リモシラクトバチルス・ムコサエ

npj Biofilms and Microbiomes volume 9、記事番号: 33 (2023) この記事を引用

40 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

下痢性疾患は、特に子供や若い動物において高い死亡率を引き起こします。腸内マイクロバイオームは下痢性疾患と強く関連しており、いくつかの特定の細菌株が下痢止め効果を実証しています。しかし、プロバイオティクス株の下痢止めメカニズムはまだ解明されていません。今回、我々は新生子豚をトランスレーショナルモデルとして使用し、下痢をしている子豚で観察される腸内細菌叢の異常が、主に乳酸菌の欠乏、豊富な大腸菌、および豊富なリポ多糖生合成によって特徴付けられることを発見した。リモシラクトバチルスムコサエとリモシラクトバチルスロイテリは、健康な子豚と下痢をしている子豚を区別する代表的な細菌でした。下痢性子豚の糞便微生物叢を移植された無菌（GF）マウスは、下痢性疾患の症状を再現しました。リモシラクトバチルス・ロイテリではなく、リモシラクトバチルス・粘膜の投与は、下痢性子豚の糞便微生物叢およびETEC K88攻撃によって誘発される下痢性疾患の症状を緩和した。特に、Limosilactobacillus mucosae 由来の細胞外小胞は、マクロファージの表現型を制御することにより、ETEC K88 によって引き起こされる下痢性疾患の症状を軽減しました。マクロファージ除去実験により、細胞外小胞がマクロファージ依存的に下痢性疾患の症状を軽減することが実証されました。私たちの発見は、腸内細菌叢の観点から下痢性疾患の病因についての洞察と、プロバイオティクスに基づいた下痢止め治療戦略の開発を提供します。

下痢性疾患は乳児に多く見られ、毎年世界中で 5 歳未満の小児の下痢性疾患による 50 万人以上の死亡が報告されています 1、2、3。高い死亡率に加えて、幼児期の下痢性疾患は栄養失調と持続的な腸損傷を引き起こします4,5,6。下痢性疾患は、腸のバリア機能の障害と腸の粘膜透過性の増加を引き起こし、腸の炎症の発症を誘発し、最終的には成長遅延を引き起こし、その後の病原体感染に対する抵抗力の低下を引き起こします7,8。下痢を引き起こすメカニズムは数十年にわたって研究され、下痢による死亡率は大幅に減少しましたが、主にその複雑な原因により、下痢は依然として重大な死亡率と罹患率を引き起こしています9,10。したがって、新生児下痢症の病因を解明することは非常に重要です。

幼少期は、腸内微生物叢、腸の物理的バリア機能、免疫系の発達のチャンスです11。新生児の腸内細菌叢は、腸内の栄養素の代謝、免疫系の成熟、腸管バリアの維持を調節することにより、宿主の健康に大きな影響を与えます12、13、14、15。腸内細菌叢の不安定性と免疫系の未熟により、新生児は特に病原体に対して脆弱になります16。下痢が起こると、腸内微生物叢の組成の破壊に続いて病原性微生物の定着が顕著に増加します。これは、微生物叢の破壊がこれらの菌株の病原性を高めることを示唆しています 17。安定した腸内細菌叢は、病原性微生物の定着に対する抵抗力を向上させ、宿主の健康を促進します 18,19。

最近、糞便微生物叢移植（FMT）は、クロストリジウム・ディフィシル感染症、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群の治療において予想外の良好な結果を達成しました。したがって、FMT は複雑な腸疾患の日常的な治療法となっています 20、21、22、23。しかし、FMT治療中にどの腸内微生物が治療効果をもたらすのかを明らかにすることは課題でした。キーストーンプロバイオティクス株による腸内微生物叢の再構成が胃腸疾患に対する効果的な戦略であることを示唆する証拠が増えています 24,25。したがって、下痢を軽減する可能性のある特異的なプロバイオティクスを同定することにより、新生児下痢症の正確な制御と腸疾患の予防のための新しい戦略が提供される可能性があります。

細菌の細胞外小胞（EV）は、栄養素の獲得、病原性因子の送達、免疫制御などの細胞間相互作用を伴うさまざまな病態生理学的機能に関与しています26、27。特に、EVは、宿主細胞への毒素および病原性因子の送達を通じて細菌の病因および侵入を媒介することが示されている28。細菌性EVに関する初期の研究の多くは、病原性グラム陰性菌におけるその役割に焦点を当てていたが、最近では、ますます多くのグラム陽性菌がEVを産生することが示されている。例えば、EV を産生するグラム陽性菌には、炭疽菌 29、肺炎連鎖球菌 30、枯草菌 31、およびウェルシュ菌 32 が含まれます。ラクトバチルスは最も一般的なグラム陽性菌であり、L. カゼイ BL2333、L. プランタルム WCFS134、および L. アシドフィルス 35 など、いくつかのラクトバチルス種が EV を産生することが最近判明しました 35。しかし、最近の研究では一部のラクトバチルス株が哺乳類の下痢性疾患の予防に優れた有効性を持っていることが示されているにもかかわらず、これらのラクトバチルス由来の EV の潜在的な役割と機能は広く研究されていません 24。したがって、下痢止め特性を持つ乳酸菌がEVを通じてその効果を発揮するかどうかは、さらなる調査に値する。

ヒトとブタの腸の構造と発達の類似性により、ブタは胃腸疾患の病態生理学的基礎を研究するための優れた動物モデルとなっています 36,37。ここでは、動物モデルとして新生子豚、無菌 (GF) マウス、および特定病原体無菌 (SPF) マウスを使用し、マルチオミクス、糞便微生物移植 (FMT)、腸毒素原性大腸菌 K88 (ETEC K88) 誘発性遺伝子を統合することにより、この研究では、腸の炎症性損傷、およびリモシラクトバチルスムコサエ (L. ムコサエ) およびその派生 EV による介入を利用して、新生児の下痢性子豚の腸内微生物叢を体系的に特徴付け、腸内微生物叢と下痢性疾患の症状との因果関係をさらに明らかにし、根底にあるメカニズムを次の方法で解明しました。健康な子豚由来の乳酸菌が下痢性疾患の症状を軽減します。これらの結果は、乳酸菌とそれに由来するEVが乳児の腸の健康にどのように影響するかについての洞察を提供し、下痢関連疾患の予防と治療の戦略を示唆しています。

健康な新生子豚と下痢性新生子豚の腸内細菌叢の組成と機能の特徴を明らかにするために、健康な新生子豚30頭と下痢性新生子豚30頭から採取した糞便サンプルのメタゲノム配列決定を行いました（図1A）。門レベルでは、豊かさ指数は有意に低く（ P = 0.035）、シャノン指数（ P = 0.043）およびシンプソン指数（ P = 0.022）は、健康な子豚と比較して下痢のある子豚の方が有意に高かった（補足図1A）。主座標分析（PCoA）により、微生物の構造も2つのグループ間で異なることが示されました（P = 0.002;補足図1B）。ファーミクテス属、バクテロイデス属、およびプロテオバクテリアが、両方のグループの主要な門でした（補足図1C）。下痢性子豚では、ファーミクテス属と放線菌の割合が大幅に低く、フソバクテリアの割合が大幅に高かった（補足図1D）。

健康な新生児と下痢をしている子豚のセレクション。 B 健康な下痢のある子豚からの糞便微生物叢の GF マウスへの移植。 C 下痢をしている子豚の糞便微生物叢によって引き起こされる腸損傷に対する L. 粘膜および L. ロイテリの保護効果。 D ETEC K88 によって引き起こされる腸損傷に対する L. mucosae の保護効果。 E ETEC K88によって引き起こされる腸損傷に対するL. mucosaeのEVの保護効果。 F マウスにおけるマクロファージの生体内除去。

属レベルでは、下痢を起こした新生子豚のリッチネス指数は有意に低く（P = 0.000）、シンプソン指数（P = 0.018）は有意に高かった（補足図2A）。 2つのグループ間の属レベルでの微生物叢の構造にも有意な違いがありました（P = 0.000;補足図2B）。 Lactobacillus、Escherichia、およびBacteroidesは、下痢を起こした新生子豚の優勢な属であり、Lactobacillus、Bacteroides、およびPrevotellaは、健康な新生子豚の優勢な属でした（補足図2C）。健康な新生子豚と下痢性の新生子豚の間で21の異なる細菌属を特定しました（補足図2D）。健康な新生児子豚と比較して、下痢を起こした新生児子豚は、5 つの豊富な属 (バゴコッカス、スッテレラ、メガスファエラ、フソバクテリウム、およびアリゾネラ) と、16 の枯渇した属 (ストレプトコッカス、スラッカー、ルテニバクテリウム、ペプトストレプトコッカス、ラクトバチルス、ホルデマネラ、ジェメラ、フェカリコッカス、エリシペラトクロストリ) によって特徴づけられました。ジウム、アイゼンベルギエラ、コリンセラ、クロストリジウム、クリステンセネラ、カンピロバクター、アナエロトランクス、およびアナエロマシリバチルス）。

種レベルでは、下痢状態の子豚の豊かさ指数は健康な子豚よりも有意に低かった(P = 0.001) (図 2A)。 PCoA分析により、このレベルで2つのグループ間の微生物構造に有意な違いがあることがわかりました（P = 0.001、図2B）。我々は、大腸菌の相対存在量が下痢をしている子豚で最も高く、L.膣菌が健康な子豚で最も多いことを観察しました（図2C）。さらに、合計 31 種の相対存在量が 2 つのグループ間で大きく異なることもわかりました (図 2D)。ランダムフォレスト分析により、Ruthenibacterium lactatiformans、Limosilactobacillus reuteri (L. reuteri)、および L. mucosae を含むいくつかの重要な種が、下痢の発症の媒介に重要な役割を果たしている可能性があることが示されました (図 2E)。これら 20 個の細菌を変数として使用して確立されたランダムフォレスト分類モデルの精度を受信者動作特性曲線 (ROC) 分析によってテストしたところ、AUC 値が 0.967 に達することがわかり、モデルの精度が高いことが示されました (図 2F)。

健康な新生子豚と下痢を起こした新生子豚の種レベルでの腸内微生物叢のアルファ多様性（リッチネス、シャノン、シンプソン）の比較。 B 種レベルでの健康な新生児子豚と下痢をしている新生子豚の間の腸内微生物叢の PCoA 分析。データはPERMANOVAを使用して分析されました。 C 上位 20 の細菌種の種組成のヒストグラム。 D 2 つのグループ間の細菌種の違い。 E ランダムフォレスト分析から得られた主要な種。 F ROC 分析はランダムフォレストモデルに対して実行されました。 G 差次的な KO によって強化された上位 20 の KEGG 経路。 H 糞便 LPS 含有量。 n = 30。データは平均値 ± SEM (H) として表され、一元配置分散分析を実行し、続いて LSD 検定 (H) を実行しました。 *P < 0.05、下痢グループ vs 健康グループ。

合計で、2 つのグループ間で大きく異なる 410 個の京都遺伝子およびゲノム百科事典 (KEGG) オルソログ (KO) が特定されました (補足表 1)。 KEGG 機能分析により、次の経路の濃縮が 2 つのグループ間で大きく異なることがさらに明らかになりました: 補因子の生合成、アミノ酸の生合成、炭素代謝、アミノ糖およびヌクレオチド糖の代謝、リボソーム、酸化的リン酸化、O 抗原ヌクレオチド糖生合成、システインおよびメチオニン代謝、解糖/糖新生、ピルビン酸代謝、鞭毛集合、クエン酸回路、アミノアシルtRNA生合成、ペントースリン酸経路、相同組換え、ミスマッチ修復、リポ多糖生合成、チアミン代謝、葉酸による1つの炭素プール、およびカウロバクター細胞サイクル（図２Ｇ）。さらに、リポ多糖（LPS）生合成経路に富むすべてのKOが、下痢を起こした新生子豚で上昇していることを観察しました（補足表1）。したがって、便中のLPS含有量は、健康な子豚と比較して、下痢をしている子豚において有意に高かった(P < 0.05;図2H)。

下痢性子豚の腸内微生物叢が宿主の成長と炎症状態に及ぼす影響を評価するために、FMT 実験を実施しました (図 1B)。 H-FMT グループの体重増加率は 5 日目から D-FMT グループよりも有意に高く、この速度の差は実験終了まで持続することがわかりました (図 3A)。血液中の日常的な生化学パラメータを測定しました (図 3B)。総白血球数 (WBC) (P = 0.001)、リンパ球 (LYM) (P = 0.049)、好中球顆粒球 (NEU) (P = 0.041)、単球 (MON) (P = 0.000)、および MON% (P = 0.039)、D-FMT グループの方が有意に高かった。

A 実験期間中のマウスの体重。 B 実験マウスの血液中の WBC、LYM、NEU、MON、LYM%、NEU%、MON% のレベル。 C 腸の 5 つの部分における差次的遺伝子の火山プロット。青は D-FMT グループで有意に下方制御されている遺伝子を示し、赤は D-FMT グループで大幅に上方制御されている遺伝子を示します。 D 5 つの腸管分化遺伝子が豊富な KEGG シグナル伝達経路。円の大きさは経路内に豊富に含まれる遺伝子の数を表し、色は P_adjust に関連します。 A、B の場合は n = 10。 C、Dについてはn = 4。データは平均±SEM（A、B）として表され、一元配置分散分析を実行し、続いてLSD検定を実行しました（A、B）。 *P < 0.05: H-FMT グループ vs D-FMT グループ。

私たちは、両グループのマウスの十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および結腸からの宿主細胞のトランスクリプトームを配列決定し、分析しました。これらの 5 つの腸セグメントの遺伝子プロファイルは、FMT 後に明確なパターンを示しました (図 3C)。十二指腸には 134 個の異なる遺伝子が存在し、D-FMT グループではそのうち 79 個の遺伝子が有意に上方制御され、55 個の遺伝子が有意に下方制御されていることがわかりました。空腸には 309 個の異なる遺伝子があり、D-FMT グループでは 176 個の遺伝子が有意に上方制御され、133 個の遺伝子が有意に下方制御されていました。回腸には 1609 個の異なる遺伝子があり、D-FMT グループでは 670 個の遺伝子が有意に上方制御され、939 個の遺伝子が有意に下方制御されていました。盲腸には 204 個の異なる遺伝子があり、D-FMT グループでは 95 個の遺伝子が有意に上方制御され、109 個の遺伝子が有意に下方制御されていました。結腸には 812 個の異なる遺伝子があり、D-FMT グループでは 570 個の遺伝子が有意に上方制御され、242 個の遺伝子が有意に下方制御されていました。

我々は、これらの異なる遺伝子が関与する経路に注釈を付けたところ（図3D）、NF-κBシグナル伝達経路、ホスホリパーゼDシグナル伝達経路、細胞接着分子、Bシグナル伝達経路など、いくつかのシグナル伝達経路が5つの腸セグメントすべてで大幅に濃縮されていることを発見しました。細胞受容体シグナル伝達経路、FcイプシロンRIシグナル伝達経路、ホスホイノシチド3-キナーゼ/Aktシグナル伝達経路、およびカルシウムシグナル伝達経路。さらに、上記のシグナル伝達経路に関与する主要な差次的遺伝子がすべての腸セグメントで観察されることを示しました（補足図3）。

D-FMT グループのマウスの回腸絨毛の長さは有意に短縮され (P = 0.000)、D-FMT グループの絨毛と陰窩の長さの比はマウスの回腸絨毛の長さよりも有意に低かった (P = 0.000) ことがわかりました。 H-FMT グループ (図 4A および補足図 4A)。結腸の組織病理学的スコアは、D-FMT グループで有意に高く（P = 0.013、図 4A および補足図 4A）、中性ムチンおよび酸性ムチンの数は、H グループよりも D-FMT グループで有意に低かった。 -回腸（P = 0.013/0.009）と結腸（P = 0.043/0.029）の両方のFMTグループ（図4Aおよび補足図4A）。

A H-FMT および D-FMT マウスの回腸および結腸組織切片: 画像の最初の行は H&E 染色を示し、2 行目は PAS 染色を示し、3 行目は AB 染色を示します (スケールバー、50 μm)。 B 血清中の IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 C 回腸組織における IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 D 結腸組織における IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 E 回腸および結腸における ZO-1、オクルディン、AKT、および NF-κB タンパク質と p-AKT および p-NF-κB のレベル。 F 種レベルでの PCoA 分析: データは PERMANOVA を使用して分析されました。上位 20 種の種組成ヒストグラム。上位 20 の KEGG 経路は、KO の差が豊富です。種レベルでの H-FMT グループと D-FMT グループ間の差異を示す微生物バブルプロット。 G メタボロームの PLS-DA 分析。示差的代謝物のヒートマップ。写真の左側は濃縮された代謝産物のグループで、右側は代謝産物の名前とその対応するクラスです。 A ～ D、F、G の場合は n = 10。 Eの場合はn = 4。データは平均±SEM（B〜D）として表され、一元配置分散分析を実行した後、LSD検定を実行しました（B〜D）。 *P < 0.05: H-FMT グループ vs D-FMT グループ。

また、血清、回腸、結腸の炎症と腸管透過性に関連する指標も測定しました。インターロイキン (IL)-1β (P = 0.001)、IL-6 (P = 0.041)、IL-8 (P = 0.017)、腫瘍壊死因子 (TNF)-α (P = 0.045)、LPS ( P = 0.004）、ジアミンペルオキシダーゼ（DAO）（P = 0.019）、d-乳酸（d-LA）（P = 0.021）の濃度は、H-FMT グループよりも D-FMT グループの方が有意に高かった（図 1）。 4B）。 IL-1β (P = 0.029)、IL-6 (P = 0.013)、および TNF-α (P = 0.035) のレベルは、H-FMT 群よりも D-FMT 群のマウスの回腸で有意に高かった。しかし、GF マウスの回腸における LPS、IL-8、DAO、または D-LA のレベルには 2 つのグループ間で有意な差はありませんでした (図 4C)。結腸内のIL-1β（P = 0.041）、IL-6（P = 0.005）、IL-8（P = 0.004）、TNF-α（P = 0.039）およびLPS（P = 0.037）のレベルは、有意に高かった。 D-FMT グループの方が H-FMT グループよりも高かったが、DAO と d-LA には 2 つのグループ間で有意な差はありませんでした (図 4D)。図４Ｅに示すように、Ｄ−ＦＭＴ群におけるＺＯ−１およびオクルディンタンパク質の発現レベルは、回腸および結腸の両方で有意に減少した。さらに、総AKTとNF-κBのタンパク質量はD-FMT群とH-FMT群で同様であったが、D-FMT中のp-AKTとp-NF-κBのレベルはD-FMT群の方が有意に高かった。 H-FMT グループよりも優れています。

FMT後のGFマウスの腸内マイクロバイオームの組成と機能を調査するために、糞便サンプルに対してメタゲノム配列分析を実行しました。門レベルでは、豊かさ指数に有意な差がありました（P = 0.003;補足図5A）。門レベルでのベータ多様性の違いは、2つのグループ間で観察されませんでした（補足図5B）。 2つのグループの門構成を分析したところ（補足図5C）、両方のグループの微生物叢が主にバクテロイデテスとファーミクテスで構成されていることがわかりました。細菌の違いをさらに分析すると、D-FMT グループでは放線菌の相対存在量が著しく低いことが示されました（補足図 5D）。

属レベルでは、D-FMT グループのシャノン指数 (P = 0.015) およびシンプソン指数 (P = 0.003) は、H-FMT グループよりも有意に低かった（補足図 6A）。また、2つのグループ間で属レベルでの細菌組成に有意な差があることもわかりました（P = 0.001;補足図6B）。両方のグループの微生物は主にバクテロイデス属とパラバクテロイデス属で構成されており（補足図6C）、鑑別分析によりバクテロイデス属、パラバクテロイデス属、エリシペラトクロストリジウム属、その他いくつかの属を含む24属が同定されました（補足図6D）。

PCoA 分析によって決定されたように、種レベルでは、2 つのグループ間の微生物叢構造に有意な差がありました (P = 0.001、図 4F)。微生物組成の結果は、D-FMT グループでは Bacteroides Eggerthii、B. plebeius、および B. thetaiotaomicron が優勢な種であり、H-FMT グループでは B. plebeius、B. thetaiotaomicron、および B. intestinalis が優勢な種であることを示しました。 (図4F)。 2 つのグループ間で大きく異なる合計 44 の細菌種が同定されました (図 4F)。また、2 つのグループ間で有意な差があった KO は 873 件ありました (補足表 2)。 D-FMT グループで上方制御された 10 個の KO を含む、13 個の KO が LPS 生合成経路で濃縮されました (図 4F および補足表 2)。

GFマウスと子豚の腸内微生物叢の類似性を評価しました（補足図7A）。私たちは、2 つのグループの腸内微生物が門レベルで完全に一致していることを発見しました。属レベルでの相同率は、健常群で82.71%、下痢群で80.67%に達した。種レベルでの相同性率は、健康なグループでは83.61%、下痢のグループでは63.67%に達しました。

糞便メタボロミクス分析も、レシピエントマウスの両グループに対して実行されました。 2 つのグループの代謝産物の全体的な分布と代謝産物の組成を補足図 7B、C に示します。これら 2 つのグループ間では代謝産物に有意な差がありました (図 4G)。データをさらに分析すると、2 つのグループ間で 17 の代謝産物が異なることが明らかになり、アルギニン、プロピオニルカルニチン、ピコリン酸、シトラコン酸のレベルは D-FMT グループで高く、2-ブテン酸、ペンタデカン酸、ラムノース、リブロース、キシルロースでした。、α-ヒドロキシイソ酪酸、グルタル酸、3-ヒドロキシフェニル酢酸、ホモバニリン酸、ヒドロキシフェニル乳酸、フェニル乳酸、3-(3-ヒドロキシフェニル)-3-ヒドロキシプロパン酸、および3,4-ジヒドロキシヒドロ桂皮酸は、H -FMT グループ (図 4G)。 KEGG分析により、アルギニンとプロリンの代謝、ペントースとグルクロン酸の相互変換、およびアミノアシルtRNA生合成が代謝産物が濃縮される経路であることが明らかになった（補足図7D）。

私たちは、健康な新生児子豚の糞便サンプルから L. reuteri と L. mucosae を分離し、下痢を起こしたレシピエント GF マウスの下痢性疾患症状に対するこれら 2 つの特定の乳酸菌の効果を調査しました (図 1C)。 GF マウスの体重を経時的に測定したところ、L. 粘膜を給餌した GF マウスは 5 日目から、下痢便微生物叢懸濁液の投与によって引き起こされる成長遅延が大幅に改善されたのに対し、L. ロイテリの介入は顕著な改善を示したことがわかりました。群はD-FMT群と有意差はなかった(図5A)。

A マウスの体重は実験期間中に測定されました。 B 実験マウスの回腸および結腸組織切片: 画像の最初の行は H&E 染色を示し、2 行目は PAS 染色を示し、3 行目は AB 染色を示します (スケールバー、50 μm)。 C 実験マウスの血液中の WBC、LYM、NEU、MON、LYM%、NEU%、MON% のレベル。 D 血清中の IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 E 回腸組織における IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 F 結腸組織における IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 G 回腸および結腸における ZO-1、オクルディン、AKT、および NF-κB タンパク質と p-AKT および p-NF-κB のレベル。 H ASV レベルでの主座標分析。門および属レベルでの GF マウスの糞便微生物叢の細菌組成の相対的な存在量。属レベルでの糞便微生物の鑑別分析のバブル図。 A ～ F および H の場合は n = 10。 G の場合は n = 3。データは平均値 ± SEM (A および C ～ F) として表され、一元配置分散分析を実行した後、LSD 検定を実行しました (A および C ～ F)。 *P < 0.05。

3 つのグループのマウスの結腸と回腸の組織学的観察 (図 5B) により、回腸の絨毛の長さ (P = 0.004)、中性ムチン (P = 0.028)、酸性ムチン (P = 0.003) が異なることがわかりました。 D-FMT グループと比較して、粘膜粘膜介入グループでは有意に上昇しました（補足図 4B）。さらに、結腸の組織病理学的スコアは有意に低かった（P = 0.002;補足図4B）。結腸の中性ムチン（P = 0.010）および酸性ムチン（P = 0.003）は、D-FMT グループと比較して、L. mucosae 介入グループで有意に高かった（補足図 4B）。ただし、L.ロイテリ介入グループの回腸および結腸をD-FMTグループの回腸および結腸と比較した場合、これらの指標の違いは統計的有意性のレベルに達しませんでした（補足図4B）。

血液生化学指数の結果では、粘膜粘膜介入群では、D-FMT 群と比較して WBC (P = 0.033)、LYM (P = 0.022)、LYM% (P = 0.046) が有意に低いことが示されましたが、NEU% ( P = 0.019)は、粘膜粘膜介入群の方が著しく高かった(図5C)。さらに、IL-1β (P = 0.002)、IL-6 (P = 0.007)、TNF-α (P = 0.050)、LPS (P = 0.003)、DAO (P = 0.002)、および d- L. 粘膜介入群の LA (P = 0.000) は、D-FMT 群よりも有意に低かった (図 5D)。また、IL-1β (P = 0.012)、IL-6 (P = 0.005)、IL-8 (P = 0.004)、LPS (P = 0.009)、DAO (P = 0.029)、および d L. 粘膜介入群の回腸における -LA (P = 0.011) は、D-FMT 群よりも有意に低かった (図 5E)。

結腸の場合、IL-8 (P = 0.000)、TNF-α (P = 0.017)、LPS (P = 0.036)、および D-LA (P = 0.007) の含有量は、粘膜粘膜介入の方が有意に低かった。 D-FMT グループよりもグループの方が優れています (図 5F)。また、回腸および結腸におけるZO-1およびオクルディンタンパク質の発現レベルが、L. mucosae介入群で有意に高いことも見出した（図5G）。 p-AKT および p-NF-κB のレベルは、L. 粘膜介入群で有意に低く (図 5G)、これらの値は L. ロイテリ介入群と D-FMT 群の間で有意な差はありませんでした (図 5G)。 .5G）。

また、L. mucosae介入後の腸内細菌叢の構造と組成の変化も分析しました（図5H）。 PCoA は、D-FMT 介入グループと L. mucosae 介入グループの間の細菌の特徴がアンプリコン配列変異体 (ASV) レベルで有意に異なっていないことを示しました。門レベルでは、Bacteroidota、Firmicutes、および Fusobacteriota が D-FMT および L. mucosae 介入グループのマウスの糞便中の主な細菌でした。属レベルでは、Bacteroides、Fusobacterium、および Bacteroidetes_vadinHA17 が、D-FMT マウスと L. mucosae 介入を受けたマウスの両方の糞便中の主な細菌でした。さらに、我々は、D-FMT グループと L. mucosae 介入グループの間で合計 8 つの識別可能な細菌属を同定しました。 D-FMT グループと比較して、L. mucosae 介入グループは 6 つの濃縮種と 2 つの枯渇種によって特徴づけられました。

また、ETEC K88によって誘発される下痢性疾患の症状に対するL. mucosaeの緩和効果も調査しました（図1D）。実験中にマウスの体重を測定したところ、L. mucosaeを与えられたマウスはETEC K88感染によって引き起こされる成長遅延が大幅に改善されたことがわかりました（図6A）。 3 つのマウスグループの結腸および回腸の組織学的観察 (図 6B) により、回腸の絨毛長 (P = 0.005) および絨毛と陰窩の長さの比 (P = 0.024) が、マウスの 3 つのグループで有意に増加していることがわかりました。 ETEC K88 + L. mucosae グループと ETEC K88 グループの比較 (図 6B)。さらに、結腸の組織病理学的スコアは介入群で有意に低かった（P = 0.000、図6B）。血清、回腸、および結腸の IL-1β (P = 0.004/0.025/0.021)、IL-6 (P = 0.022/0.001/0.015)、TNF-α (P = 0.002/0.010/0.016)、LPS ( ETEC K88 + L. mucosae グループの P = 0.018/0.001/0.000)、DAO (P = 0.003/0.000/0.004)、および D-LA (P = 0.003/0.000/0.019) は、ETEC のグループよりも有意に低かったK88 グループ (図 6C–E)。回腸および結腸における ZO-1 およびオクルディンタンパク質の発現レベルは、ETEC K88 グループよりも ETEC K88 + L. mucosae グループの方が有意に高かったのに対し、p-AKT および p-NF-κB のレベルは有意に高かった。下部（図6F）。

A マウスの体重は実験期間中に測定されました。 B 実験マウスの回腸および結腸組織切片における H&E 染色。絨毛長、陰窩長、回腸の絨毛と陰窩の長さの比、結腸の組織病理学的スコア (スケールバー、50 μm)。 C 血清中のIL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、およびD-LAのレベル。 D 回腸組織における IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 E 結腸組織における IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 F 回腸および結腸における ZO-1、オクルディン、AKT、および NF-κB タンパク質と p-AKT および p-NF-κB のレベル。 G ASV レベルでの主座標分析。門および属レベルでのマウスの糞便微生物叢の細菌組成の相対的な存在量。 ASV レベルでの糞便微生物鑑別分析のバブルダイアグラム。 A ～ E および G の場合は n = 6。 Fの場合はn = 3。データは平均値±SEM（A〜E）として表され、一元配置分散分析を実行した後、LSD検定を実行しました（A〜E）。 * P < 0.05。

また、L. mucosae介入後の腸内微生物叢の構造と組成の変化も分析しました（図6G）。 PCoA は、3 つのグループ間の細菌の特徴が ASV レベルで顕著に異なるわけではないことを示しました。門レベルでは、ETEC K88 マウスの糞便中の主な細菌はファーミクテス属、バクテロイドータ属、およびカンピロバクタータ属であり、ETEC K88 + L. mucosae マウスの糞便中の主な細菌はファーミクテス属、バクテロイドータ属、およびプロテオバクテリアでした。属レベルでは、Lactobacillus、Bacteroidetes_vadinHA17、および Alistipes が、ETEC K88 マウスと ETEC K88 + L. mucosae マウスの両方の糞便中の主な細菌でした。我々は、ASV レベルで ETEC K88 グループと ETEC K88 + L. mucosae グループの間で合計 2 つの識別可能な微生物を同定しました。 ETEC K88 グループと比較して、ETEC K88 + L. mucosae グループは 2 つの細菌が豊富であることが特徴でした。 L. mucosae介入の終了後、ETEC K88チャレンジ前の、コントロールおよびETEC K88 + L. mucosaeグループの腸内微生物叢の特徴を補足図8に示します。

我々は、ETEC K88によって引き起こされる下痢性疾患の症状に対するL. mucosae由来EVの緩和効果をさらに調査しました（図1E）。透過型電子顕微鏡法（TEM）を使用して、粘膜リステリア培養物中のEVの存在を確認した（図7A）。粘膜リステリアのEV（LmEV）もナノ粒子追跡分析（NTA）によって定量化されました（図7B）。生化学分析により、LmEVにはDNA、RNA、タンパク質が含まれており、タンパク質含有量はDNAまたはRNAよりも著しく高いことが明らかになりました（補足図9）。 MODE-K細胞またはIPEC-J2細胞と6時間共インキュベートした後、これらの細胞の細胞質でDiI標識LmEV（赤色シグナル）が見つかり、LmEVが腸上皮細胞によって内部移行されたことが示唆されました（補足図10）。実験中にマウスの体重を測定することにより、L. mucosae由来のEVを与えられたマウスがETEC K88感染によって引き起こされる成長遅延の大幅な改善を示したことが判明しました（図7C）。３つのマウス群の結腸および回腸を組織学的に観察したところ（図７Ｄ）、結腸の組織病理学的スコアは介入群で有意に低いことが判明した（Ｐ＝０．０００；図７Ｄ）。さらに、血清、回腸、および結腸の IL-1β (P = 0.000/0.001/0.000)、IL-6 (P = 0.001/0.025/0.000)、TNF-α (P = 0.000/0.011/0.004) のレベル、ETEC K88 + LmEV グループの LPS (P = 0.001/0.014/0.000)、DAO (P = 0.000/0.006/0.003)、および d-LA (P = 0.000/0.001/0.000) は、ETEC K88 + LmEV グループのグループよりも有意に低かった。 ETEC K88 グループ (図 7E–G)。また、回腸および結腸における Arg1、ZO-1、およびオクルディンタンパク質の発現レベルは、ETEC K88 グループよりも ETEC K88 + LmEVs グループで有意に高かったのに対し、iNOS の発現および p のレベルは低下したこともわかりました。 -AKTおよびp-NF-κBタンパク質は有意に低かった(図7H)。

分離された EV の TEM (スケールバー、200 または 100 nm)。 B NTA が分析した EV のサイズ分布。 C 実験期間中のマウスの体重。 D 実験マウスの回腸および結腸組織切片の H&E 染色。回腸の絨毛長、陰窩長、絨毛と陰窩の長さの比、および結腸の組織病理学的スコアの測定 (スケールバー、50 μm)。 Eは血清、Fは回腸組織、Gは結腸組織におけるIL-1β、IL-6、TNF-α、LPS、DAO、およびD-LAのレベル。 H 回腸および結腸における iNOS、Arg1、ZO-1、オクルディン、AKT、および NF-κB タンパク質の発現と p-AKT および p-NF-κB のレベル。 I ASV レベルでの主座標分析。門および属レベルでのマウスの糞便微生物叢の細菌組成の相対的な存在量。 ASV レベルでの糞便微生物鑑別分析のバブルダイアグラム。 A と B の場合は n = 3。 C、E ～ G、および I の場合は n = 6。 Dの場合はn = 5/6。 H の場合は n = 3。データは平均値 ± SEM (C-G) として表され、一元配置分散分析を実行し、続いて LSD 検定を実行しました (C-G)。 *P < 0.05。

また、LmEV介入後の腸内微生物叢の構造と組成の変化も分析しました（図7I）。 PCoA は、3 つのグループ間の細菌の特徴が ASV レベルで著しく異なることを示しました。門レベルでは、Bacteroidota、Firmicutes、および Campilobacterota が、ETEC K88 および ETEC K88 + LmEV グループのマウスの糞便中の主な細菌でした。属レベルでは、Muribaculaceae、Alistipes、および Lactobacillus が ETEC K88 グループの糞便中の主な細菌であったのに対し、ETEC K88 + LmEVs マウスの糞便中の主な細菌は Muribaculaceae、Lactobacillus、および Alistipes でした。さらに、ASV レベルで ETEC K88 グループと ETEC K88 + LmEV グループを区別できる合計 27 個の細菌を同定しました。 ETEC K88 グループと比較して、ETEC K88 + LmEV グループは 13 の濃縮細菌と 14 の枯渇細菌によって特徴づけられました。

LmEVによるETEC K88攻撃誘発性下痢性疾患症状の緩和におけるマクロファージの役割を解明するために、マクロファージ排除実験を実施しました（図1F）。 ETEC K88を投与したマクロファージ除去マウス（ETEC K88-Eグループ）とLmEVを与えたETEC K88-Eマウス（ETEC K88 + LmEVs-Eグループ）との間の体重変化に差異は見られなかった（図8A）。 ETEC K88 + LmEVs-E グループと ETEC K88-E グループの間で、空腸絨毛の長さ、陰窩長、絨毛と陰窩の長さの比、または結腸の組織病理学スコアに有意差はありませんでした (図 8B)。また、ETEC K88 + LmEVs-E グループと ETEC K88-E グループの間で、IL-1β、IL-6、TNF-α、LPS、DAO、および d-LA の血清、回腸、および結腸レベルに明らかな差はありませんでした (図 8C–E)。

A 実験期間中のマウスの体重。 B 実験マウスの回腸および結腸組織切片の H&E 染色。回腸の絨毛長、陰窩長、および絨毛と陰窩の長さの比の測定、および結腸の組織病理学的スコア（スケールバー、50μm）。 C 血清、D 回腸組織、および E 結腸組織における IL-1β、IL-6、TNF-α、LPS、DAO、および D-LA のレベル。 F ASV レベルでの主座標分析。門および属レベルでのマウスの糞便微生物叢の細菌組成の相対的な存在量。 ASV レベルでの糞便微生物鑑別分析のバブルダイアグラム。 A ～ F では n = 6。データは平均値 ± SEM (A ～ E) として表され、一元配置分散分析を実行した後、LSD 検定を実行しました (A ～ E)。 *P < 0.05。

LmEV介入後の腸内微生物叢の構造および組成の変化を図8Fに示す。 PCoA は、3 つのグループ間の細菌の特徴が ASV レベルで顕著に異なるわけではないことを示しました。門レベルでは、ファーミクテス属、バクテロイドータ属、およびプロテオバクテリアが、ETEC K88-E マウスおよび ETEC K88 + LmEV-E マウスの糞便中の主な細菌でした。属レベルでは、ETEC K88-E マウスの糞便ではラクトバチルス属、ムリバキュラ科、およびアシネトバクター属が最も優勢な属であり、ETEC K88 + LmEV-E マウスの糞便ではラクトバチルス属、ムリバキュラ科、およびアリスティペスが最も優勢な属でした。さらに、ASV レベルで ETEC K88-E グループと ETEC K88 + LmEVs-E グループの間で合計 8 つの識別微生物を同定しました。 ETEC K88-E グループと比較して、ETEC K88 + LmEVs-E グループは 4 つの濃縮細菌と 4 つの枯渇細菌によって特徴づけられました。

下痢性疾患は人間と家畜にとって世界的な健康問題です38。下痢は数百万人の患者に発生すると推定されており、下痢性疾患により毎年世界中で数十億ドルの医療費が発生しています39。下痢は、腸内微生物叢の異常によって部分的に引き起こされると仮説が立てられており、腸内細菌叢の異常は、宿主疾患の表現型と組織や器官の生理学的機能との間の関連性として機能します24。したがって、新しい予防および治療戦略を開発するには、特に腸内細菌叢の観点から、下痢性疾患の根底にあるメカニズムを解明することが不可欠です。今回、我々はまず、これらの異なる条件下での新生児の腸内マイクロバイオームの特徴を体系的に明らかにするために、健康な下痢症の新生児子豚をモデルとして使用し、健康な個体と下痢症の個体を区別する特定の潜在的なプロバイオティクス株を同定した。次に、下痢性新生児の腸内細菌叢の乱れが腸損傷や成長遅延を引き起こす分子機構を解明するために、健康な下痢性新生児子豚の糞便微生物叢をGFマウスに移植しました。さらに、健康な人から分離された特定のプロバイオティクス成分を使用した介入試験を実施し、下痢性疾患の症状に対する優れた緩和効果を実証しました。最後に、我々は、プロバイオティクス由来のEVがマクロファージの表現型を調節して、下痢性疾患の症状に対抗することを実証した。

トランスレーショナルモデルとして生まれたばかりの子豚を使用することにより、健康な個体と下痢をしている個体の腸内細菌叢の特徴を解明することができました。私たちのメタゲノム解析の結果、下痢を患っている新生児子豚は実際に腸内細菌叢の障害を患っていることが示されました。この障害は、健康な人とは異なる腸内細菌叢の構造を特徴としています。乳酸菌属現在、腸内微生物叢の恒常性維持に重要な役割を果たすプロバイオティクスとして認識されています40。私たちのデータにより、Lactobacillus spp. 健康な新生児と下痢をしている新生児の両方の腸内に相対的に最も豊富に存在しますが、そのラクトバチルス属菌は、そして、いくつかの特定のラクトバチルス種は、下痢をしている新生児の腸内で著しく欠乏しています。さらに、ランダムフォレストモデルを使用して、健康な新生児と下痢性新生児を区別する重要な微生物としてL.ロイテリとL.ムコサエを同定しました。大腸菌は下痢性疾患の原因となる主要な腸内病原体であり、5 歳未満の子供は大腸菌感染症にかかりやすい41。私たちの研究では、下痢を起こした新生児子豚の糞便中にエシェリヒア属が 2 番目に多く含まれていた属でした。さらに、統計的な差異は存在しませんでしたが、下痢をしている子豚の糞便中の大腸菌の相対量は、健康な子豚の 2 倍でした。 LPS は、下痢を引き起こす大腸菌によって産生される古典的な病原性因子であり 42,43 、我々の KEGG 機能分析により、健康な新生子豚よりも下痢をしている新生子豚の方が LPS 生合成が有意に高いことが明らかになりました。フソバクテリアはグラム陰性菌の小さなグループであり、そのうちフソバクテリウムは人間や動物の消化管で一般的に見られます。フソバクテリウムの主な代表的な種はフソバクテリウムヌクレアタムであり、腸の炎症や結腸直腸癌と強く関連していることが示されています 44,45。私たちの研究では、下痢を起こした新生児子豚のフソバクテリウムのレベルが著しく高かったことから、フソバクテリウムが大腸菌誘発性の下痢に苦しむ子豚の腸炎症の中間メディエーターである可能性があることが示唆されました。私たちの研究は、下痢の病因ではなく、乳酸菌が下痢性疾患を軽減する潜在的なメカニズムを解明することに重点を置いているため、病原菌の研究は将来の研究に委ねられています。今回の結果は、大腸菌攻撃とLPS過剰産生が新生児下痢の重要な危険因子である一方、ラクトバチルス属の欠如により新生児腸内細菌叢の病原菌侵入に対する抵抗力が著しく弱まることが示唆された。

FMT は、複雑な疾患の治療法としての可能性に加えて、腸内微生物と宿主疾患の表現型および組織や器官の生理学的機能との間の固有の関係を明らかにするのにも役立ちました 46,47,48。私たちの研究では、下痢をしている子豚の糞便微生物叢を GF マウスに移植すると、重度の全身性炎症反応を伴う重大な成長遅延が誘発されました。生まれたばかりの子豚の結果と一致して、健康な子豚の微生物サンプルと下痢性子豚の微生物サンプルを投与された GF マウスの間では、腸内細菌叢の構造に大きな違いがありました。レシピエントマウスの腸内細菌叢の大部分はドナーブタに由来していましたが、マウスの腸内細菌叢の種組成は根本的に変化しており、これは多くの FMT 研究に共通する現象です 49,50。バクテロイデスは腸内細菌叢と宿主の相互作用において重要な役割を果たしており、以前の研究ではバクテロイデスが炎症誘発性サイトカインの産生を調節できることが示されています51,52。私たちのデータは、両グループのマウスの腸内細菌叢ではバクテロイデスが優勢であり、下痢を起こしているレシピエントマウスの糞便中のバクテロイデスの相対量が健康なレシピエントマウスよりも有意に高いことを示しました。注目すべきことに、LPS生合成など、腸内細菌叢に関連するいくつかの機能経路がドナーブタからレシピエントマウスに伝達された。一貫して、我々の結果は、LPSの血清濃度が、健康なレシピエントマウスよりも下痢をしているレシピエントマウスにおいて有意に高いことを示した。糞便の代謝物は腸内細菌叢の機能的な情報であると考えられており 53、我々の研究ではレシピエントマウスの 2 つのグループの糞便の代謝物間にも有意な差がありました。差次的代謝産物の同定の結果、抗炎症能を有する一部の代謝産物（3,4-ジヒドロキシヒドロ桂皮酸54、ホモバニリン酸55、およびフェニル乳酸56）は健康なレシピエントマウスで著しく濃縮されているのに対し、炎症促進性代謝産物（ピコリン酸57）は増加していることが示されました。下痢レシピエントマウスに豊富に含まれていました。これらのデータは、下痢性新生児における腸内微生物叢とその代謝物の乱れが、下痢性疾患に続発する成長遅延と炎症反応の原因であることを示唆しています。

下痢性疾患は、高い乳児死亡率につながるだけでなく、腸形成異常の重要な要因でもあります58,59。腸形成異常は主に、腸粘膜免疫系の発達不全と腸バリア機能の障害として現れ、これにより腸の透過性と細菌の移動が増加し、全身性の炎症反応を引き起こし、最終的には新生児の成長遅延につながります60。この研究では、下痢をしている子豚の腸内微生物叢の乱れが、主にすべての腸部分組織（十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および結腸）の遺伝子発現プロファイルの劇的な変化という形で、レシピエントGFマウスの腸の発達に重大な影響を引き起こしました。）。 KEGG 濃縮分析により、腸の 5 つのセグメントにおける差次的遺伝子が、主に NF-κB や PI3K-AKT シグナル伝達経路などの炎症性および免疫関連シグナル伝達経路にマッピングされていることが明らかになりました。 NF-κB と AKT は炎症反応を媒介する重要なタンパク質分子であり、リン酸化されて生物学的機能を活性化します 61,62。我々の結果は、下痢を起こしたレシピエントマウスの腸内ではNF-κBとAKTのリン酸化が両方とも上昇しており、腸組織内の炎症誘発性サイトカインのレベルも同様に上昇していることを示した。免疫不全と炎症反応は、腸のバリア機能を損ない、腸の形態と構造を破壊し、腸の透過性を増加させるため、LPS などの有害物質が腸内腔から血液循環に浸潤します 63,64。一貫して、下痢をしている子豚からの糞便微生物叢の移植は、レシピエントマウスの腸の密着結合タンパク質と腸の形態を著しく悪化させた。これらの発見は、下痢性新生児の腸内細菌叢の乱れが、炎症性シグナル伝達経路の活性化を通じて腸内で局所的な炎症反応を誘発し、それが腸の発達の欠陥につながることを示しています。

臨床現場では、FMT は胃腸障害を治療する試みに広く使用されており、ある程度の有効性が示されています 65,66。以前の研究では、FMT がプロバイオティクスの相対量を増加させることで疾患の重症度を軽減することが判明しました 67。上で述べたように、我々は、健康な新生児と下痢性新生児を区別する重要な腸内微生物として、L.ロイテリとL.ムコサエを同定した。それらの補充が、下痢による腸内細菌叢による成長遅延と腸の損傷を救済できるかどうかを検証するために、さらにプロバイオティクス介入実験を実施しました。以前の研究では、L.ロイテリとL.粘膜が抗炎症能力を持っていることが示されています68,69。したがって、我々のデータは、L. ロイテリではなく、L. 粘膜が、LPS 合成と NF-κB および AKT のリン酸化を阻害することにより、炎症反応と腸の損傷を効果的に抑制し、下痢によって引き起こされる腸内細菌叢によって引き起こされる成長遅延を効果的に軽減することを示しました。 ETEC K88感染。プロバイオティクスは通常、病原菌を直接殺すか、腸内微生物叢を改造して病原菌による定着に対する抵抗力を高めることによって宿主の健康を保護します18、24、70。私たちの研究では、L. mucosaeの介入により、糞便中のLactobacillus spp.の存在量が大幅に増加しました。マウスで。これらのデータは、健康な人の粘膜リステリアが腸内細菌叢を調節することによって下痢や腸損傷に対する抵抗力において重要な役割を果たしているということを示唆しています。しかし、L. mucosaeが宿主の腸の恒常性を調節して下痢性疾患を軽減するメカニズムはさらに解明される必要がある。

宿主の生理学的機能の微生物による調節は、宿主との直接的な相互作用に加えて、微生物叢によって分泌される活性メディエーターによって媒介され得る 71,72。さまざまな細菌由来のメディエーターの中でも、EV は細胞間のクロストークとシグナル伝達において重要な役割を果たすことが示されています 73。 EV分泌を介したプロバイオティクスと宿主細胞間のコミュニケーションは、科学界の注目を集めています。最近の研究では、一部のプロバイオティクス由来の EV が親細菌と同様の役割を果たすことが示されています 74,75。この研究では、L. mucosae 由来の EV の分離と同定に成功しました。さらに、本発明者らは、LmEVが下痢性疾患の症状の緩和においてL. mucosaeよりも優れた有効性を発揮することも実証した。最近の研究では、L ロイテリ DSM 17938 由来の EV だけで、腸の運動性に対する親細菌の影響を完全に再現できることが示されました 76。さらに、ロイテリ菌 DSM 17938 および BG-R46 由来の EV は、腸上皮細胞に取り込まれると腸のバリア機能を強化し、それによって ETEC によって引き起こされる漏出を減少させるという証拠があります 77。 L ロイテリ BBC3 からの EV はマクロファージによって取り込まれて免疫応答を調節することもあります 78。しかし、私たちのデータは、L ロイテリが下痢性疾患の症状を軽減できないことを明らかにしたため、L ロイテリ由来の EV を用いた追跡実験は実施しませんでした。私たちの研究で使用されたロイテリ菌は、健康な生まれたばかりの子豚の糞便から分離されたもので、上記の報告で使用されたモデル株とは異なり、株間のばらつきが異なる結果の重要な理由である可能性があります。以前の研究では、ロイテリ菌DSM 17938またはそのEVは、急性下痢の期間と急性胃腸炎による入院期間を短縮できることが示されているが、院内下痢や抗生物質関連下痢は予防できないようであり79、同じ株の有益な効果さえも示されていないことが示されている。病理学的状態が異なると異なる場合があります。

マクロファージは、炎症反応を開始および制御するコア細胞として、さまざまなサイトカインを産生し、腸上皮細胞の増殖を促進し、上皮バリアの完全性を調節し、腸の恒常性の維持に重要な役割を果たすことができます80,81。炎症性刺激および細胞環境からの収束シグナルに応じて、マクロファージ活性化のさまざまな段階は、炎症促進性 M1 および抗炎症性 M2 の二極化として広く説明されています 82,83。最近の研究では、マクロファージ表現型に対する NF-κB および AKT シグナル伝達経路の調節効果が示されています 84,85。私たちのデータは、EV介入がM2マクロファージの極性化を活性化し、M1型マクロファージの極性化を阻害し、さらに炎症調節タンパク質（NF-κBおよびAKT）の発現を抑制することを示した。注目すべきことに、EVはマクロファージ除去マウスモデルにおいて下痢性疾患の症状を軽減する能力を失っていた。これらの発見は、LmEV がマクロファージ依存的に炎症反応を調節することによって下痢と闘うことを示しました。

結論として、下痢をしている子豚の腸内微生物叢の障害は、微生物叢の構造の変化、乳酸菌の欠如、大腸菌の過剰増殖、および LPS 生合成によって特徴づけられました。 L. ムコサエと L. ロイテリは、健康な子豚と下痢をしている子豚を区別する潜在的な重要な微生物でした。下痢によって引き起こされる腸内微生物叢は、成長遅延、炎症反応、腸損傷などの下痢性疾患表現型を GF マウスに伝えることに成功しました。機構的には、下痢性新生児の腸内細菌叢の乱れは、LPSを介した炎症促進性シグナル伝達経路を活性化し、その結果、腸の形態構造が破壊され、腸のバリア機能が弱まり、腸の透過性が増加しました。腸内腔から血液循環への過剰な LPS の移行は、全身性の炎症反応を誘発し、最終的には成長遅延につながります。健康な生まれたばかりの子豚の糞便から分離された L. mucosae は、炎症反応と腸の損傷を軽減することにより、優れた下痢止め効果を発揮しました。 L. 粘膜由来の EV は、M2 マクロファージを活性化し、M1 マクロファージを阻害することによって腸の恒常性を調節し、それによって下痢性疾患の症状を軽減します。全体として、L. mucosae は、EV の放出を通じてマクロファージの活性を調節することにより、腸内細菌によって引き起こされる病気を改善しました。私たちの研究の主な結果を図 9 に要約します。これらの結果は、新生児の下痢リスクを予防するための潜在的な戦略を提供します。

本研究の結果をまとめた模式図。

生まれたばかりの健康な子豚の糞便サンプルが、乳酸菌の分離のためにランダムに選択されました。凍結した糞便のサンプル (200 mg) を滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) バッファーに懸濁し、ピペッティングによって完全に破砕して細菌懸濁液を作成しました。この懸濁液を滅菌 PBS で 10 倍勾配で希釈し、等量 (100 μL) の各希釈液を de Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) 寒天培地上に広げ、嫌気的に 37 °C で 24 時間インキュベートしました。異なる希釈で作製したプレートから接種ループを使用して、異なる形態の単一コロニーを選択し、新しい MRS 寒天培地にスクライビングすることによって細菌を精製し、プレートを嫌気的に 37 °C で 24 時間インキュベートしました。 4 回の精製サイクル後、単一コロニーを MRS 寒天プレートから 500 μL の MRS ブロスに移し、液体を嫌気条件下で 15 mL の MRS ブロスに移し、37 °C で 24 時間インキュベートしました。 MRS ブロスが濁っている場合、細菌ブロスの一部から DNA を抽出しました。ユニバーサルプライマー 27 F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') および 1492 R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') を使用して単一株の 16S rRNA 遺伝子を増幅し、PCR 産物をサンガー法によって配列決定しました。細菌溶液の別の部分を等量の 50% 滅菌グリセロールと混合し、-80 °C で保存しました。 16S rRNA 遺伝子配列を使用して NCBI ヌクレオチド配列データベースをスキャンし、L. ロイテリおよび L. ムコサエの菌株を同定しました。

EV は L. mucosae 細菌の培養上清から単離されました 78,86。簡単に説明すると、増殖の対数段階にある細菌培養物を 8000 × g で 30 分間遠心分離しました。上清を回収し、再度 20,000 × g で 45 分間遠心分離しました。次に、この上清を 0.22 μm フィルター (Millipore) に通し、ろ液を SW 32 Ti ローター (Beckman Coulter、米国カリフォルニア州フラートン) で 120,000 × g、4 °C で 2 時間遠心分離しました。上清を廃棄し、沈降物を PBS に再懸濁し、懸濁液を濾過し、120,000 × g で 2 時間、4 °C で再遠心分離しました。遠心分離後、沈殿物をPBSに収集した。 EV の存在は TEM で確認され、EV の粒子径の範囲は NTA によって決定されました。

LmEV のタンパク質含有量は、Solarbio BCA タンパク質アッセイキット (Solarbio、#PC0020) を製造業者の指示に従って使用して測定しました。 LmEV 内の DNA および RNA は、Qubit™ dsDNA HS アッセイキット (YEASEN、#12640ES60) および Qubit™ RNA HS アッセイキット (Invitrogen、#Q32852) を製造者の指示に従ってそれぞれ使用して定量しました。タンパク質、DNA、RNA の内容は、1 × 109 個の小胞粒子を使用して正規化されました。以下の実験で使用した LmEV の量はタンパク質含有量に基づいていました。

MODE-K 細胞と IPEC-J2 細胞は、10% ウシ胎児血清、100 U/mL ペニシリン、および 100 μg/mL ストレプトマイシンを添加した DMEM 中で、5% CO2 雰囲気下、37 °C で培養されました。細胞培養培地をハンクス平衡塩類溶液に交換し、15 分間インキュベートした後、DiI (Sigma、#42364) 標識 LmEV (10 μg/mL) を添加し、細胞を 6 時間インキュベートしました。 DiI 陽性細胞を蛍光顕微鏡を使用して分析しました。

すべての動物実験およびサンプル収集手順は、中国湖北省華中農業大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。この研究では、すべての実験方法は、華中農業大学の実験動物の管理と使用に関するガイド (承認番号 HZAUMO-2022-0005) に従って実行されました。

この研究で使用した新生子豚は、Guangxi Yangxiang Co., Ltd. から入手しました。出産後、30 頭の同腹子豚が選択され、各同腹子から 1 頭の下痢の子豚と 1 頭の健康な子豚が選択されました。少なくとも 2 日間連続して液体および水様の糞便をした子豚は下痢のある子豚として分類され、一方、下痢や他の病気を示さない子豚は健康な子豚として分類されました 87。糞便サンプルは、生後 8 日から 11 日の範囲の新生子豚 (下痢のある子豚 30 匹と健康な子豚 30 匹) から収集されました (補足表 3)。選択されたすべての子豚には、サンプル収集前に抗生物質、プロバイオティクス、またはプレバイオティクスが投与されませんでした。採取した便サンプルを 2 つの部分に分けました。1 つは液体窒素中で即座に急速凍結し、もう 1 つは滅菌グリセロール PBS 溶液 (15% グリセロール) に混合し、液体窒素中で凍結しました。すべてのサンプルは -80 °C で保存されました。

FMT 溶液を調製するために、下痢状態の子豚または健康な子豚の糞便サンプルを嫌気条件下で処理しました。プールした糞便サンプルを 100 xg で 2 分間遠心分離し、上清を 70 μm フィルターで濾過しました 88。

20 匹の GF マウス (昆明、生後 4 週間) を無菌隔離環境で飼育しました。飼料と水は自由に摂取させた。マウスをランダムに H-FMT (n = 10) グループまたは D-FMT (n = 10) グループに分けました。 H-FMT 群には健康な子豚からの糞便微生物叢懸濁液 200 μL を 1 日 1 回午前中に強制経口投与し、D-FMT 群には等量の下痢性子豚からの糞便微生物叢懸濁液を投与しました。２週間目は動物を通常通りに飼育した。処置されたマウスの体重は、実験期間全体を通じて毎朝測定された。実験期間の終わりに糞便サンプルを収集し、新たに収集した糞便をすぐに液体窒素に浸し、-80 °C で保存しました。すべてのマウスは頚椎脱臼により屠殺された。十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および結腸からの組織学的サンプルを PBS ですすぎ、腸内容物を除去し、4% パラホルムアルデヒドで固定しました。十二指腸、空腸、回腸、盲腸、および結腸組織の残りを収集し、-80 °C で保存しました。静脈血を目頭から採取した。合計2種類の血液サンプルを採取しました。サンプルの 1 つは全血で、血液学的パラメータの検査のために 0.5 mL EDTA 抗凝固チューブに収集されました。 2 番目の血液サンプルを室温で約 30 分間放置し、その後 1000 × g で 10 分間遠心分離しました。

30 匹の GF マウス (昆明、4 週齢) を 3 つのグループに分けました:D-FMT グループ (n = 10)、D-FMT + L. ロイテリグループ (n = 10)、D-FMT + L . 粘膜グループ (n = 10)。飼料と水は自由に与えた。 D-FMT群には、最初の週は毎日下痢性子豚由来の糞便微生物叢懸濁液100μLおよびPBS 100μLを強制経口投与し、その後、第2週は毎日200μLのPBSを強制経口投与した。 D-FMT + L. ロイテリ群および D-FMT + L. 粘膜群には、下痢性子豚の糞便微生物叢懸濁液 100 μL および L. ロイテリまたは L. 粘膜細菌懸濁液 100 μL (1010 CFU/mL) を強制経口投与しました。）、最初の週は毎日、2週目は毎日200μLのPBSをそれぞれ投与しました。すべてのマウスの体重を毎朝測定した。サンプル採取手順は、第 2 回動物実験で使用した手順と同じでした。

合計 18 匹の SPF マウス (BALB/c、4 週齢) をこの実験に使用しました。マウスをランダムに 3 つのグループに分けました。(1) CON グループ (n = 6)。 (2) ETEC K88 グループ (n = 6); (3) ETEC K88 + L. 粘膜グループ (n = 6)。 ETEC K88 系統 (血清型 O149:K91、K88ac) のマウスは、中国農業大学 (中国、北京) の Wang 教授のご厚意により提供されました。実験の最初の 3 週間にわたって、CON および ETEC K88 グループのマウスには 1 日あたり 200 μL の PBS を強制経口投与し、ETEC K88 + L. mucosae グループには 200 μL の L. mucosae 懸濁液（1010 CFU/ mL）/日。続いて、CON 群には 200 μL の PBS を腹腔内注射し、ETEC K88 および ETEC K88 + L. mucosae 群には 200 μL の ETEC K88 (2 × 108 CFU/mL) を腹腔内注射し、5 日間サンプルを採取しました。後で。すべてのマウスの体重を毎朝測定した。サンプル採取手順は、第 2 回動物実験で使用した手順と同じでした。

合計 18 匹の SPF マウス (BALB/c、4 週齢) をこの実験に使用しました。マウスをランダムに 3 つのグループに分けました。(1) CON グループ (n = 6)。 (2) ETEC K88 グループ (n = 6); (3) ETEC K88 + LmEV グループ (n = 6)。 CON グループのマウスには 200 μL の PBS を腹腔内注射し、ETEC K88 および ETEC K88 + LmEVs グループのマウスには 200 μL の ETEC K88 (2 × 108 CFU/mL) を腹腔内注射しました。次の連続 5 日間にわたって、CON および ETEC K88 グループのマウスには毎日 200 μL の PBS を経口投与し、ETEC K88 + LmEV グループのマウスには 200 μL の PBS 中の 50 μg の LmEV を毎日経口投与しました。 LmEV の治療用量は、我々の以前の研究に従って使用されました 89。すべてのマウスの体重を毎朝記録した。サンプル採取手順は、第 2 回動物実験で使用した手順と同じでした。

マクロファージの除去は、参考文献に以前に記載されているように、実験前の３日間毎日クロドロネートリポソーム（２００μＬ／マウス）を腹腔内注射することによって実行され、その後、この実験中は３日ごとに実行された。 90. 他のすべての実験手順とサンプル収集は、5 回目の動物実験と一致していました。この実験も 3 つのグループに分けられました。(1) CON-E グループ (n = 6)。 (2) ETEC K88-E グループ (n = 6)。 (3) ETEC K88 + LmEVs-E グループ (n = 6)。

糞便サンプルの全ゲノム DNA は、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen、テュービンゲン、ドイツ) を使用して抽出されました。 DNA の濃度と品質は、Qubit 2.0 蛍光光度計 (Life Technologies、カリフォルニア州、米国) で測定されました。高品質の DNA (1 μg) をライブラリ構築の入力材料として使用しました。シーケンシングライブラリーは、NEBNext® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB、USA) を使用して生成しました。 Illumina HiSeq プラットフォームを使用してライブラリーの配列を決定し、ペアエンドリードを生成しました。

生のシーケンスデータからアダプター、低品質のリード、および宿主ゲノム DNA の混入をフィルタリングすることにより、下流解析用に高品質のリードが得られました。 MetaPhlAn3 (バージョン 3.0.7)91 を使用して分類のアノテーションが実行され、それらの相対存在量が計算された後、線形判別分析効果サイズ (LEfSe) 法の助けを借りて、下痢の子豚と健康な子豚の間の種の違いが計算されました。線形判別分析 (LDA) スコア ≥2 および P < 0.05 のスクリーニング基準。 R パッケージ vegan (バージョン 2.5-7) および ade4 (バージョン 1.7-18) を使用して、アルファ多様性を計算し、PCoA 分析を実行しました。 2 つのグループ間のアルファ多様性の差は、Wilcox.test を使用して計算されました。 PCoA の有意性は、9999 個の順列に基づく順列多変量分散分析 (PERMANOVA) を使用して計算されました。平均相対存在量が 0.1% 未満の種は除外され、残りの種は、R パッケージ forcats (バージョン 0.5.1)、random Forest (バージョン 4.7-1)、およびスプラインを使用したランダムフォレスト分類モデルの入力特徴として使用されました。 (バージョン 4.1.2)。種の重要性は、モデル精度の平均低下によってランク付けされました。上位 20 種がランダムフォレストモデルの変数として選択され、それらの曲線下面積 (AUC) 値が R パッケージ ROCR (バージョン 1.0-11) を使用して計算され、モデルの精度が評価されました。さらに、機能アノテーションを実行するために humann3 (バージョン 3.0.0) が使用されました。有意差KOはWilcox.testによって計算された。有意差のある KO (p_adj <0.01) は、R パッケージ MicrobiomeProfiler (バージョン 1.1.3) を使用して KEGG 経路に対して濃縮されました。

16 S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域をユニバーサルプライマーを使用して増幅し、増幅産物を等モル量にプールし、Illumina MiSeq プラットフォームで配列決定して 300 bp のペアエンドリードを生成しました。バーコードのない生の読み取りは、低品質の読み取りをフィルタリングすることによる品質管理の対象となりました。結果として得られた高品質の読み取りは、入力として QIIME2 にインポートされました。簡単に説明すると、高品質の配列は最初に DADA2 アルゴリズムを使用してノイズ除去され、SILVA 132 データベースを使用して分類分類が行われました。データ分析は、Majorbio Cloud Platform (www.majorbio.com) の無料オンラインプラットフォームで実行されました。微生物の結果は、偽発見率 (FDR) 分析によって調整されました (q < 0.05)。統計的有意性は P < 0.05 で考慮されました。

Trizol 試薬 (Invitrogen) を使用して全 RNA を抽出しました。得られた RNA を NanoDrop ND-1000 分光光度計 (Thermo, USA) を使用して測定しました。トランスクリプトームライブラリーの調製と配列決定が続きました92。生のペアエンドリードは、SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) および Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) によってデフォルトのパラメーターを使用して品質管理され、トリミングされました。得られたクリーンリードを、TopHat (バージョン 2.0.0) によってマウスの参照ゲノム (http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Info/Index) と比較して、遺伝子存在量ファイルを取得しました。 2 つのグループ間で差次的に発現された遺伝子を取得するために、スクリーニング閾値 |log2FoldChange| を使用して R パッケージ DESeq2 によって差次的発現解析を実行しました。 ≥ 1 およびパッド調整 < 0.05。その後、有意に濃縮された経路をスクリーニングするために、ボンフェローニ補正 P 値 ≤ 0.05 で差次的に発現された遺伝子に対して KEGG 濃縮分析が実行されました。 KEGG 経路解析は KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do) によって実施されました。

我々は、Metabo-Profile (上海、中国) によってメタボロミクスの検出と分析を実行し、次に Metabo-Profile Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd93 を使用してすべての標的代謝物を定量しました。

H&E、PAS、AB 染色アッセイを実施しました 94,95。簡単に説明すると、4% ホルムアルデヒドで固定した腸組織をパラフィンに包埋し、切片 (厚さ 5 mm) を取得し、H&E、PAS、または AB で染色しました。 CaseViewer ソフトウェア (バージョン 220 2.2) を使用して、絨毛の高さ、陰窩の深さ、杯細胞と糖タンパク質の数を測定し、組織病理学のスコアを評価しました。

マウスの血清、回腸、および結腸組織中の IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、LPS、D-LA、および DAO 含有量を、以下の酵素結合免疫吸着測定法 (ELISA) キットを使用して測定しました。メーカーの説明書を参照してください (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co. Ltd、上海、中国)。

RIPA タンパク質溶解液 (Roche、ドイツ、ペンツベルグ) と BCA タンパク質アッセイキット (Pierce、米国イリノイ州ロックフォード) をそれぞれ腸組織からタンパク質を抽出して定量するために使用しました。 SDS-PAGEゲル電気泳動によって分離されたタンパク質をニトロセルロース膜(Bio Trace、Pall Co、USA)に転写した。次に、ニトロセルロース膜をブロッキングバッファーに 2 時間浸漬し、対応する一次抗体とともに一晩インキュベートしました。膜をTweenを含むトリス緩衝生理食塩水(TBST)で洗浄し、次いで二次抗体希釈液に2時間浸漬した。最後に、タンパク質発現を記録し、Imaging System (Bio-Rad, USA) および Quantity One ソフトウェア (Bio-Rad, USA) をそれぞれ使用して分析しました。ウェスタンブロットアッセイで使用した以下の抗体は次のように示されました:西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 結合二次抗体 (Santa Cruz Biotechnology、ヤギ抗ウサギ (sc-2004; 1:10,000)、ヤギ抗マウス (sc-2005) ; 1:10,000))、ZO-1 抗体 (Abcam、ab221547; 1:1000)、Occludin 抗体 (Abcam、ab216327; 1:1000)、ホスホ AKT 抗体 (Abcam、ab8933; 1:1000)、AKT 抗体 (アブカム、ab8805; 1:1000)、ホスホ-NF-κB 抗体 (アブカム、ab239882; 1:1000)、NF-κB 抗体 (アブカム、ab207297; 1:1000)、iNOS 抗体 (アブカム、ab178945; 1:1000) 、Arg1 抗体 (Abcam、ab92274; 1:1000)、β-アクチン抗体 (Sigma-Aldrich、A5441; 1:1000)。すべてのブロットまたはゲルは同じ実験から得られ、並行して処理されました。オリジナルのブロットは補足情報に記載されています。

統計的有意性は、一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して評価され、その後、一対比較のための事後 LSD テストが行われました (Windows 用 SPSS バージョン 20.0、SPSS Inc.、米国イリノイ州シカゴ)。すべての結果は平均値±SEMとして表されました。 P < 0.05の場合、差異は統計的に有意であるとみなされました。統計に使用される反復の数は、図の凡例に記載されています。

この記事の結論を裏付けるデータセットは、アクセッション番号 PRJNA847006、PRJNA847017、および PRJNA895872 で NCBI Sequence Read Archive (SRA) リポジトリから入手できます。

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この研究は、中国国立自然科学財団 (32272898 および 31902189)、湖北省自然科学財団 (2021CFB436 および 2021CFA018)、武漢曙光プロジェクトの知識イノベーションプログラム (2022020801020230)、および基礎研究基金によって支援されました。中央大学 (2662020DKQD004)。この原稿に関して有益なコメントをくださったイェール大学の Canfeng Hua 博士に感謝します。

Jingjing Li、Shuaifei Feng、Zhenyu Wang の著者も同様に貢献しました。

華中農業大学動物科学技術学部、武漢、430070、中国

Jingjing Li、Shuaifei Feng、Jinhui He、Zeyue Zhang、Huicong Zou、Zhifeng Wu、Xiangdong Liu、Hong Wei、Shiyu Tao

中国農業大学動物栄養学部動物栄養国家重点実験室、No. 2 Yuanmingyuan West Road、Beijing、100193、中国

王振宇

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ST、XL、および HW が研究を設計しました。実験は主に JL、SF、ZW によって行われ、一部の実験は ZW、JH の協力を得て行われ、ZZ、SF、HZ がデータを解析しました。 ST は著者全員の協力を得て原稿を書きました。著者全員が原稿の最終版を読んで承認しました。 JL、SF、ZW はこの研究に等しく貢献しました。

Xiangdong Liu、Hong Wei、または Shiyu Tao に対応します。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Li、J.、Feng、S.、Wang、Z. 他。 Limosilactobacillus mucosae 由来の細胞外小胞は、下痢性子豚モデルにおいてマクロファージの表現型を調節し、腸の恒常性を調整します。 npj バイオフィルムマイクロバイオーム 9、33 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

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受信日: 2023 年 1 月 3 日

受理日: 2023 年 5 月 22 日

公開日: 2023 年 6 月 6 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00403-6

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