcgtggatctgac-3' および 5'-cctgcttcaccaccttcttg-3'、No. 80。 マウス Sod2、5'-gacccattgcaaggaacaa-3' および 5'-gtagtaagcgtgctccccacac-3'、No. 3。 マウス Ppargc1a、5'-gaaagggccaaacagagaga-3' および 5'-gtaaaatcacacggcgctctt-3'、No. 29。 マウス Tfam、5'-caaaggatgattcggctcag-3' および 5'-aagctgaatatatgcctgcttttg-3'、No. 94。 マウス Pparg、5'-aagacaacggacaaatcacca-3' および 5'-ggggtgatatgtttgaacttg-3'、No. 7。 マウス Nrf-1、5'-tggagtccaagatgctaatgg-3' および 5'-gcgaggctggttaccaca-3'、No.100。 マウス Esrra、5'-ccttccctgctggacctc-3' および 5'-cgacaccagagcgttcact-3'、No. 78。 マウス mt-Co3、5'-tagcctcgtaccaacacatga-3' および 5'-agtggtgaaattcctgttgga-3'、No. 66。 マウス Itgam、5'-aaggatgctggggaggtc-3' および 5'-gtcataagtgacagtgctctggat-3'、No. 16。 マウス Emr1、5'-cctggacgaatcctgtgaag-3' および 5'-ggtgggaccacagagagttg-3'、No. 1。 ラット 28S rRNA、5'-gctggctaggcagacaacat-3' および 5'-gacctgacgatgacagaggaa-3'、No. 107。 ラット Sod2、5'-tggacaaacctgagccctaa-3' および 5'-gacccaaagtcacgcttgata-3'、No. 67。 ラット Ppargc1a、5'-aaagggccaagcagagaga-3' および 5'-gtaaatcacacggcgctctt-3'、No. 29。 ラット Tfam、5'-tcggtcagcatataacatttacg-3' および 5'-caagcctgatttacaagcttca-3'、No. 79。 ラット Pparg、5'-cccaatggttgctgattaca-3' および 5'-ggacgcaggctctactttga-3'、No. 125。 ラットＮｒｆ１、５’−ａｔａｇｔｃｃｔｇｔｃｔｇｇｇｇａａａｃｃ−３’および５’−ｔｃｃａｔｇｃａｔｇａａｃｔｃｃａｔｃｔ−３’、Ｎｏ．１０９； ラット Esrra、5'-ggtggaccattgccttt-3' および 5'-caccagggcgttaactgg-3'、No. 78。 ラット mt-Co3、5'-taaacccaagcccatgacc-3' および 5'-agccggatgtaagtagaagagc-3'、No. 92。

NAD+ および NMN レベルは、CAPCELL PAK C18 MGIII S5 カラム (15 cm × 2.0 mm、資生堂) および YMC-Pack Pro C18 RS カラム (15 cm × 4.6 mm) を備えた HPLC システム (資生堂株式会社) を使用して測定しました。 ；ＹＭＣ株式会社）をそれぞれ前述したように１０． マウスの凍結組織または新たに採取した血漿、または培養心筋細胞を1M過塩素酸で抽出しました（200μl/10mg組織、100μl/10μl血漿、500μl/6cmディッシュ）。 抽出物を 15,000 rpm、4 °C で 10 分間遠心分離し、得られた上清を 3 M K2CO3 中で氷上で 10 分間中和しました。 抽出物を除去した後、100μlのアリコートを50μlの緩衝液A(50mM K2HPO4/KH2PO4、pH7.0)および50μlの水と混合した。 NAD+ 測定の場合、HPLC を流速 200 μl/min で 0 ～ 5 分間は 100% バッファー A、5 ～ 6 分間は 95% バッファー A/5% バッファー B (100% メタノール) までの直線勾配で実行しました。分、6 ～ 11 分までは 95% バッファー A/5% バッファー B、11 ～ 13 分までは 85% バッファー A/15% バッファー B への直線勾配、13 ～ 23 分までは 85% バッファー A/15% バッファー B 23 ～ 24 分間は 100% バッファー A への直線勾配。 NMN 測定では、HPLC を 700 μl/分の流速で、0 ～ 5 分間は 100% バッファー A、5 ～ 10 分間は 60% バッファー A/40% バッファー B、60% バッファーへの直線勾配で実行しました。 10 ～ 32.5 分は A/40% バッファー B、32.5 ～ 35 分は 100% バッファー A への直線勾配。 NAD+ と NMN は通常、それぞれ 14 分と 25 分で溶出しました。 NAD+ および NMN レベルは、標準曲線と比較したピーク面積に基づいて定量され、凍結組織の重量、血漿量、および培養心筋細胞の数に対して正規化されました。

Sirt 1 デアセチラーゼ活性は、Fluor de Lys-SIRT1 基質ペプチドに基づいた SIRT1 蛍光活性アッセイ/創薬キット (Enzo Life Science International) を使用して測定しました。 マウスの心臓またはラット新生児心筋細胞からのタンパク質抽出物 (10 μg) を、蛍光発生性アセチル化ペプチド基質とインキュベートしました。 反応は37℃で1時間実施し、蛍光プレートリーダー(SH-9000Lab、日立ハイテクノロジーズ株式会社)で360 nm励起および460 nm発光で蛍光シグナルを測定しました。

マウス末梢血を採取し、Histopaque 1083 (Sigma-Aldrich) を用いて単核球を分離した。 簡単に説明すると、1 ml の全血を遠心分離管内の 5 ml の Histopaque 1083 上に注意深く層状に重ね、その管を室温で 400 g で 30 分間遠心分離しました。 単核細胞バンドを含む不透明な界面をパスツールピペットを使用して収集した。 CD11b + 単球の分離は、MACS システム (Miltenyi Biotech) を使用して選別することによって達成されました。 単核細胞をラット抗CD11b抗体（Merck Millipore）とともに4℃で20分間インキュベートし、3％FBSを添加したPBSで洗浄し、抗ラットマイクロビーズとともに4℃で20分間インキュベートし、PBSで洗浄しました。 3% FBS が添加されています。 サンプルをMiltenyi磁石内に設置されたMACS MSカラム(Miltenyi Biotech)に通し、3% FBSを補充したPBSで洗浄することによってCD11b + 単球をカラムから溶出した。

in situ Apoptosis Detection Kit (タカラバイオ株式会社)を用いて、DAPIによる核染色を伴うTUNELアッセイを実施した。 心臓を切除し、直ちにTissue-Tek OCTクライオコンパウンド(Sakura Finetek Japan)に包埋した。 5 μm の新鮮な凍結切片を室温で 30 分間アセトンで固定し、その後 PBS で 30 分間洗浄しました。 切片をメタノール中の0.3% H2O2とともに室温で30分間インキュベートして内因性ペルオキシダーゼをブロックし、その後PBSで5分間3回洗浄した。 氷上で5分間透過化バッファー中でインキュベートした後、切片を加湿チャンバーに置き、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合dUTPを含むTdT酵素とともに37℃で60分間インキュベートしました。 筋細胞と非筋細胞のアポトーシスを区別するために、組織切片も Alexa Fluor 594 結合小麦胚芽凝集素 (WGA) (Life Technologies, Inc.) で室温で 60 分間染色し、その後 PBS で 5 分間 3 回洗浄しました。分。 最後に、切片を ProLong Gold Antifade Reagent (Life Technologies, Inc.) でマウントしました。 画像は、蛍光顕微鏡 (FSX100; Olympus) および Olympus FSX-BSW ソフトウェア (Olympus) を使用して取得しました。

心臓穿刺から得られた全血をEDTAで緩衝化し、BD FACS Lysing Solution (BD Biosciences)を使用して赤血球溶解に供し、3%のウシ胎児血清を補充したPBSで洗浄した。 抗体のFcRへの非特異的結合を最小限に抑えるために、血液白血球を最初にラット抗マウスFcR/III抗体(2.4G2)(BD Biosciences)とともにインキュベートした。 さらに、APC結合抗CD11b抗体(BD Biosciences)およびPE結合抗F4/80抗体(BD Biosciences)とともに氷上で10分間インキュベートし、3%ウシ胎児血清を添加したPBSで洗浄した。 CD11b + およびF4/80 + 細胞の割合を、EXPO32ソフトウェア(Beckman Coulter)を使用するFACS Canto IIフローサイトメーター(BD Biosciences)によって分析した。

すべてのデータは平均値 ± SEM として表示されます。 2群の比較は対応のない両側スチューデントのt検定によって分析し、複数群の比較は一元配置分散分析とその後の平均値の比較のためのTukey-Kramer HSD検定によって実行しました。 カプランマイヤー法により生存曲線を推定し、一般化ウィルコクソン検定によりグループを比較しました。 P < 0.05 の値は統計的に有意であるとみなされました。

この論文の引用方法: Yano, M. et al. 単球由来の細胞外Nampt依存性のNAD+生合成は、心臓を圧力過負荷から保護します。 科学。 議員 5、15857; 土井: 10.1038/srep15857 (2015)。

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技術的なアドバイスをいただいた浜中裕也氏、優れた技術支援をいただいた清水正樹氏、谷脇博史氏、川口和也氏、宮川直樹氏、上田裕司氏に感謝いたします。 この研究の一部は、日本学術振興会の助成金（HA への科研費 23390213、24659390、26670395、IK への科研費 21229010）および日本医療研究開発機構 AMED-CREST の支援を受けました。

大阪大学大学院医学系研究科循環器内科学教室（〒565-0871 大阪府吹田市）

Masamichi Yano, Toru Oka, Chizuru Yabumoto, Yoko Kudo-Sakamoto & Yasushi Sakata

〒113-8655 東京都文京区 東京大学大学院医学系研究科 循環器内科学

Hiroshi Akazawa, Takehiro Kamo, Yu Shimizu, Hiroki Yagi, Atsuhiko T. Naito & Issei Komuro

大阪大学大学院薬学研究科臨床薬学教育ユニット（〒565-0871 大阪府吹田市）

Chizuru Yabumoto

大阪大学大学院医学系研究科心臓血管再生医学分野（〒565-0871 大阪府吹田市）

内藤篤彦 & ジョングク・リー

〒113-8655 東京文京区東京大学大学院医学系研究科先端臨床医学専攻

Jun-ichi Suzuki

〒100-0004 東京都千代田区日本医療研究開発機構 AMED-CREST

Hiroshi Akazawa, Toru Oka, Atsuhiko T. Naito, Jong-Kook Lee & Issei Komuro

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HA と IK が実験を計画、設計しました。 IKがプロジェクトを監修しました。 YM、TO、CY、YK-S。 実験を行った。 TK、Y.Sh. そしてHYがデータを分析した。 ATN、JK.L.、JS、Y.Sa. 実験についてアドバイスしました。 MY、HA、IKが原稿を書きました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

矢野正人、赤澤洋、岡哲也、他単球由来の細胞外Nampt依存性のNAD+生合成は、心臓を圧力過負荷から保護します。 Sci Rep 5、15857 (2015)。 https://doi.org/10.1038/srep15857

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受信日: 2015 年 7 月 17 日

受理日: 2015 年 10 月 5 日

公開日: 2015 年 11 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15857

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