星状細胞のAPOE4除去により、脳アミロイド血管症の増加にもかかわらず脳血管の保護が得られる

分子神経変性 18 巻、記事番号: 17 (2023) この記事を引用

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アルツハイマー病（AD）と脳アミロイド血管症（CAA）はどちらも脳内のアミロイドβ（Aβ）蓄積を特徴としますが、Aβは主にADでは脳実質に、CAAでは脳血管系に沈着します。 CAA の存在は、CAA 関連の認知機能低下を引き起こす自然発生的な脳内出血や虚血を促進することにより、AD 患者の臨床転帰を悪化させる可能性があります。遺伝的には、AD と CAA は、最も強い遺伝的危険因子としてアポリポタンパク質 E (APOE) 遺伝子の ε4 対立遺伝子を共有しています。 ADにおける実質プラークの病因に対するAPOE4の役割を明らかにすることに多大な努力が焦点を当ててきたが、CAAに対するAPOE4の役割を調査する機構研究はまだ不足している。ここでは、APOEの主要な生産者であるアストロサイトによって生成されるAPOE4を廃止することがCAAおよびCAA関連血管損傷を改善するのに十分であるかどうかを検討しました。

我々は、アストロサイトにおいてAPOE4発現を選択的に抑制できるCAAとプラークの両方を沈着するトランスジェニックマウスを作製した。 CAAおよびプラーク形成に先立つ生後2ヶ月の時点で、APOE4が5XFAD APOE4ノックインマウスの星状膠細胞から除去された。マウスは生後 10 か月で、Aβ プラークと CAA の病状、神経膠症、血管の完全性について評価されました。

星状細胞におけるAPOE4のレベルを低下させると、線維状Aβの沈着が脳実質から脳血管系に移動した。しかし、CAAの増加にもかかわらず、星状細胞のAPOE4除去はAβ媒介グリオーシス全体を軽減し、CAAを含む血管の脳血管の完全性と機能の増加にもつながりました。

CAAのマウスモデルでは、血管系における線維性Aβ沈着の増加にもかかわらず、アストロサイトに特異的に由来するAPOE4の減少は、Aβ媒介グリオーシスおよび脳血管機能不全を軽減するのに十分である。

脳アミロイド血管症 (CAA) とアルツハイマー病 (AD) は臨床的には異なりますが、分子的および遺伝的特徴が重複しています。たとえば、両方の神経変性疾患の最も早期に検出可能な病理学的マーカーには、アミロイド β (Aβ) の蓄積が含まれます。 AD では Aβ が CAA として、また神経突起斑として脳血管構造に沈着しますが、CAA は AD 死後の脳の 85 ～ 95% で共生します [1]。しかし、臨床症状は異なります。過剰リン酸化された凝集型タウは、アルツハイマー病の認知能力と強く相関する皮質萎縮と関連しているのに対し[2、3]、CAA関連の出血と虚血は血管機能不全を引き起こします[4]。これは、アルツハイマー病および非アルツハイマー病の症例における認知障害を促進します[5、6、7]。脳内出血のリスクを高めることに加えて、血管 Aβ 毒性は、血管細胞を生理学的事象に対して無反応にし [9]、血管周囲の排液を障害することで [8]、神経血管単位を損傷し、これらすべてが AD の進行を悪化させる可能性があります。

CAAとADがAβ媒介病態を悪化させるメカニズムは異なるにもかかわらず、CAAとADは両方の疾患の有病率と重症度を高める重要な遺伝的危険因子を共有しています。アポリポタンパク質 E (APOE) は脂質輸送において重要な役割を果たしています [11]。ただし、APOE 遺伝子の ε4 対立遺伝子は病原性を高めることにより CAA [5、12、13、14、15] と AD [16、17] の両方に有害です。 Aβ の凝集と Aβ クリアランスの障害 [18、19]。このクリアランス障害は、血管に沿っておよび実質内にAβをさらに沈着させ、ADおよびCAAを悪化させる自己強化サイクルを促進する[10、20、21]。さらに、APOE は CAA [22] とプラーク [22、23、24] の両方の主要構成要素です。 APOEはCAAの発症に必要であり、線維性実質プラーク形成の主要な寄与因子である[25、26]。 APOE4 はまた、脳血流 [28、29] を減少させ、血液脳関門 (BBB) の透過性を増加させる [30、31、32] ことにより、脳血管系に対して Aβ 依存性および非依存性の効果 [27] を示します。脳血管機能障害におけるAPOEとCAAの間には確かに関係があるが、根底にあるメカニズムは依然として不明である。

中枢神経系 (CNS) では、アストロサイトが APOE の主な生産者ですが、反応性ミクログリア [33、34]、損傷したニューロン [35]、および特定の血管壁細胞 [36、37] も APOE を生成します。 APOE4 を発現する星状細胞は、CAA などの疾患による損傷の有無にかかわらず、大規模な転写、形態学的、機能的リモデリングを受け、生理学的機能の喪失を特徴とする病理学的状態になります [38,39,40,41,42,43,44、 45、46]。アストロサイトから選択的にAPOE4を欠失させると、アストロサイトおよびCNS内の他の細胞がより「恒常性のある」状態に回復し、アミロイドーシス[47、48]およびタウオパチーのマウスモデルにおいて疾患の進行が防止される[49]。星状細胞のAPOE4を除去した両方の研究で、反応性ミクログリアの減少が検出され、これはおそらくCNS炎症の全体的な減少、そしてその結果としての神経保護の促進に関連していると考えられます。さらに、病原性 Aβ またはタウも減少しましたが、CAA はこれらのモデルでは非常に低いか検出不可能なレベルであったため、定量化されませんでした。別の研究では、非トランスジェニックマウスにおける星状膠細胞のAPOE4の除去は、特定のBBB保護を提供するのに十分であった[50]。基底条件下でのアストロサイトの重要な役割と、APOE の ε4 対立遺伝子が CAA および脳血管系に及ぼす悪影響を考慮して、CAA マウスモデルにおけるアストロサイトの APOE4 発現の減少により、CAA 依存性および/または非依存性の血管障害が改善されるのではないかという仮説を立てました。ダメージ。この仮説に対処するために、我々は、ヒト APOE4flox/flox [53] を発現するヒト APOE4flox/flox [53] を発現する 5XFAD (系統 7031) マウス [52] と交雑した誘導性 Aldh1l1-Cre/ERT2 BAC トランスジェニックマウス [51] を利用し、APOE4 発現を選択的に削除しました。タモキシフェン投与時の星状細胞における。アストロサイトからのAPOE4の除去が脳血管系を保護するかどうかを決定することに加えて、CAAの形成と進行に対するアストロサイトのAPOE4の寄与も調査しました。

実施されたすべての動物研究は、セントルイスにあるワシントン大学の動物研究委員会によって承認された施設内動物管理使用委員会（IACUC）プロトコルに従って行われました。ノースウェスタン大学の R. Vassar から寄贈された 5XFAD マウス (系統 Tg7031) [52] を APOE4flox/flox マウス [53] と複数世代にわたって交配して、5XFAD APOE4flox/flox マウスを生成しました。また、Aldh1l1-Cre/ERT2 マウス (Jackson Laboratories、ストック番号 031008) を APOE4flox/flox マウスと数世代交配して、Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox マウスを作製しました。 5XFAD Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox マウスを作製するために、5XFAD APOE4flox/flox 雄を Aldh1l1-Cre/ERT2 APOE4flox/flox 雌と交配しました。 5XFADおよびAldh1l1-Cre/ERT2遺伝子を有するマウスを「5X+AL+」と呼び、Aldh1l1-Cre/ERT2遺伝子を持たないその同腹子を「5X+AL-」と呼びます。 5XFAD導入遺伝子を持たない同腹子は「5X-」マウスと呼ばれる。すべてのマウスは通常の 12 時間の明暗サイクルで飼育され、餌と水は自由に摂取できました。オスとメスの間に性差はなく、使用されたマウスの数は図の凡例で確認できます。

タモキシフェンは、37 °C で少なくとも 12 時間シェーカー上で 20 mg/mL でコーン油に溶解することにより、毎月新たに調製されました。生後 2 か月の時点で、実験グループのすべてのマウスにタモキシフェン (200 mg/kg、腹腔内) を毎日 1 回、連続 5 日間注射しました。タモキシフェン治療は、星状膠細胞におけるAPOE4の発現を減少させるcre組み合わせを誘導した。

まずマウスをFatal-Plus (200 mg/kg、腹腔内)で麻酔し、次に0.3%のヘパリンを含む冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で灌流した。 1 つの半脳を冷 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で 24 時間固定し、組織学のために 30% スクロースで 4 °C で凍結保護しました。もう一方の半球は前皮質と後皮質に分けられ、生化学的および遺伝子転写物の分析のために急速冷凍されました。

4% PFA で固定した半脳を凍結スライスミクロトーム (Leica) で 30 µm で冠状切片にし、凍結保護溶液 (0.2 M PBS、15% スクロース、33% エチレングリコール) 中で –20 °C で保存しました。

免疫蛍光染色は以前に記載されているように実施されました[54]。簡単に言えば、2つの頭脳セクトです。 (180 μm 離れた) を最初に 0.25% Triton-X100 を含むトリス緩衝生理食塩水 (TBS) (TBS-X) で透過処理し、次に TBS-X 中の 3% 血清を使用してブロックしました。脳スライスを、TBS-X中の1%血清で希釈した一次抗体中で4℃で一晩インキュベートしました。一次抗体には以下が含まれます: ヒト Aβ1 ～ 13 に対するビオチン化抗体 HJ3.4 (自社製造、2 μg/mL)、ウサギ Aβ40 (Thermo Fisher、44,136、1:500)、ウサギ Aβ42 (Thermo Fisher、700,254、1:500) )、ウサギ APOE 抗体 (Cell signaling、#13,366、1:500)、星状細胞用ビオチン化 GFAP (Sigma-Aldrich、MAB3402B、1:1000)、ウサギ Iba1 (Wako、019–19,741、1:5000)、ウサギフィブリノーゲン (アブカム、ab34269、1:1000)、およびラット LAMP1 (Developmental Studies Hybridoma Bank、#1D4B、1:400)。翌日、切片を一次抗体に対する二次抗体 (1:1000) で 1 時間染色しました。 X34 色素 (Sigma-Aldrich、SML1954、1:5000) を使用して、アミロイド斑と CAA を標識しました。 X34 染色では、浮遊脳切片を洗浄し (3 X 5 分)、TBS-X で 30 分間透過処理しました。次いで、脳組織をX34作業溶液とともにインキュベートした(X34をTBS緩衝液中の40%エタノールに1:5000希釈で添加し、1:500希釈のNaOHでpHを調整した)。 20分間のインキュベーション後、切片をX34洗浄緩衝液(TBS中40%エタノール、3×2分)で脱染し、次いでTBSで洗浄した(3×5分)。一次抗体を使用した場合、切片は上記の血清ブロッキングステップにさらされました。 Aβ40 および Aβ42 染色では、染色前に切片をまず 88% ギ酸中でインキュベートしました。

固定脳組織切片の免疫蛍光イメージングは、Biotek Cytation 5 Imaging Reader (図 2a、f、4a、f、5a (左パネル)、6a) で 10 倍、Leica Thunder Imager DMi8 (図 3e、図 3e) で 20X で実行されました。 m、S3a、S5a)、または解像度 1024 × 1024 ピクセルの Leica Stellaris 5 共焦点顕微鏡の 40 倍油対物レンズ (図 4c、h、5a (右パネル)、S4a)。画像はフィジーソフトウェア (ImageJ) 1.52v で分析されました。蛍光染色による領域被覆率については、海馬を覆う皮質の領域被覆率を決定するために、すべての画像に対して単一の閾値が設定されました。 CAA と血管 Aβ は、形態に基づいて実質プラークから区別されました。このモデルにおける CAA は、軟膜または貫通血管であると形態学的に決定された構造上へのアミロイドの横方向の帯状の沈着として現れます。 CAAの断面は、中央が空洞になった薄いリング状の外観をしています。実質プラークは一般に球形であり、多くの場合コンパクトです。形態による CAA およびプラークのこの評価が正確であることを検証するために、5XFAD APOE4flox/flox マウスを X34 について、および内皮細胞について CD31 について共染色しました。 X34+ CAA 血管として識別したものは CD31+ であるのに対し、X34+ 実質プラークは CD31- であることを確認し、CAA 血管と実質プラークを高い信頼度で区別できることを検証しました。共局在解析では、内蔵の画像計算機 AND 演算子を使用して、APOE とミクログリアまたはアストロサイトの共局在を実行しました。 2 つのチャネル (APOE とミクログリア、APOE と星状細胞) 間の共局在のパーセントをプラークまたは CAA 領域に対して正規化しました。個々の CAA 血管の共局在解析は、主に約 20 µm の血管で行われました。 CAAまたはプラークの周囲の星状細胞またはミクログリアの数を定量化するために、CAAまたは線維性プラークのみを含む画像を、グループあたりn = 8〜10匹のマウスの海馬を覆う皮質領域から撮影しました。 CAAまたはプラークの周囲の星状細胞またはミクログリアの数を手動で計数し、CAAまたはプラークのサイズに正規化しました。 CAA とプラークが同時に沈着した CAA/プラークの混合病理を含む画像は、CAA またはプラーク特異的な効果を区別できないため、使用されませんでした。プラークまたは CAA の周囲の LAMP1 を定量化するために、個々のプラークまたは CAA 血管の周囲で LAMP1 によって覆われた面積のパーセントを決定し、これらの値をそれぞれ X34+ プラークまたは CAA によって覆われた面積のパーセントに正規化しました。この分析では、マウス 1 匹あたり 6 つの CAA 血管またはプラークを評価し、1 つの生物学的複製についてこれらの値を平均しました。画像は実験条件を知らされずに処理および分析されました。

ヘモジデリン沈着物の染色は、以前に記載されているように若干の変更を加えて実行されました [54]。 180 μm の間隔をあけた 8 つの脳切片を、2% 塩酸中の 2% フェロシアン化カリウム (P3289; Sigma-Aldrich) 中で 30 分間インキュベートしました。脳切片は、Nanozoomer 2.0-HT スライドスキャナーを使用して 40 倍の倍率で画像化されました。微小出血のサイズと数の定量化は、NDP.View2 ソフトウェアを使用してヘモシデリン + 沈着物を手動で追跡することによって実行されました。分析と追跡は、治療法を知らされていない研究者によって行われました。

脳血管機能のライブ血管イメージングは、以前に記載されているようにわずかな修正を加えて実行されました[54]。血液ガスのサンプルを採取するために、イソフルラン（導入４％、維持１．５％）麻酔下で、１つの大腿動脈にカニューレを挿入した（ＮｏｖａＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅｐＨＯｘＡｎａｌｙｚｅｒ）。 100% O2 の 0.5% 流量を補充した機械換気 (Harvard Apparatus、MiniVent Ventilator) のために気管切開が行われました。蛍光顕微鏡下で軟髄膜血管を視覚化するために、フルオレセイン-デキストラン(Life Technologies、D1823、12.5 mg/mLで150 uL)を眼窩後注入した。イソフルランは血管拡張剤であるため、ライブイメージング中にマウスからイソフルランを離脱させ、代わりにペントバルビタール（腹腔内、初回投与では50 mg/mL原液から1.35 mL/kg、その後の投与では0.70 mL/kg）で麻酔をかけた。次に、マウスを特注の定位固定装置 (ワシントン大学医学部の器具機械工場) に固定し、右頭頂骨 (直径 4 mm) を除去することにより、開頭術を実施しました。窓を人工脳脊髄液（aCSF、mM: 125 NaCl、26 NaHCO3、1.25 NaH2PO4、2.5 KCl、1 MgCl2、1 CaCl2、および 25 mM グルコース）に浸しました。軟膜血管上の CAA を X34 色素で標識しました。軟膜動脈は、MetaMorph イメージングソフトウェアバージョン 7.10.2 (Molecular Devices) を使用し、1024 × 1024 ピクセルの水浸レンズを備えた Nikon Eclipse 600ME デジタルビデオ顕微鏡システム (Nikon Instruments Inc.) を 20 倍で使用して画像化しました。血管平滑筋細胞依存性血管拡張剤であるS-ニトロソ-N-アセチル-ペニシラミン(SNAP; Sigma-Aldrich、N3398、50μM)を窓に5分間局所適用した。画像はフィジーのObjectJソフトウェアプラグインバージョン1.04q（ImageJ）を使用して分析され、長さ6〜8〜30μmの血管セグメントの直径が測定されました。データは、ベースラインからの血管拡張変化のパーセントとして計算されました。 1 つの血管からの血管セグメントが平均され、個々の生物学的複製として分析されました。データは、4 匹のマウスの 9 血管 (5X+AL-) および 3 匹のマウスの 6 血管 (5X+AL+) から生成されました。ただし、1 匹のマウスから 2 血管以下でした。

組織溶解物の抽出とヒト Aβ (55) または APOE [49] の検出のためのプロトコルは、以前に詳細に説明されています。マウス皮質組織サンプル (約 15 mg) を、プロテアーゼ阻害剤 (Roche、11,697,498,001) および phosSTOP 阻害剤 (Roche、04,906,845,001) の存在下で、予冷した PBS および 5 M グアニジン緩衝液で連続的にホモジナイズしました。磁気ビーズ (Next Advance、ZrOB05) および 20 μl PBS/1 mg 組織を添加した後、組織をビーズホモジナイザー (Next Advance、Bullet Blender Strom 24) の設定 3 で 45 秒間ホモジナイズしました。その後、ホモジネートを 30 分間遠心分離しました。 4 °C、15,000 rpm。上清をＰＢＳ塩可溶性画分として回収した。次に、同量のグアニジン緩衝液をペレットに添加し、再度設定８で３分間均質化した。ホモジネートを室温で 1 時間回転させた後、4 °C、15,000 rpm で 30 分間遠心分離しました。最後に、上清をグアニジン可溶性（「不溶性」）画分として収集した。両方の画分をさらに使用するまで -80 °C で保存しました。 PBS および 5 M グアニジン画分中の Aβ40、Aβ42、および APOE のレベルをサンドイッチ ELISA によって測定し、組織重量に対して正規化しました。 Aβ40については、抗Aβ35-40 HJ2（自社）を捕捉抗体として使用し、ビオチン化抗Aβ13-18 HJ5.1（自社）を検出抗体として使用した。 Aβ42については、抗Aβ37-42 HJ7.4（自社、マウスモノクローナル）が捕捉抗体であり、ビオチン化抗Aβ13-18 HJ5.1（自社、マウスモノクローナル）が検出抗体であった。ヒト APOE のコーティング抗体は HJ15.3 (社内、マウスモノクローナル)、捕捉抗体は HJ15.7 ビオチン化 (社内、マウスモノクローナル) でした [53]。

X34 および GFAP を含む免疫蛍光切片を Leica Stellaris 5 共焦点顕微鏡 (40 × 油対物レンズ、解像度 1024 × 1024 ピクセル) で画像化しました。この分析には、海馬を覆う皮質領域からの CAA または線維性プラークのみを含む画像 (プラーク/CAA 病理の混合物なし) を使用しました。 Simple Neurite Trace (SNT; ImageJ プラグインオープンソースツール) を使用して、GFAP+ 星状細胞突起の 2 次元アーバーを再構築し、サイズ (凸包)、突起の数、突起の長さの合計、突起数などの形態学的読み取り値を生成しました。プロセスポイントの数と平均プロセス長。各マウスの 2 つの切片から 4 ～ 5 個の星状細胞が無作為に選ばれ、他の細胞と接触した突起や切断された突起はありませんでした。

RNeasy Mini Kit (Qiagen) を使用して凍結前皮質組織から RNA を抽出し、メーカーの指示に従って RNA-to-cDNA キットを使用して cDNA に変換しました。ワシントン大学の Genome Technology Access Core と協力して、Taqman プライマーを使用して Fluidigm Biomark HD リアルタイム PCR システムで遺伝子発現を実行しました。相対的な遺伝子発現は Actb に対して正規化されました。

統計分析には GraphPad Prism 9.5.0 を使用しました。図の凡例に記載されているように、データはグループサイズが 10 未満の場合は平均 ± 標準偏差 (SD) として表示されます。それ以外の場合、データは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。特に記載がない限り、他の統計的比較は有意ではありませんでした。 2 つのグループ間の統計的有意性は、対応のないスチューデントの t 検定 (両側) を使用して計算されました。データの分散が等しくない場合は、ウェルチ補正を伴う t 検定が使用されました。

CAAとプラークの病状が混合したマウスモデルでAPOE4のアストロサイト特異的欠失を達成するために、Aldhl1l-Creを含む（5X+AL+）または含まない（5X+AL-）のいずれかで、5XFAD（系統7031）APOE4flox/floxトランスジェニックマウスを生成しました。 /ERT2 遺伝子 [51,52,53]。星状細胞からのAPOE4の発現を排除するためのCre媒介組換えは、プラーク/CAAの発生に先立つ時点である、生後2か月の5X+AL+または5X+AL-マウスにおける連続5日間の腹腔内（ip）タモキシフェン治療によって達成されました（図1）。 1a)。タモキシフェン治療により、生後10か月の5X+AL+マウスにおいて皮質APOE4 mRNA（図1b）およびタンパク質（図1c、d）が大幅に減少しました。タモキシフェン投与の前後で、APOE4 mRNA (図 S1a) およびタンパク質レベル (図 S1b、c) に対する性影響はありませんでした。

タモキシフェン誘導性の Cre 組換えは、APOE mRNA とタンパク質の両方を減少させます。 a 生後 2 か月の 5XFAD (ライン 7031) x APOE4flox/flox (5X+AL-) または 5XFAD (ライン 7031) x APOE4flox/flox x Aldhl1l- におけるタモキシフェン治療 (200 mg/kg で毎日 5 回の注射) の概略タイムラインCre/ERT2 (5X+AL+) マウス、生後 10 か月で評価。 b 皮質におけるベータアクチンに対して正規化された APOE mRNA の相対発現。 c、d 皮質からのELISAによって評価されたPBS可溶性およびグアニジン-HCL可溶性（「不溶性」）APOEタンパク質濃度。データは平均±SDとして表され、ウェルチのt検定が実行された(b)を除くすべての統計分析についてスチューデントのt検定(両側)が実行されました。 Δ=男性、○=女性。 ***P < 0.001、****P < 0.0001。示されない限り、他の統計的比較は重要ではありません

これまでの研究では、APOE4 が CAA の発症を促進する一方、マウスにおける全体的な APOE 欠損が CAA の病態を予防することが実証されています [25]。したがって、本発明者らは、星状膠細胞のAPOE4の除去により、生後10か月の5X+AL+マウスにおけるCAAおよびAβプラーク負荷の両方が減少するであろうという仮説を立てた。実際、総線維性 Aβ 沈着および線維性プラーク (図 2a、b、d) の減少、ならびにその上にある皮質領域における総 Aβ 免疫反応性 (図 2f、g) および Aβ+ プラーク (図 2i) が検出されました。海馬。しかし、驚いたことに、アストロサイトからAPOE4を減少させると、CAAの線維性Aβが増加しました（図2c、e）。血管 Aβ はほとんどが線維状で沈着しますが、Aβ+ 免疫反応性で線維状ではない成分も存在します。 Aβ + 染色が血管内で検出されましたが、この染色は星状細胞のAPOE4欠損によって変化しませんでした（図2h）。しかし、血管系におけるAβ + 染色の割合は増加し（図2j）、星状細胞からAPOE4を除去した後、Aβが血管内に蓄積する傾向がより大きくなることを示唆しています。アミロイドーシスの特定のマウスモデルでは、Aβプラークの蓄積に対する性的影響が明らかになりましたが、私たちの研究では、血管またはプラークにおける皮質X34+線維負荷またはAβ+免疫反応性の範囲に性別依存的な差は観察されませんでした（図S2）。皮質のアミロイド負荷に加えて、プラーク/CAA負荷が濃い脳領域である海馬台のアミロイド病理も評価しました（図S3a）。星状膠細胞のAPOE4除去後の背台座における総線維性プラーク/CAA沈着には変化はありませんでしたが（図S3b）、CAAの2倍の増加（図S3c）とプラーク被覆率の2倍の減少（図S3c）が再度観察されました。 S3d）。これらの結果は、すべての細胞型からのAPOEの胎生期における完全な除去はCAAの進行から保護するが[25]、生後2か月から始まる成体マウスの星状膠細胞のAPOE4の選択的欠失は、生後10か月の5X+マウスでCAAを悪化させる結果となったことを示唆している。 AL+マウス。

アミロイド沈着の前に星状細胞のAPOE4を除去すると、Aβの分布がプラークから脳血管系に移動します。 a〜d、生後10か月の5X+の海馬を覆う皮質における線維性プラーク/CAAのX34染色（a）と合計X34プラーク（b）、CAA（c）、およびアミロイドプラークのカバー率（d）生後2か月で星状細胞のAPOE4を除去した後のAL-または5X+AL+マウス。 e、合計 X34+ 染色における CAA の割合。 f – i、Aβ免疫反応性（Aβ-IR）（f）と、海馬を覆う皮質の総Aβ-IR（g）、血管Aβ-IR（h）、およびプラーク（i）の面積カバー率（i）。 j 総 Aβ-IR における血管 Aβ の割合。スケールバー: 300 μm。データは平均±SDとして表され、ウェルチのt検定が実行された(b)を除くすべての統計分析について、対応のないスチューデントのt検定(両側)が実行されました。 Δ=男性、○=女性。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。示されない限り、他の統計的比較は重要ではありません

星状膠細胞のAPOE4除去後のCAAの増加は、脳内のAβ40対Aβ42組成の変化が血管アミロイド負荷の増加の変化を説明できるかどうかという疑問を抱かせました。 Aβ40は血管構造に沿って蓄積する傾向がより大きいが、in vivoおよびin vitro研究では、Aβ42が血管Aβ沈着の最初の播種に必要であることが明らかになっている[21、56]。したがって、CAA の増加は、血管系に蓄積された Aβ40 の濃度の上昇によって反映されている可能性があります。この仮説に対処するために、PBS可溶性および5 Mグアニジン-HCl可溶性（「不溶性」）Aβ40およびAβ42について皮質組織でバルクELISAを実行しました（図3a〜d）。予想通り、プラーク中の Aβ の主要な種である不溶性 Aβ42 の減少が検出されました (図 3d)。しかし、組織学によるCAAの上昇にもかかわらず、星状細胞のAPOE4除去後は可溶性Aβ40タンパク質濃度（図3a）および不溶性Aβ40タンパク質濃度（図3c）も減少しました（図2c）。 1 つの注意点は、バルク ELISA では血管構造内の Aβ40 とプラークの区別ができないことです。また、このマウスモデルでは Aβ40 もプラークに大量に沈着する可能性があります。したがって、星状膠細胞APOE4を持たないマウスにおけるELISAによる全体的なAβ40の低下は、むしろプラーク減少を反映している可能性がある。したがって、免疫染色によってプラークまたは血管のいずれかに局在するAβ40およびAβ42の面積被覆率も測定しました（図3e-t）。星状細胞のAPOE4を欠くマウスでは、総Aβ40（図3f）およびプラーク中のAβ40（図3h）の減少があったが、血管Aβ40の減少はなかった（図3g）。しかし、アストロサイト APOE4 を持つマウス (~ 20%) では、アストロサイト APOE4 を持たないマウス (~ 60%) と比較して、血管に沈着する Aβ40 の割合に変化があり、アストロサイト APOE4 がなければ、Aβ40 ペプチドは血管内で同等のレベルで凝集したが、おそらく脳実質ではより早く除去または分解された可能性があります（図3i）。これは、おそらくより迅速なAβ40クリアランスの結果として、Aβ42ではなく可溶性Aβ40の減少を明らかにしたELISAデータによってさらに裏付けられています（図3a、b）。さらに、脳実質の貫通血管と比較して、脳の表面に沿った軟髄膜血管の範囲を評価することにより、Aβ40の局所的な沈着を解析しました。 Aβ40の軟膜蓄積には変化はなかった(図3j)。しかしながら、脳実質の貫通血管に沈着するAβ40は2倍増加していた(図3k、P=0.073;図3l、P=0.065)。これは、ニューロンが脳実質に Aβ40 を放出した後、プラークと凝集しない Aβ40 のプールが存在することを示唆しています。代わりに、Aβ40ペプチドは、実質動脈に沿った間質液および血管周囲の排出経路を介して往復され、そこで凝集するか軟膜動脈/CSFを通って排出される可能性があります。興味深いことに、プラークに蓄積するAβ42の減少は検出されましたが（図3p）、総Aβ42の有意な減少はありません（可溶性または不溶性の形態は組織学的には区別できません;図3m、n）。さらなる分析により、軟膜と浸透血管のAβ42蓄積の間に差がないことが実証され（図3r〜t）、Aβ40が血管周囲に優先的に凝集し、星状細胞APOE4を欠くマウスにおけるCAA蓄積の増加に寄与する可能性があるという以前の発見を裏付けています。

星状細胞のAPOE4は、プラーク、実質血管、および軟髄膜血管におけるAβ40およびAβ42の沈着の分布を調節します。 a〜d、皮質からのELISAによって評価されたPBS可溶性およびグアニジンHCL可溶性（「不溶性」）Aβ40およびAβ42タンパク質濃度。 e – h Aβ40免疫反応性（IR）（e）と総Aβ40（f）、総血管Aβ40（g）、およびプラーク中のAβ40（h）の面積カバー率。 i 総 Aβ40 IR における血管 Aβ40 の割合。 j、k Aβ40 IR は軟膜血管 (j) および貫通血管 (k) に限定されています。 (l) 全血管 Aβ40 に占める浸透血管中の血管 Aβ40 の割合。 m – p、Aβ42 免疫反応性 (IR) (m)、総 Aβ42 (n)、総血管 Aβ42 (o)、およびプラーク内の Aβ42 の面積カバー率 (p)。 q 総 Aβ42 IR における血管 Aβ42 の割合。 r、s、Aβ42 IR は軟膜血管 (r) および貫通血管 (s) に限定されます。 t 全血管 Aβ42 に占める、貫通血管中の血管 Aβ42 の割合。青い矢印 = 血管 Aβ。紫色の矢印 = プラーク。スケールバー: 500 μm。データは平均±SDとして表され、ウェルチのt検定が実行された(d)を除くすべての統計分析についてスチューデントのt検定(両側)が実行されました。 Δ=男性、○=女性。 *P < 0.05、*P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001。示されない限り、他の統計的比較は重要ではありません

私たちのマウスモデルで星状膠細胞の APOE4 を除去するための Cre 媒介組換えにより、全体的な APOE mRNA およびタンパク質レベルが減少しました。細胞レベルでのAPOE4発現変化の大きさを評価するために、我々は、Aβ病理に応答して疾患に関連する転写プロファイルを上方制御する2つの主要な細胞型、すなわちアストロサイトとミクログリアにおけるAPOE4の空間分布と発現を調査した。予想通り、Cre 組換えがなければ (5X+AL- マウス)、APOE は CAA またはプラークを囲む GFAP+ 星状細胞および IBA1+ ミクログリアにほとんど局在していました。ただし、アミロイド沈着のない皮質領域のアストロサイトにもAPOE発現がありましたが、ミクログリアには発現しませんでした（図S4a）。アストロサイトからAPOE4を欠失させると、CAA/プラーク病理の有無にかかわらず、皮質領域のAPOE4タンパク質が全体的に減少しました（図S4a、b）。 APOEの減少はGFAP + 星状細胞に限定され（図S4c）、IBA1 + ミクログリアでは観察されませんでした（図S4d）。これは、ミクログリアにおけるAPOE4発現が変化していないことを示しています。まとめると、我々の結果は、アストロサイトに特異的な強力なAPOE4タンパク質の減少を達成したことを示唆しています。

次に、Aβ媒介性グリオーシスに対するAPOE4除去の効果を評価するために、皮質におけるアストロサイトとミクログリアの発現パターンを評価しました。 GFAP + 星状細胞の染色により、APOE4 の星状細胞発現の非存在下での皮質 GFAP + 星状細胞反応性の全体的な低下が明らかになりました (図 4a、b)。総アミロイド減少のない領域である背側台座では（図S3）、GFAP領域の範囲にも変化はありませんでした（図S5）。これは、アミロイドが、それが沈着するコンパートメントに関係なく、GFAP +反応性星状細胞症を駆動することを最初に示唆しました。しかし、GFAP + アストロサイトとX34 + アミロイドプラークまたはCAAの同時分析により、APOE4のないアストロサイトの残りのプラークを囲むGFAP +アストロサイトの強い反応があったものの、CAAに関与するGFAP +アストロサイトの反応性は低いことが明らかになりました（図4c〜e）。 APOE4 はプラークと CAA の両方の周囲の星状細胞で著しく減少しましたが、プラーク周囲の GFAP+ 星状細胞によって覆われた領域のパーセントは、APOE4 発現に関係なく維持されました。これは、アミロイド斑が形成されると、アストロサイトの反応性が APOE 非依存的に維持できることを示唆しています。さらに、反応性の GFAP+ 星状細胞は、明確な形態学的リモデリングを受ける可能性があり、より「恒常性」の状態にある星状細胞は高度に分岐した突起を示す可能性がありますが、「反応性」の星状細胞は、傷害または傷害に応じて、より後退した突起と肥大を示します。 CAA 周囲に APOE4 がある星状細胞とない星状細胞とプラークを区別するために、GFAP 反応性星状細胞の形態を評価しました。全体として、アストロサイトからAPOE4を除去しても、その形態のサイズや複雑さは変化しませんでした（図S6a–f）。ただし、CAAと比較してプラークに関与するアストロサイトは、変化した形態を示します。プラークに接触するアストロサイトは、突起の数が多く（図S6c）、突起の長さが大きく（図S6d）、樹木形成の増加が特徴です（図S6e）。しかし、平均して、これらのプロセスはより短く（図S6f）、多数の退縮した終末プロセスを代表しており、アミロイド斑が関連星状細胞に対してCAAよりも強い毒性などの微妙な違いを誘発する可能性があることを示唆しています。総合すると、これらの所見は、アストロサイトのAPOE4除去後にCAAと関連するGFAP+アストロサイトの数が少なく、残りの少数のプラークと接触するアストロサイトよりもおそらく反応性の低い形態学的状態を採用したことを示唆している。プラーク/CAAを取り囲むこれらのアストロサイトの複雑さを理解するには、機能を含むさらに多くの読み取りが必要です。

アストロサイトのAPOEが枯渇すると、特定の疾患に関連するグリアのサインが減少します。 a〜e、生後10か月の5X+AL-または5X+AL+マウスの皮質におけるGFAP+星状細胞染色（a）および面積範囲の定量化（b）。スケールバー: 300 μm。代表的な画像 (c) および CAA (d) またはプラーク (e) を囲む星状細胞の数の定量化。スケールバー: 20 μm。各点は、1 グループあたり n = 8 ～ 10 匹のマウスの CAA またはプラーク領域に対して正規化された、単一の CAA またはプラークを囲む星状細胞の数を表します。 f – j、海馬を覆う皮質におけるIBA1+ミクログリアの被覆率（f）および面積被覆率の定量化（g）。スケールバー: 300 μm。 CAA (h、i) またはプラーク (j) をクラスター化するミクログリアの数のプラークごとの分析。スケールバー: 20 μm。各点は、1 つの CAA またはプラークを取り囲むミクログリアの数を、グループあたり n = 8 ～ 10 匹のマウスの CAA またはプラーク領域に対して正規化して表します。 k、l、恒常性および疾患関連星状細胞遺伝子（k）およびミクログリア遺伝子（l）の相対的なmRNA発現。 Clec7a mRNA に帰属されたデータ (列 10) ですが、統計分析には使用されません。各列は個々のマウスを表します。データは平均 ± SD として表され、(d)、(e)、(k – S100β)、および (l – Cst7、Cst3、Itgax、Spp1) を除くすべての統計分析に対してスチューデントの t 検定 (両側) が実行されました。ここで、Welch のt検定を行った。 Δ=男性、○=女性。 *P < 0.05、**P < 0.01。示されない限り、他の統計的比較は重要ではありません

アストロサイト APOE4 の除去後に GFAP+ アストロサイト反応が全体的に弱まったことを考慮すると、アストロサイト - ミクログリアのクロストークが影響を受けるかどうかに興味がありました。この疑問に対処するために、IBA1 染色を使用してミクログリアの反応を評価しました。免疫組織化学によって、皮質またはプラーク/CAAあたりのレベルでIBA1 +ミクログリアの変化は検出されませんでした（図4f-j）。定量的PCR（qPCR）を使用して特定の疾患関連グリア遺伝子を調べたところ、皮質のGfapおよびC3を含む反応性アストロサイト遺伝子発現の減少が検出されました（図4k）。興味深いことに、Cst7、Clec7a、Spp1などの疾患関連ミクログリア（DAM）/ミクログリア神経変性疾患（MGnD）遺伝子の減少も検出しました（図4l）。 IBA1+ ミクログリア染色。要約すると、これらのデータは、アストロサイト APOE4 の除去後の脳内の CAA の上昇にもかかわらず、いくつかの疾患関連ミクログリアおよびアストロサイト遺伝子の減少があったことを示唆しています。これは、おそらく脳および脳血管系を保護する可能性のある Aβ 種および立体構造の変化による、グリア状態の変化を示唆しており、追跡機能アッセイで確認しようとしました。

CAAの増加にもかかわらず、星状膠細胞のAPOE4除去により疾患に関連した神経炎症が減少し、その結果がCNSの下流保護を提供する可能性があると我々は判断した。 APOE4の減少がプラークおよびCAAに関連する神経プロセスに神経保護を提供するかどうかを評価するために、アミロイドとCAAを囲む大きく腫れた軸索に高度に富んでいるリソソームマーカーであるLAMP1を標識することによって神経炎性ジストロフィーを評価した[59、60]。皮質では、星状膠細胞のAPOE4が存在しないため、LAMP1+ジストロフィー性神経突起が大幅に減少しました（図5a、b）。さらなる分析により、アミロイド沈着APOEノックアウトマウスで観察されたものと同様に、CAA周囲でLAMP1+反応性が低下している（図5c）一方、残りの実質線維性プラーク周囲ではLAMP1免疫反応性が増加している（図5d）ことが明らかになった[61]。 ]。神経突起性ジストロフィーは一般にCAAよりもプラーク周囲でより顕著であるため、星状細胞APOE4を持たないマウスの皮質における神経突起性ジストロフィーの全体的な減少は、実質における総線維性プラークの顕著な減少によって引き起こされた可能性が高い。

星状細胞の APOE 除去により、ジストロフィー性神経突起が防止されます。 a〜d、ジストロフィー性神経突起のLAMP1染色（a）、皮質内の総LAMP1のパーセンテージの定量化（b）、X34+ CAAでカバーされる面積パーセントに正規化されたCAA周囲のLAMP1染色の面積カバー率（c）、および面積パーセントプラーク周囲の LAMP1 染色の範囲を X34+ プラークで覆われた面積パーセントに正規化したもの (d)。スケールバー: 200 μm。紫色の矢印: プラークの周囲の LAMP1。青い矢印: CAA の周囲の LAMP1。データは平均±SDとして表され、ウェルチのt検定が実行された(b)および(c)を除くすべての統計分析についてスチューデントのt検定(両側)が実行されました。 Δ=男性、○=女性。 *P < 0.05、**P < 0.01、****P < 0.0001。示されない限り、他の統計的比較は重要ではありません

脳血管の完全性の破壊は CAA の特徴であり、BBB の破壊や生理的な血管機能の喪失につながる可能性があります。より高いCAA負荷を示す5X+AL+マウスでBBBが損なわれているかどうかを判断するために、通常は脳実質への侵入が妨げられている血液由来タンパク質であるフィブリノーゲンの存在を染色しました（図6a）。驚くべきことに、CAAの増加にもかかわらず、星状細胞APOE4の除去後のフィブリノーゲンの血管外漏出は減少しました（図6b）。 CAAの上昇がCAA誘発性微小出血を増加させるかどうかも調査しましたが、グループ間で微小出血の数に差は見つかりませんでした（P = 0.07;図6c、d）。対照マウスからのフィブリノーゲンの減少により、CAAを含む血管も血管機能の改善を示すかどうかをテストするようになりました。平滑筋細胞 (SMC) 層に CAA が沈着すると、血管拡張を刺激する分子に対する細動脈の反応性が低下します。生きている覚醒したマウスに、一酸化窒素の産生を引き起こすSMC血管拡張剤（S-ニトロソ-N-アセチルペニシラミン、SNAP）を局所注入し、脳の表面にあるCAAを含む軟髄膜血管の血管拡張反応を測定しました（図6e）。）。 APOE4を発現する5XFADマウスと比較して、SNAPが星状細胞APOE4の除去後の5XFADマウスにおける血管拡張の有意な増加を引き起こすことを我々は見出した（図6f）。したがって、星状細胞の除去により BBB が保護され、SMC の血管反応性が促進されました。要約すると、我々の結果は、アストロサイトにAPOE4が存在しないとCAAが増加するが、実質プラークが減少し、Aβ関連グリオーシスが減少し、脳血管機能が改善されることを示している。

CAAの上昇にもかかわらず、血管変性は改善されます。 a、b 生後 10 か月の 5X+AL- または 5X+AL+ マウスの皮質における、血液由来タンパク質フィブリノーゲンの染色 (a) と覆われた面積パーセントの定量化 (b)。黄色の矢印: フィブリノーゲン染色。スケールバー: 100 μm。 c、d、プルシアンブルー染色による平均微小出血数（c）およびサイズ（d）。 e、f、血管平滑筋細胞依存性分子（SNAP）の局所適用後のベースラインからの血管拡張変化パーセントによって測定された軟髄膜機能のインビボ評価。紫色の矢印: 拡張の増加。青い矢印: 拡張に変化はありません。 4 匹のマウスの 9 個の血管 (5X+AL-) および 3 匹のマウスの 6 個の血管 (5X+AL+) からのデータ。スケールバー: 15 μm。 SNAP = S-ニトロソ-N-アセチルペニシラミン。データは平均±SDとして表され、ウェルチのt検定が実行された(c)および(d)を除くすべての統計分析についてスチューデントのt検定(両側)が実行されました。 Δ=男性、○=女性。 *P < 0.05、***P < 0.001。示されない限り、他の統計的比較は重要ではありません

APOE の ε4 対立遺伝子は、AD および CAA のリスクに強く影響します。 APOE4 は、Aβ の播種と線維形成を促進することに加えて、クリアランスを阻害したり Aβ と競合したりするため、APOE4 キャリアの AD 患者における Aβ 病理の早期発症を促進する可能性があります。同様に、CAA を有する APOE4 キャリアは CAA の罹患率を加速させ、重症度を高めています [5, 12]、早期に出血を発症するリスクが追加されています [13]。 APOE4 が CAA に寄与する根本的なメカニズムは明らかではありません。最近、私たちの研究室は、アストロサイトによって分泌されるAPOE4の除去が、アストロサイトとミクログリアのクロストークを潜在的に変化させることにより、Aβ実質プラーク負荷[48]およびタウ媒介神経変性[49]を強力に軽減するのに十分であることを実証しました。この現在の研究では、我々の目標は、CAA および CAA 関連の血管機能不全に対する星状細胞 APOE4 の寄与を調査することでした。

私たちのグループは、マウスAPOEの遺伝的除去がAβ沈着マウスにおけるCAAの発症を予防するのに十分であることを以前に示した[25]。しかし、脂質代謝における末梢由来と脳由来の両方のAPOEの重要な役割を考慮すると、体全体のAPOEの遺伝子による完全な除去は実行可能な治療法ではない可能性があります。したがって、我々は、脳内のAPOEの主な生産者であるアストロサイトからのAPOEの選択的除去が、CAAおよびCAA関連血管損傷を軽減するのに十分であるかどうかを尋ねた。我々は、混合CAA/プラーク沈着のマウスモデル（5X+AL+）において、星状膠細胞のAPOE4を除去することによって総APOE4のレベルを低下させる（総APOE4の約75％減少）と、AβプラークとCAA負荷の両方が減少すると仮説を立てた。実際、5X+AL+ マウスでは Aβ およびアミロイド斑が減少しました。しかし、興味深いことに、CAAの増加も同時に起こり、Aβ沈着は実質斑では約50%から約20%に、CAAでは約50%から約80%に移行した。以前の発見と同様に、星状細胞APOE4を持たないマウスに残っている実質アミロイド斑は、密なコア形態ではなく、より分散したコア形態を有する[48]。しかし、驚いたことに、星状膠細胞のAPOE4の非存在下で見られたCAAの増加は、CAA関連の損傷を悪化させず、むしろ血管機能の改善を促進した。以下に、(1) 脳実質から脳血管系への Aβ の移動についての考えられる説明、(2) 血管内 Aβ の増加にもかかわらず、APOE 除去の脳血管系に対する保護効果、(3) APOE に関する我々の発見の意味について議論します。に基づいた治療法。

脳では、APOE は自己集合 [62] または線維化のために Aβ に直接結合するための「シード」として機能する可能性があります [63、64、65、66、67]。実際、APOEの非存在下では、Aβ斑を沈着するトランスジェニックマウスは可溶性Aβクリアランスを増強しており[68]、APOEがクリアランスに関してAβと競合するか、および/または脳内にAβを保持してクリアランスを低下させるかのいずれかを示唆している。 Aβ は、血管周囲経路 [10]、BBB トランスサイトーシス [69]、細胞取り込み [70]、および/または間質液/脳脊髄液 (ISF/CSF) バルクフロー [71] を介して脳から除去されます。 APOEは、CAAの発症のために血管系の原線維にAβを「播種」するために必要である[25]。私たちの研究では、脳内のAPOE4の総タンパク質濃度が約75%減少しました。疾患関連ミクログリア、血管周囲マクロファージ、内皮細胞、周皮細胞、血管周囲線維芽細胞、または平滑筋細胞に由来する残りのAPOE4は[72]、CAAの発症に寄与した可能性が高い。 Aβ 線維化に対するさまざまな細胞型に由来する APOE の寄与は不明ですが、現在のデータは、ミクログリアによって分泌される APOE 粒子がアストロサイトからの APOE 粒子よりも小さい (したがって脂質化が少ない) ことを示唆しています [53]。 APOE4周皮細胞が疾患の進行において重要な役割を果たしている可能性があるが、血管壁細胞によって分泌されるAPOEの分子特性とCAAへの正確な寄与は現時点ではわかっていない[37]。いずれにしても、これらの発見は、異なる細胞源からの APOE が異なる Aβ 播種の可能性を持っている可能性があることを示唆しています。興味深いことに、遺伝子組み換えマウスを用いた他の研究では、ミクログリアの機能をより貪食性の低い状態に変更すること[73]、または薬理学的[74]または遺伝学的にミクログリアを枯渇させること[75]（これらはすべてミクログリア分泌のAPOEを減少させる可能性が高い）の量を増加させることが示されている。 CAA。 APOEがどの程度変化するかは明らかになっていないが、タウオパチーのマウスモデルを用いたある研究では、薬理学的にミクログリアを除去した後にアストロサイトとニューロンでAPOEタンパク質が増加するという代償機構が検出された[76]。さらに、実質プラークおよび CAA に沈着する脳内で高度に発現されるもう 1 つのアポリポタンパク質であるクラスタリン (APOJ) の損失 [77] により、CAA 沈着が増加しました [78]。 APOE の細胞起源に関係なく、CNS APOE の不偏な減少により、Aβ の凝集が減少し、したがって脳実質における Aβ の滞留が減少する可能性があります。脳内で生成され、脳 ISF に放出された可溶性 Aβ は、血管周囲経路を通じて部分的に除去され、CAA として沈着する Aβ の供給源と考えられます。関連する研究によると、星状細胞のAPOE除去はAPPの切断と産生に影響を及ぼさなかった[48]。これは、Aβ局在の変化がAβ産生の変化の結果ではないことを示唆している。我々は、貫通血管においてAβ40の2倍の増加を検出したが、これが血管周囲クリアランスの増強の結果であるかどうかは不明である。したがって、星状膠細胞のAPOE4を喪失した我々のモデルを含むこれらのマウスモデルにおいて、ISFおよび血管周囲Aβクリアランスが変化するかどうかを決定することは、将来の興味深いことである。 APOE4がさまざまなCNS細胞タイプから選択的に除去される今後の実験は、プラーク/CAAの発症における細胞特異的APOEの役割についての貴重な洞察を提供する可能性がある。

私たちの現在の研究で、おそらく最も驚くべき発見は、星状細胞の APOE4 除去が CAA の増加をもたらしたが、脳血管系は保護したということでした。アストロサイトは、神経栄養サポートの提供、イオン恒常性の調節、血管周囲腔からの物理的障壁の作成など、重要な基本機能を備えています[79、80]。脳血管構造に沿って、血管周囲の星状膠細胞の末端足は、選択的な分子の流入を可能にする障壁を占めている[80]。しかし、CAA や炎症性チャレンジなどの病理学的条件下では [81]、恒常性のある血管周囲星状膠細胞は神経毒性表現型を採用する可能性があり [42]、溶質輸送に重要な水チャネル (アクアポリン 4) を調節できないなど、異常な基礎機能を持つ可能性があります。 [46、82]。病理学的条件下では、APOE は疾患関連アストロサイト (DAA) と呼ばれるアストロサイトで上方制御されます [41]。アミロイドーシスのマウスモデルからAPOE4を除去すると、雄マウスのGFAP反応性が低下する[48]一方、タウオパチーのマウスモデルにおける単核RNA配列決定により、CluやVimなどの多数のDAA遺伝子が減少することが明らかになった[49]。私たちの研究では、C3およびGfapを含む選択されたDAA遺伝子の減少も検出しました。これは、APOE4の除去が病的な星状細胞をより恒常性のある状態に戻し、何らかの形で脳血管系の保護とサポートを可能にする可能性があることを示唆しています。アストロサイトの形態学的分析から、アストロサイトのAPOE4欠乏の有無にかかわらず、これらのアストロサイトの状態を示す明らかな変化はマウスに見られませんでした。ただし、GFAP+ アストロサイトは、プラークと CAA に対して異なる反応を示すようです。 BBB関連アストロサイトに焦点を当てたさらなる研究は、疾患状況におけるそれらの役割と、この状態が一時的および/または可逆的であるかどうかを理解するために必要です。

APOE 療法は、AD や CAA を含む複数の神経変性疾患を標的とする新しい戦略として最近注目されています。とりわけ、APOE免疫療法[54、55、83]、アンチセンスオリゴヌクレオチド[84]、APOE模倣ペプチド[85、86]を含むいくつかの戦略は、脳血管系や末梢脂質に対する明白な悪影響を及ぼさずにアミロイドーシスの治療に前臨床の有望性を示している。ホメオスタシス。しかし、これらの研究のほとんどは、事実上すべての AD 患者で検出される神経病理学的特徴である CAA を患うマウスでは行われませんでした。今回の研究では、CAA/プラークの混合病態のマウスモデルにおいて、アストロサイトによって産生されるAPOEの主要な供給源を除去するとCAAが増加するが、神経突起性ジストロフィーを軽減し、CAA誘発性の血管損傷を改善することで保護が得られることが確認された。 APOE4 と CAA はどちらも AD 脳の損傷を悪化させることに関与していると考えられており [4]、APOE を調査する今後の研究では、ヒト Aβ の病態をより正確にモデル化するために、Aβ プラークに加えて CAA の使用と分析を組み込む必要があります。最近、私たちのグループは、アミロイド斑とCAAにのみ見られる非脂質化APOE4の形態を選択的に標的とする抗体を生成し[54]、その効果をAβ標的抗体と直接比較した。 CAAとプラークを発症する5XFAD/APOE4マウスにAβを標的とする抗体を投与したところ、CAAは減少せず、特定のAβ免疫療法に反応する主要な副作用である微小出血と強く相関するCAAの内側を覆うGFAP+星状細胞の増加が生じた。 [54]。対照的に、抗APOE抗体はCAAを減少させ、血管機能を改善したが、微小出血やCAAの内側を覆うGFAP+アストロサイトの増加をもたらさなかった[54]。我々の現在の発見を考慮すると、これらのGFAP+アストロサイトを遺伝学的または薬理学的に改変することで神経/血管の保護が得られ、Aβ抗体媒介の血管の副作用を軽減できるかどうかを判断することは、Aβ免疫療法の現在の課題に特に関連すると考えられます。血管の悪影響 (アミロイド関連の画像異常、ARIA) が多くの Aβ 標的抗体にとって大きな障害であることを考えると、これは解決すべき重要な問題です。

APOE4 と CAA は両方とも、共通かつ異なるメカニズムにより、血管機能不全の主要な危険因子です [87]。私たちの研究は、星状膠細胞のAPOE4産生を減少させることによってAPOE4の病態を軽減することで、BBB漏出性の改善や血管反応性の改善など、CAA関連の血管損傷を保護するのに十分であることを明らかにしました。 APOE4 を除去すると、CAA 関連星状細胞を含む星状細胞が病理学的状態から神経および血管を保護する生理学的状態に戻る可能性があります。これらの結果は、CAA および AD の治療に APOE を標的とした戦略を利用することに治療の可能性があることを示唆していますが、CAA の発症と血管機能に対する細胞特異的な APOE の寄与との間の複雑な関係を解明するには、さらなる追跡研究が必要です。

この研究の分析に使用される生成されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

5 家族性AD変異

アミロイドβ

アルツハイマー病

アミロイド前駆体タンパク質

アポリポプロテインE

アポリポプロテインJ

アミロイド関連の画像異常

脳アミロイド血管症

中枢神経系

脳脊髄液

疾患に関連するアストロサイト

酵素免疫測定法

グリア原線維性酸性タンパク質

イオン化カルシウム結合アダプター分子 1

間質液

腹腔内

リソソーム関連膜タンパク質 1

定量的ポリメラーゼ連鎖反応

平滑筋細胞

S-ニトロソ-N-アセチルペニシラミン

トリス緩衝生理食塩水

Attems J、Jellinger KA、Lintner F. アルツハイマー病の病理は、脳アミロイド血管症の重症度と地形的分布に影響を与えます。アクタニューロパトール。 2005;110:222–31。

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我々は、5XFAD (ライン 7031) マウスを贈ってくれた R. Vassar、マウスの手術に関する相談について神経疾患ホープセンターの動物外科コア、スクリプトについて M. Miracle、Aβ40 免疫蛍光プロトコルについて J. Jankowsky、Aβ40 免疫蛍光プロトコルについて D. Seo に感謝します。アストロサイトの形態学的分析に関するコンサルティング、およびゲノム分析についてはワシントン大学医学部遺伝学科のゲノムテクノロジーアクセスセンター。

この研究は、NIH 助成金 AG062027 (MX)、RF1NS090934 (DMH)、RF1AG047644 (DMH)、R01 NS034467 (DMH)、P01 AG078106 (DMH)、BrightFocus 財団 A2018128F (CW) および A2020257F (MG)、アルツハイマー病の治療によって支援されました。基金(DMH)、および JPB 財団 (DMH)。浜松 NanoZoomer デジタル病理学システムでスキャンされた画像は、ホープセンターアラフィ神経画像研究所のご厚意によるものです。

Monica Xiong、Chao Wang、Maud Gratuze も同様に貢献しました。

ワシントン大学医学部、ナイトアルツハイマー病研究センター、ホープ神経障害センター、神経内科、セントルイス、ミズーリ州、63110、米国

モニカ・ション、モード・グラトゥーズ、ファリーハ・サーディ、シン・バオ、ミーガン・E・ボッシュ、チュンヒ・リー、ホン・ジャン、ハビエル・レモリーナ・セラーノ、アーネスト・R・ゴンザレス、ミハル・キプニス、デヴィッド・M・ホルツマン

生物学および生物医学部門 (DBBS)、ワシントン大学医学部、セントルイス、ミズーリ州、63110、米国

モニカ・シオン

現在の住所: Genentech、1 DNA Way、South San Francisco、CA、94080、USA

モニカ・シオン

重慶医科大学脳科学疾患研究所、重慶、400016、中国

チャオ・ワン

現在の住所: 神経生理病理学研究所 (INP UMR7051)、CNRS、エクスマルセイユ大学、マルセイユ、13005、フランス

モード・グラトゥーズ

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MX と DMH がこの研究を考案し、設計しました。 MX、CW、MG、DMH がデータを分析しました。 MX、CW、MG がほとんどの実験を XB、FS、MEB、HJ、JRS、CL の支援を受けて行い、MKCW、MX、XB、JRS がタモキシフェン注射を行いました。 FS は星状細胞の形態学的分析を実行しました。 MX と ERG は血管機能の研究を実施しました。 MX と DMH は、共著者全員からの意見を取り入れて原稿を執筆しました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

デビッド M. ホルツマンへの通信。

適用できない。

MX は Genentech の従業員です。 DMH は、抗 APOE 抗体の治療的使用に関してワシントン大学から NextCure にライセンスされた特許の発明者です。 DMH は共同設立者であり、C2N Diagnostics の科学諮問委員会の委員を務めています。 DMH はデナリ、ジェネンテック、カハールニューロサイエンスの科学諮問委員会のメンバーであり、アレクターの顧問を務めています。他のすべての著者は、開示すべき競合する利益がないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

Cre発現の有無にかかわらず、マウスのAPOE4 mRNA発現およびタンパク質濃度に性差はありません。 a、皮質におけるベータアクチンに対して正規化されたAPOE mRNAの相対発現。 b、c、皮質からのELISAによって評価されたPBS可溶性およびグアニジン-HCL可溶性（「不溶性」）APOEタンパク質濃度。データは平均±SD、二元配置分散分析、すべての統計分析に対して実行されたシダックの多重比較検定として表されます。示されない限り、統計的な比較は有意ではありません。

Cre発現の有無にかかわらず、マウスのアミロイドまたはAβの病理に性差はありません。 a-c、生後 10 か月の 5X+AL- または生後2ヶ月で星状細胞APOE4除去後の5X+AL+マウス。 d〜f、海馬を覆う皮質の総Aβ-IR（d）、血管Aβ-IR（e）、およびプラーク（f）の面積カバー率を示すAβ免疫反応性（Aβ-IR）。データは平均±SD、二元配置分散分析、すべての統計分析に対して実行されたシダックの多重比較検定として表されます。示されない限り、統計的な比較は有意ではありません。

全体的なアミロイドには変化がないにもかかわらず、CAA が増加し、海馬台のアミロイド斑が減少しました。 a〜d、生後10か月の5X+AL-の背側台座における線維性プラーク/CAAのX34染色（a）と、合計X34プラーク（b）、CAA（c）、およびアミロイドプラークのカバー率（d）。または、生後2か月で星状細胞APOE4除去後の5X+AL + マウス。 e、合計 X34+ 染色における CAA の割合。スケールバー: 300 μm。 Δ=男性、○=女性。データは平均±SDとして表され、ウェルチのt検定が実行された(b)を除くすべての統計分析についてスチューデントのt検定(両側)が実行されました。 **P < 0.01、***P < 0.001。示されていない限り、他の統計的比較は重要ではありません。

CAA/プラークがある場合とない場合の皮質領域におけるタモキシフェンによる星状細胞APOE4の減少。 a、アミロイド斑/CAA、APOE、GFAP+ アストロサイト、および IBA1+ ミクログリアの X34 の代表的な画像。矢印: 星状細胞の APOE。矢印: ミクログリアの APOE。スケールバー: 50 μm。 b、CAA、プラークがある、またはCAA/プラークがない皮質領域におけるAPOE被覆率。 c、d、GFAP+星状細胞におけるAPOEの比（c）またはIBA1+（d）CAA/プラーク負荷に対して正規化されたミクログリア領域の範囲。 Δ=男性、○=女性。データは平均±SEMとして表され、(b – プラークなし、CAA、プラーク)、(c – プラークなし、CAA、プラーク)、(d – プラークなし) を除くすべての統計分析に対してスチューデントの t 検定 (両側) が実行されました。、CAA)、ウェルチの t 検定が実行されました。 *P < 0.05、**P < 0.01。示されていない限り、他の統計的比較は重要ではありません。

海馬台における GFAP+ 星状細胞の被覆率には変化なし。 a、b、星状細胞の GFAP 染色 (a) 2 か月目に星状細胞 APOE4 を除去した後の、生後 10 か月の 5X+AL- または 5X+AL + マウスの背側台座における総 GFAP 免疫反応性の面積カバー率 (b) -年齢の。スケールバー: 300 μm。 Δ=男性、○=女性。データは平均値 ± SD として表され、すべての統計分析に対してスチューデントの t 検定 (両側) が実行されました。示されない限り、統計的な比較は有意ではありません。

CAAまたはプラークに対するGFAP+アストロサイトの形態学的応答の特徴付け。 a、Simple Neurite Tracer を使用した、CAA またはアミロイド斑周囲の GFAP+ アストロサイトの代表的な再構成。 b〜f、GFAP +アストロサイトサイズの形態学的分析（凸包分析）（b）、突起の数（c）、突起の総長（d）、分岐点の数（e）、および平均突起長（f）。スケールバー: 50 μm。 Δ=男性、○=女性。データは平均±SD、二元配置分散分析、すべての統計分析に対して実行されたシダックの多重比較検定として表されます。 *P < 0.05、**P < 0.01。 ***P < 0.001。示されていない限り、他の統計的比較は重要ではありません。

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転載と許可

Xiong、M.、Wang、C.、Gratuze、M. 他。星状細胞の APOE4 除去により、脳アミロイド血管症の増加にもかかわらず、脳血管の保護が得られます。モル神経変性 18、17 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s13024-023-00610-x

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受信日: 2022 年 9 月 1 日

受理日: 2023 年 3 月 2 日

公開日: 2023 年 3 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13024-023-00610-x

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星状細胞のAPOE4除去により、脳アミロイド血管症の増加にもかかわらず脳血管の保護が得られる