IL年

Communications Biology volume 6、記事番号: 600 (2023) この記事を引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

過剰な炎症は、呼吸器ウイルス感染症における重篤な疾患や死亡の原因と考えられています。 重度のインフルエンザウイルス感染に応答して、CD4+ TCR トランスジェニック 6.5 マウスから養子移入されたナイーブ赤血球凝集素特異的 CD4+ T 細胞は、野生型マウスで IFN-γ 産生 Th1 応答を駆動します。 ウイルスの除去には役立ちますが、巻き添え被害や病気の悪化も引き起こします。 ドナー 6.5 マウスは、インフルエンザ血球凝集素に対する TCR 特異性を持つすべての CD4+ T 細胞を持っています。 それでも、感染した 6.5 マウスは激しい炎症や重大な結果に悩まされることはありません。 最初の Th1 応答は時間の経過とともに弱まり、最近の胸腺移住者の顕著な Th17 応答は炎症を軽減し、6.5 匹のマウスを保護します。 我々の結果は、ウイルス性ノイラミニダーゼ活性化されたTh1細胞のTGF-βがTh17の進化を導き、重症患者の肺炎症の緩和中に、非標準的なIL-17受容体EGFRを介したIL-17シグナル伝達がTRAF6よりも足場タンパク質TRAF4を活性化することを示唆している。インフルエンザ。

呼吸器ウイルスは深刻な新興感染症を引き起こします。 臨床転帰は、侵入するウイルスと宿主の免疫反応との相互作用によって決まります。 ウイルスの侵入は細胞変性効果を引き起こし、気道の組織損傷を引き起こします。 宿主の免疫系はウイルスを排除するために反応しますが、その反応は炎症にも寄与します。 ウイルスの除去によって免疫の活性化と炎症が軽減すると、感染者は感染から効率的に回復します。 ただし、免疫の活性化と炎症はウイルスの除去を超えて持続する可能性があります。 免疫活性化が長期間にわたって過剰に行われると、病気が悪化します。 季節性またはパンデミック性のインフルエンザウイルス感染症、SARS、MERS、および現在進行中の新型コロナウイルス感染症のパンデミックによる望ましくない結果がその例です1。 圧倒的な免疫反応による炎症の調節は、疾患管理における常に目標です。 肺の炎症を鎮めるために一般的に導入されている薬剤としてのコルチコステロイドも、重症インフルエンザ 2、3、4、5、SARS6、MERS7、および新型コロナウイルス感染症 19 患者に見られるように、炎症を抑制して病原体除去を阻害し、疾患を悪化させる可能性があります。

サイトカインを標的とすることは、炎症を抑制するためのもう 1 つの選択肢です。 トシリズマブとサリルマブはインターロイキン (IL)-6 を標的とし、新型コロナウイルス感染症患者を助ける可能性があります9。 IL-17 は、よく知られた炎症誘発性サイトカインでもあります10。 COVID-191、11、12、SARS13、MERS14、およびインフルエンザ 15 の重篤な疾患を患う患者の IL-17 レベルが高いため、IL-17 は操作のターゲットになる可能性があります 16。 我々は、重症の新型コロナウイルス感染症（COVID-1911）患者の血清からIL-17を検出し、また重症インフルエンザの実験マウスモデルの肺浸潤インフルエンザ抗原特異的CD4+ T細胞からもIL-17を検出した17,18。

私たちのインフルエンザ赤血球凝集素 (HA) 抗原特異的マウス モデルでは、インフルエンザ ウイルスが肺に養子移入されたナイーブ HA 特異的 CD4+ T 細胞の Th1 応答を駆動します 17、18、19、20、21、22。 養子移入された 2.5 × 106 個のドナー細胞はウイルスの除去に役立ちますが、肺の炎症を促進し、死亡率を高めます。 ドナーマウスである HA 特異的 CD4+ T 細胞受容体 (TCR) トランスジェニック 6.5 マウス 23 のインフルエンザウイルス感染は、これらのマウスのすべての CD4+ T 細胞の活性化を促進します。これは、ドナーマウスのすべての CD4+ T 細胞が、ドナーマウスの HA に特異的な TCR を持っているためです。インフルエンザウイルス。 感染した 6.5 マウスのすべての CD4+ T 細胞のこのような大規模な Th1 応答により、我々は重大な結果を期待しました。 最初はさらに体重が減りましたが、軽度の肺炎症を患いましたが、順調に回復しました。 マウスの回復は、6 日目と 9 日目の顕著な Th17 応答と関連していました。ここで、重症インフルエンザに対するマウスの防御における Th17 応答の役割を研究しました。 我々は、Th1 誘導による Th17 応答の進化を実証しました。 我々の結果は、ウイルスのノイラミニダーゼによって活性化されたTh1細胞のTGF-βがTh17の進化を誘導していることを示唆している。 非標準的な IL-17 受容体 EGFR を介した IL-17 シグナル伝達は、重症インフルエンザの肺炎症の緩和中に TRAF6 よりも足場タンパク質 TRAF4 を活性化します。

当社のインフルエンザヘマグルチニン (HA) 抗原特異的マウスモデル 17、18、19、20、21、22 では、野生型マウスに 6.5 ドナーマウスから 2.5 × 106 個のナイーブ HA 特異的 6.5 CD4+ T 細胞を養子移植しました (WT マウス + 6.5 細胞）、2.5 × 103 プラーク形成単位（pfu）の PR8 株の H1N1 インフルエンザ ウイルス感染を取得しました。 肺浸潤HA特異的6.5 CD4+ T細胞（ドナー6.5細胞）は、Th1転写因子T-betの誘導によりIFN-γを産生した（図1a）。 無視できる程度のTh17転写因子ROR-γtを伴う基本レベルのIL-17産生がありました（図1a、補足注記1、補足図1）。 養子移植により、インフルエンザウイルスに感染した野生型マウスの疾患が悪化した。 肺は炎症を起こし（図1b）、肺浸潤ドナー6.5細胞は6日目にエフェクター機能を獲得しました。これらの細胞は、in vitroでの同族ナイーブCD4+ T細胞のHAペプチド刺激による増殖を増強しました（図1b）。 プラークアッセイで明らかになったように、肺におけるウイルス量も3日目から9日目まで減少しました（図1c）。 マウスの体重は8日目まで減少し続け、8日目には一部のマウスが死亡し始めた(図1c)。

a-c HA 特異的 CD4+ TCR トランスジェニック 6.5 マウスにおける Th17 応答と肺炎症の軽減。 a 肺浸潤 HA 特異的 CD4+ T 細胞の Th1 および Th17 応答、b 上のパネル: 6 日目の肉眼的肺病理。 下のパネル: 肺または脾臓からの感染反応細胞を用いたインビトロでのナイーブ HA 特異的 CD4+ T 細胞増殖 (c) 肺におけるウイルス負荷、体重減少、および生存。 本文に記載されているように、野生型（WT）非トランスジェニックマウスに、感染を伴う 2.5 × 106 個のナイーブ HA 特異的 CD4+ T 細胞を養子移植し、対照として使用しました。 d TCRトランスジェニック6.5マウスにおけるIL-17欠損による生存利益の喪失。 感染した IL-17KO では、IL-17 コンピテント TCR トランスジェニック 6.5 マウスよりも肺浸潤 CD4+ および CD8+ T 細胞による炎症性サイトカイン分泌が多くなり、重度の体重減少と死亡率が見られます。 写真は代表的なもので、他の値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; NS 非有意、p > 0.05; 対応のない t 検定の両側 P 値特定の時点で 2 つのグループを比較します。体重曲線については二元配置分散分析、生存曲線については Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定を使用します)。

ナイーブ HA 特異的 6.5 CD4+ T 細胞のドナー マウスである 6.5 TCR トランスジェニック マウスは、CD4+ T 細胞上に単調な TCR を持ち、同じ α/β TCR が HA の MHC クラス II I-Ed 制限エピトープに応答します。 A/PR/8/34 (PR8) 株 H1N1 インフルエンザウイルス由来 23。 我々は、ドナー 6.5 マウスにおけるインフルエンザウイルス感染の重大な結果、感染した 6.5 マウスのすべての CD4+ T 細胞の大規模な Th1 応答を期待しました。 私たちの予想とは対照的に、IFN-γ産生を伴う顕著なTh1応答は、2.5×103 pfu PR8ウイルス感染後3日目のみに認められ、その後6日目と9日目には認められませんでした（図1a）。 6日目と9日目には、肺浸潤CD4+ T細胞の30〜50％でTh17転写因子ROR-γtが活性化され、そのうちの25〜40％が代わりにIL-17を産生した（図1a、補足注1、補足）図2）。 感染した6.5マウスは肺炎症の軽減を示し(図1b)、肺浸潤CD4+ T細胞は6日目に調節機能を獲得した。これらの細胞は、インビトロでHAペプチド刺激によるナイーブ同族CD4+ T細胞の増殖を抑制した(図1b)。 。 感染した 6.5 匹のマウスは 3 日目に体重が大幅に減少しました。体重減少から回復し、すべてのマウスが感染を乗り越えました (図 1c)。 9日目には肺に生きたウイルスは存在しませんでした（図1c）。

IL-17 (インターロイキン-17A) は、多くの炎症性疾患の発症に寄与する炎症誘発性サイトカインであることがよく知られています 11、12、13、14、15、16。 しかし、感染した 6.5 マウスでは、肺浸潤 CD4+ T 細胞の顕著な IL-17 応答が肺炎症の軽減と関連しています。 IL-17 ノックアウト (KO) 6.5 マウスでは、肺の炎症の軽減とインフルエンザ ウイルス感染からの保護が失われていました。 2.5 × 103 pfu PR8 インフルエンザ ウイルスにより、IL-17KO 6.5 マウスは重篤な疾患を引き起こしました。 肺浸潤性IL-17KO CD4+およびCD8+ T細胞は、6日目により多くの炎症性サイトカインIFN-γおよびTNF-αを産生しました（図1d）。

活性化された CD4+ T 細胞は最初に拡大し、続いて細胞のプールが収縮します。 養子移入されたナイーブ HA 特異的 6.5 CD4+ T 細胞のインフルエンザ ウイルスによる活性化も、我々の実験中、感染した野生型マウス (WT マウス + 6.5 細胞) において同様の傾向をたどりました。 ドナー 6.5 細胞プールは、野生型マウスの肺内で最初に膨張し、その後収縮しました (図 2a)。 対照的に、感染した 6.5 匹のマウスでは肺浸潤 CD4+ T 細胞集団が最初の 4 日間で減少しました。 その後増加し始め、感染後 11 日目までに感染前のレベルに戻りました (図 2a)。 新たな胸腺移民である6.5匹のマウスの胸腺からの細胞は、肺浸潤CD4+ T細胞の集団を補充する可能性がある。 したがって、感染した 6.5 マウスの肺浸潤 CD4+ T 細胞の CD24 および Qa2 発現プロファイルをテストしました。 成熟した胸腺細胞は、高レベルの CD24 と最小限の Qa2 を発現することが知られています。 CD4+ または CD8+ T 細胞は、末梢に放出された後、時間の経過とともに CD24 を失い、Qa2 発現を獲得します 24。 感染した6.5マウスの肺浸潤CD4+ T細胞では、6日目にIL-17産生細胞の表面でIFN-γ産生細胞よりも高いCD24発現と低いQa2発現が見つかりました（図2a）。

a 最近の胸腺移民は、6.5 マウスの感染肺においてより多くの IL-17 を分泌し、より少ない IFN-γ を分泌します。左パネル: 感染 6.5 マウスにおける肺浸潤 HA 特異的 CD4+ T 細胞集団動態。 本文で説明されているように、養子移入された細胞を持つ WT マウスはコントロールとして機能しました。 中央および右パネル：感染した6.5マウスにおけるIL-17またはIFN-γ産生肺浸潤CD4+ T細胞のCD24およびQa2発現プロファイル。 b-d 胸腺切除により最近の胸腺移住者の供給がなくなり、胸腺切除された 6.5 マウスは IL-17 産生が減少する重篤な疾患に苦しむ: b ROR-γt および T-bet による肺浸潤 HA- の誘導による IL-17 および IFN-γ 産生特異的 CD4+ T 細胞および c 7 日目の肺内のウイルス量。 d 感染後の体重減少。 胸腺摘出されていない6.5マウスを対照として使用した。 本文で説明されているように、養子移入された細胞を持つ WT マウスは、別の対照マウスのグループとして機能しました。 ヒストグラムとドットプロットは代表値であり、他の値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; 2 つのグループを一度に比較するための対応のない t 検定の両側 P 値)特定の時点、体重曲線の二元配置分散分析)。

感染した 6.5 マウスの肺における IL-17 の供給源として最近の胸腺移民を示唆する上記の発見を検証するために、我々は生後 2 週間の 6.5 マウスで胸腺切除を行い、感染から 2 週間回復した後に胸腺切除した 6.5 マウスに感染させました。手術。 胸腺摘出術は、胸腺を外科的に除去することです。 したがって、胸腺移民の供給が廃止される。 2.5×103 pfuのPR8インフルエンザウイルス感染後、胸腺摘出6.5マウスでは7日目に肺浸潤CD4+ T細胞におけるROR-γt誘導とIL-17産生が減少しました（図2b）。 IFN-γ産生細胞の割合は胸腺摘出によって変化せず、この時点までに胸腺摘出マウスおよび胸腺摘出なしの6.5マウスの肺浸潤CD4+ T細胞の約15％がIFN-γを産生した（図2b）。 その結果、胸腺切除により、感染した6.5マウスのIL-17優勢が消失し、IL-17とIFN-γの間の分布が、感染した野生型マウスのドナー6.5細胞の分布と同様のパターンに戻りました（図2b）。 この変化したTh応答により、胸腺摘出により肺内のウイルス量が増加し（図2c）、感染した6.5マウスでは体重減少が増加して疾患が悪化しました（図2d）。 これらの結果は、Th17 が感染した 6.5 マウスにおける最近の胸腺移民の防御反応であることを示唆する我々の発見を裏付けるものである。

胸腺退縮は、年齢とともに胸腺移入者の供給の減少を引き起こします。 野生型マウスと同様に、生後 4 週間の 6.5 マウスには約 5,000 万個の胸腺細胞がありました。 その数は、生後8週齢の6.5マウスでは4000万匹、生後12週目の6.5マウスでは2000万匹に減少した。 40週齢の6.5マウスには胸腺細胞が1,000万個しかありませんでした（図3a）。 さらに、年齢とともにCD3+胸腺細胞中のCD4+CD8+二重陽性細胞が減少しました（図3b）。 6.5 歳のマウスでは、6.5 歳の若いマウスに比べて、インフルエンザ ウイルス感染によって誘発される Th17 反応が減少しました。 2.5×103 pfuのPR8インフルエンザウイルス感染後7日目に、4週齢または8週齢の6.5マウスにおいて、肺浸潤CD4+ T細胞の約30％がIL-17を産生した。 この数は、12週齢の6.5マウスでは20％未満に減少し、40週齢の6.5マウスでは約10％に減少しました（図3c、d）。 ただし、IFN-γ産生細胞の割合は年齢とともに変化せず、4〜40週齢の6.5マウスでは約10〜12％の肺浸潤CD4+ T細胞がIFN-γを産生しました（図3c、d）。 。 IFN-γ産生細胞の割合は年齢とともに変化しないため、IFN-γ産生に対するIL-17の優位性も年齢とともに減少しました（図3e）。 感染後7日目の肺内のウイルス量は、若い6.5マウスよりも老齢マウスの方が高かった(図3f)。 老齢の 6.5 マウスは若い 6.5 マウスよりも重篤な疾患を患っており、体重減少の回復が遅れていました (図 3g)。

a 胸腺細胞数および b 記載の年齢の健康な非感染の 6.5 マウスにおける CD3+ 胸腺細胞中の CD4+CD8+ 細胞の割合。 c ドットプロットおよび d 棒グラフは、感染後 7 日目の年齢 6.5 マウスの肺浸潤 HA 特異的 CD4+ T 細胞の IL-17 応答の低下と維持された IFN-γ 応答を示します。 e 感染後7日目の6.5歳マウスの肺浸潤HA特異的CD4+ T細胞のIFN-γ応答に対するIL-17応答の優位性の喪失。 f 感染後 7 日目の肺内のウイルス量の増加、および g 感染した 6.5 マウスの加齢に伴う体重減少の回復の遅れ。 ドットプロットは代表値であり、他の値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; *p < 0.01; NS 非有意、p > 0.05; 両側 P特定の時点で 2 つのグループを比較する対応のない t 検定の値、体重曲線の二元配置分散分析)。

我々は、ナイーブHA特異的6.5 CD4 + T細胞を感染野生型マウス（WTマウス+6.5細胞の2バッチ）に2回養子移入する実験を考案し、6.5マウスにおける連続的な胸腺遊走を模倣しました（図4a）。 野生型マウスの肺では、感染とともに移入されたドナー6.5細胞はIFN-γ産生Th1細胞に分化し、4日後に移入されたドナー6.5細胞は感染後8日目にIL-17産生Th17細胞に分化した（図） . 4a–c、補足注記 2、補足図 3)。 最初の転移に由来する Th1 細胞の存在下では、2 番目の転移細胞の 30% が IL-17 を産生し、IFN-γ を産生したのは 2% 未満にすぎませんでした。 IL-17産生細胞の約5％はIFN-γも産生しました（図4d）。 2 回目の転移細胞は、1 回目の転移細胞の表現型も改変しました。 感染後8日目にはIFN-γ産生が40%減少した(図4d)。 単一移入対照（WT マウス + 単一バッチ 6.5 細胞）では、感染とともに、または感染後 4 日目に移入されたドナー 6.5 細胞は、野生型マウスの肺において感染後 8 日目の顕著な IFN-γ 産生 Th1 細胞でした。 。 感染とともに移入された細胞と比較して、移入４日目の細胞では、ＩＦＮ－γ産生のわずかな減少およびＩＬ－１７産生のわずかな増加のみがあった。 (図4)。

a 左のパネル:本文に記載されている、感染野生型マウスにおける 2 バッチのナイーブ HA 特異的 CD4+ T 細胞養子移植実験の概略図。 右パネル: 2 バッチ細胞導入による感染野生型マウスの肺における、第 1 バッチ細胞の存在下での第 2 バッチ細胞の Th17 応答。 b シングルバッチまたは 2 バッチ HA 特異的 CD4+ T 細胞移入による感染野生型マウスの肺における 8 日目の第 1 および第 2 バッチ細胞の IL-17 および c IFN-γ 産生。 d 養子移入された第1バッチHA特異的CD4+ T細胞の存在下または非存在下での、8日目のIL-17産生第2バッチHA特異的CD4+ T細胞によるIFN-γの共産生。 e この時点までの第2バッチ細胞の存在下または非存在下での、IL-17産生第1バッチHA特異的CD4+ T細胞によるIFN-γの同時産生。 ドットプロットは代表値であり、他の値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; *p < 0.01; NS 非有意、p > 0.05; 両側 P対応のない t 検定の値)。

ナイーブ HA 特異的 6.5 CD4+ T 細胞 (WT マウス + 2 バッチの 6.5 細胞) を 2 回養子移植した野生型マウスの実験では、2 回目の移植ドナー 6.5 細胞の IL-17 産生 Th17 応答が関連していたROR-γtに対するT-betの優位性が減少しました（図5a、b）。 両方の転移のドナー6.5細胞において、ZAP-70リン酸化から特徴的なTh1転写因子T-betの誘導まで、同等のTCRシグナル伝達が存在した（図5c）。 実質的なＴ－ｂｅｔ誘導により、２回目の導入のドナー６．５細胞において、Ｔｈ１７関連転写因子ＲＯＲ－γｔの強力な活性化があった（図５ｄ）。 2回目の移植のドナー6.5細胞は、ROR-γtに対するT-betの優勢性を低下させて、IFN-γの代わりにIL-17を産生しました（図5b-d）。 さらに、2回目の移植のドナー6.5細胞では、誘導された制御性T（iTreg）細胞マーカーLAG-3のより高い発現が見られました（図5e）。

a 概略図とTh17応答。 b 感染野生型マウスにおける2バッチのナイーブHA特異的CD4+ T細胞養子移植実験において、第2バッチのドナー細胞のROR-γtよりもT-betの優位性が低下した。 c 感染後8日目の肺の第1バッチTh1細胞および第2バッチTh17細胞におけるZAP70リン酸化からT-bet誘導までのTCRシグナル伝達の同等の強度。 数字は、記載された分子の MFI (平均蛍光強度) を表します。 d 8日目の第1バッチのドナー細胞と比較して、第2バッチのROR-γt活性化が高く、Foxp-3+集団サイズが変化していない。 e 第2バッチの表面上で、8日目に比べてiTregマーカーLAG-3の発現が高い。この時点までに最初のバッチのドナー細胞が完成します。 f 2 バッチのナイーブ HA 特異的 CD4 + T 細胞養子移入を行った感染野生型マウスは、単一バッチの同族細胞移入を行ったマウスよりも体重減少の回復が促進され、生存率が向上しました。 g 肺切片の肉眼的肺病理および病理学的スコア、h 単一バッチの同族細胞移入を行ったマウスと比較した、2バッチのナイーブHA特異的CD4+ T細胞養子移入を行った感染野生型マウスの肺におけるウイルス負荷。 写真、ヒストグラムおよびドットプロットは代表的なものであり、他の値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; **p < 0.001; *p < 0.01; NS 非有意、p > 0.05; 特定の時点で 2 つのグループを比較する対応のない t 検定の両側 P 値、体重曲線の場合は二元配置分散分析、生存曲線の場合は Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定）。

ドナー6.5細胞の2回の養子移入は、ドナー6.5細胞のみを1回移入したマウスと比較して、レシピエント野生型マウスが感染からより効率的に回復し、生存率が向上しました（図5f）。 感染後8日目には病理が減少し（図5g）、肺内のウイルス量が減少し（図5h）、防御が改善されました。

我々は、2 回目の養子移入でナイーブ IL-17KO 6.5 マウスからのドナー 6.5 細胞を使用することにより、2 回の養子移入実験における第 2 バッチ細胞からの IL-17 の保護的役割をさらに定義しました ((WT マウス + 第 1 バッチ 6.5 細胞 + 2 番目のバッチ IL-17KO 6.5 細胞; 図 6a). 2 回目の移入細胞を IL-17KO ドナー 6.5 細胞に置き換えると、IL-17 コンピテントドナー 6.5 細胞の 2 回の移入による保護が無効になりました (図 6b)。ドナーIL-17KO 6.5細胞（図6c）では、マウスはIL-17が少なく（図6d、f）、両方の移入のドナー6.5細胞でより多くの炎症性IFN-γ産生があり、より高い死亡率を伴う悪化した疾患に悩まされました（図6e、f)。

a 概略図および b は、感染した野生型マウスでの 2 バッチ養子移入実験の保護を失い、2 番目のバッチでナイーブ IL-17KO HA 特異的 CD4+ T 細胞を養子移入しました。 c IL-17KOまたはIL-17コンピテント第2バッチ細胞を用いた、2バッチのナイーブHA特異的CD4+ T細胞導入実験における、感染した野生型マウスの肺における8日目のウイルス負荷。 d 第 1 バッチ細胞による IL-17 産生は変化せず、e 第 2 バッチのナイーブ IL-17KO HA 特異的 CD4+ T 細胞移入により、第 1 バッチ細胞と第 2 バッチ細胞の両方による IFN-γ 産生が増加しました。 f 第 2 バッチのナイーブ IL-17 コンピテントまたは IL-17KO HA 特異的 CD4 + T 細胞移入による、第 1 および第 2 バッチの細胞の両方による IL-17 および IFN-γ 産生の代表的なドットプロット。 値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; *p < 0.01; NS 非有意、p > 0.05; 比較するための対応のない t 検定の両側 P 値特定の時点での 2 つのグループと生存曲線の Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定)。

PR8 インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼは、HA 特異的 CD4+ T 細胞の TGF-β を活性化します 18、TGF-β は、in vitro での Th17 極性化に不可欠なサイトカインです 25。 ナイーブ HA 特異的 6.5 CD4+ T 細胞を野生型マウス (WT マウス + 6.5 細胞) に養子移入し、マウスに 2.5 × 103 pfu の PR8 ウイルスを感染させました。 肺浸潤ドナー6.5細胞は、野生型マウスにおける感染後4日目にTGF-βを活性化した(図7a)。 それらは、インビトロでのナイーブ 6.5 CD4+ T 細胞との共培養のために、その時点でレシピエントマウスから回収されました。 共培養しない場合、ナイーブ 6.5 CD4+ T 細胞は Th1 細胞であり、それらの 16% がインビトロで PR8 ウイルスによる 48 時間の刺激後に IFN-γ を産生しました。 4 日目の肺浸潤ドナー 6.5 細胞と共培養すると、ナイーブ 6.5 CD4+ T 細胞は Th17 細胞に偏りました。 それらの約20％がIL-17を産生し、そのうちのわずか7％がIFN-γを産生しました（図7b）。 組換えマウスTGF-βは増強され、抗TGF-β抗体は6.5 CD4+ T細胞のIL-17産生を減弱させた（図7c）。 HA を保有するワクシニア ウイルス (Vac-HA) は、養子移入された HA 特異的ナイーブ 6.5 CD4+ T 細胞を in vivo で PR8 インフルエンザ ウイルスと同等の振幅まで活性化しました。 Vac-HA にはノイラミニダーゼがないため、ドナー 6.5 細胞は活性化 TGF-β を受けませんでした。 4日目にレシピエントマウスから回収した後、これらのVac-HA活性化肺浸潤ドナー6.5細胞は、インビトロ培養においてTh1細胞をTh17細胞に偏らせなかった（図7）。

HA 特異的 CD4+ T 細胞における TGF-β の活性化は、インフルエンザ ウイルスによるものですが、HA 挿入ワクシニア (Vac-HA) ウイルスによるものではありません。 上のパネル: HA 特異的 TCR トランスジェニック 6.5 マウスの脾細胞をインフルエンザまたは Vac-HA ウイルスで一晩刺激しました。 下のパネル: 野生型マウスに、インフルエンザまたは Vac-HA ウイルス感染によるナイーブ HA 特異的 CD4+ T 細胞の養子移植を受け、4 日目に肺細胞を分析しました。 b 4 日目の肺細胞を、HA 特異的細胞からのナイーブ脾細胞と混合しました。 TCRトランスジェニック6.5マウスをインビトロでインフルエンザウイルスで48時間刺激した。 c 組換えマウス TGF-β を追加すると、共培養中の HA 特異的 CD4+ T 細胞による IL-17 産生が増強され、抗マウス TGF-β 抗体により IL-17 産生が減弱しました。 ヒストグラムやドットプロットが代表的です。

我々の以前のレポートでは、IL-1018 の非存在下で HA 特異的 CD4+ T 細胞の TGF-β 活性化が増強されることを実証しました。 ここでは、IL-10KO ドナー 6.5 細胞の IL-10KO マウスへの 2 回の移植 (IL-10KO マウス + 2 バッチの IL-10KO 6.5 細胞; IL-10KO セット) を試みました。1 回目は PR8 インフルエンザウイルス感染を伴う移植で、2 回目は PR8 インフルエンザウイルス感染を伴う移植でした。感染後4日目に転移。 IL-10コンピテントドナー6.5細胞の野生型マウスへの2回の移入（WTマウス+6.5細胞の2バッチ; WTセット）は、対照として機能した（図8a、補足注記3、補足図4）。 IL-10を含まないIL-10KO設定での最初の導入のIL-10KOドナー6.5細胞では、IL-10ありのWT設定での最初の導入のIL-10コンピテントドナー6.5細胞と比較して、より高い活性型TGF-βが存在した。 IL-10 (図8b)。 さらに、WT設定での2回目の移入のIL-10コンピテントドナー6.5細胞と比較して、IL-10を含まないIL-10KO設定での2回目の移入のIL-10KOドナー6.5細胞では、より高いIL-17が存在した。 IL-10を使用。 感染後8日目には、IL-10の非存在下では二次転移細胞の約60％がIL-17を産生したのに対し、IL-10ありの設定では25％であった（図8c）。二次転移細胞は、IL-10KO マウスのインフルエンザウイルス感染に対する防御に関連していました（補足注記3、補足図4）。

a – c IL-10の非存在下での2バッチ養子移植実験。 a 概略図:ナイーブ IL-10KO HA 特異的 CD4+ T 細胞を、感染後 0 日目と 4 日目に IL-10KO マウスに養子移入しました (IL-10KO セット)。 IL-10コンピテントHA特異的CD4+ T細胞を感染させたWTマウス(WTセット)を対照として用いた。 b 第 1 バッチ IL-10KO ドナー細胞のより多くの TGF-β、および c 8 日目に設定した IL-10KO における第 2 バッチ IL-10KO ドナー細胞の Th17 応答の増強。 d、e 野生型における 2 バッチ養子移植実験。 HA 挿入ワクシニア (Vac-HA) ウイルス感染型マウス。 d Vac-HA感染マウスでは第2バッチのドナー細胞はTh17応答を示さなかった。 ヒストグラムおよびドットプロットは代表値であり、他の値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; 対応のない t 検定の両側 P 値)。

次に、PR8インフルエンザウイルス感染の代わりにHA挿入ワクシニアウイルス（Vac-HA）を使用して、WT設定（WTマウス+6.5細胞の2バッチ）で同様の2回転移実験を実行しました（図8d）。 感染を伴って移入され、4日目に移入された両方の移入のドナー6.5細胞は、最初の移入ドナー6.5細胞に活性型TGF-βが存在しないことから予想されるように、Vac-HA感染によってTh1表現型に活性化された（図1）。 8e)。

有名な受容体 IL-17RA を介した IL-17 シグナル伝達は、炎症に寄与します 26。 上皮成長因子受容体 (EGFR; ErbB-1; HER1) は、IL-17 の非標準的な受容体として記載されています。 EGFR による IL-17 シグナル伝達は、創傷治癒過程に関与することが実証されています 27。 6.5 匹のマウスに 2.5 × 103 pfu の PR8 株のインフルエンザウイルスを感染させました。 野生型マウスには感染を伴うナイーブ 6.5 ドナー細胞の養子移入を受け (WT マウス + 6.5 細胞; WT セット)、IL-17KO マウスには感染を伴うナイーブ IL-17KO 6.5 ドナー細胞の養子移入を受けました (IL-17KO マウス) + IL-17KO 6.5 細胞; IL-17KO セット)。 インフルエンザウイルス感染後の 6.5 匹のマウスでは、肺浸潤 CD4+ T 細胞で IL-17RA と EGFR の両方の上方制御が見られました。 IL-17RAは感染後3日目にのみ上方制御されましたが、それ以降は上方制御されませんでした。 EGFRは、感染後3日目から6日目および9日目まで徐々に上方制御された(図9a)。 EGFRは、感染後6日目から9日目まで細胞表面上でIL-17RAよりも豊富であった(図9b)。 IL-17RAおよびEGFRの上方制御は、それぞれWTセットおよびIL-17KOセットの肺浸潤ドナー6.5細胞およびIL-17KO 6.5細胞にも存在した（図9a、b、補足注記4、補足図5）。 。 しかし、WTセットでは6日目には肺浸潤CD4+ T細胞表面上でIL-17RAよりもEGFRが優勢であったが、9日目には優勢ではなかった。 IL-17KOセットでは6日目および9日目にIL-17RAに対するEGFRの優位性はなかった(図9b)。

a 感染したTCRトランスジェニック6.5マウス、野生型マウスおよびIL-17KOマウスにおける肺浸潤CD4+ T細胞の表面におけるEGFRおよびIL-17RAの発現。 非感染の健康なマウス（ナイーブ）を対照として使用した。 棒グラフは、これらのマウスにおける感染後の経時的な EGFR および IL-17RA 発現の上方制御または下方制御を示します。 b 6.5匹のマウスにおける感染後6日目および9日目の肺浸潤CD4+ T細胞の表面におけるIL-17RAよりもEGFRの量。 c 6日および9日目の感染6.5マウスにおける肺浸潤CD4+ T細胞のEGFRリン酸化の増加。d〜e in vitroで0.03 MOI PR8ウイルスによる48時間の刺激後の6.5 CD4+ T細胞におけるEGFRリン酸化。 ナイーブ IL-17 コンピテントマウスおよび IL-17KO 6.5 マウスの脾細胞を刺激し、野生型マウスの脾細胞を対照として使用しました。 本文に記載されているように、マウス組換え IL-17 (0.1 または 1.0 μg/ml) またはゲフィチニブ (1.0 μM) を培養条件に追加しました。 f 感染した野生型マウスおよびIL-17KOマウスの肺におけるTRAF4に対するTRAF6の優勢とは対照的に、感染した6.5マウスの肺におけるTRAF6に対するTRAF4の優勢は、肺浸潤CD4+ T細胞およびIL-17KOマウスのmRNAレベルによって決定される。テキストで説明されています。 g in vitroで0.03 MOI PR8ウイルスで48時間刺激した後の6.5 CD4+ T細胞におけるTRAF4の細胞内染色。 ナイーブ IL-17 コンピテントマウスおよび IL-17KO 6.5 マウスの脾細胞を刺激し、野生型マウスの脾細胞を対照として使用しました。 本文に記載されているように、マウス組換え IL-17 (0.1 または 1.0 μg/ml) またはゲフィチニブ (1.0 μM) を培養条件に追加しました。 h インビトロで0.03 MOI PR8ウイルスで48時間刺激した後の、6.5、IL-17KO 6.5、および野生型CD4+ T細胞におけるEGFRとTRAF4の共局在。 ヒストグラムと写真は代表値であり、他の値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です。 (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; NS 非有意、p > 0.05; 対応のない t 検定の両側 P 値)。

感染した 6.5 マウスの肺浸潤 CD4+ T 細胞の表面には豊富な EGFR があり、これは 6 日目および 3 日目よりも 9 日目の EGFR のより高いリン酸化と関連していました。対照的に、塩基レベルのリン酸化 EGFR のみが検出されました。肺浸潤ドナーのＷＴセットの６．５細胞と、３日目、６日目、および９日目のＩＬ－１７ＫＯセットのドナーＩＬ－１７ＫＯ細胞において（図９ｃ）。 ナイーブ 6.5 マウス、IL-17KO 6.5 マウス、または WT マウスの脾細胞を 0.03 MOI のインフルエンザ ウイルスで 48 時間 in vitro で刺激すると、IL-17KO 6.5 CD4+ T 細胞よりも 6.5 CD4+ T 細胞の EGFR リン酸化が多く見られました。図9d)。 IL-17サプリメントは、IL-17KO 6.5 CD4+ T細胞のEGFRリン酸化を用量依存的に増強し、0.1μg/mlよりも1.0μg/mlの組換えマウスIL-17でさらに増強した（図9e）。 EGFR阻害剤ゲフィチニブは、6.5 CD4+ T細胞のEGFRリン酸化およびIL-17KO 6.5 CD4+ T細胞のIL-17誘導性EGFRリン酸化を緩和した（図9e）。 ナイーブWTマウスからの野生型CD4+ T細胞は対照として機能し、IL-17サプリメントはEGFRリン酸化を増強し、ゲフィチニブはEGFRリン酸化を減弱させた（図9e）。

7 つの足場タンパク質の腫瘍壊死因子受容体関連因子 (TRAF) ファミリー (TRAF 1 ～ 7) は、さまざまな細胞の生理学的プロセスに関与しています 28。 TRAF はアダプター分子として、多くのシグナル伝達経路を調節します。 TRAF4 と TRAF6 は同じ TRAF 結合部位を共有しますが、病因において異なる役割を果たします 29,30。 6日目の肺細胞のリアルタイム定量的逆転写PCR研究により、感染した6.5マウスにおけるTRAF4およびTRAF6の上方制御が明らかになった。 感染した6.5マウスの肺浸潤CD4+ T細胞では、TRAF4がTRAF6よりも優勢であった（図9f）。 対照的に、感染野生型マウスの肺浸潤ドナー 6.5 CD4+ T 細胞 (WT マウス + 6.5 細胞; WT セット) または感染 IL-17KO マウス (IL) のドナー IL-17KO 6.5 CD4+ T 細胞では、TRAF6 が TRAF4 よりも優勢でした。 -17KOマウス+IL-17KO 6.5細胞;IL-17KOセット;図9f)。 同様のインビトロ刺激により、上記のように、フローサイトメトリーにより、IL-17KO 6.5 CD4+ T細胞よりも6.5におけるTRAF4タンパク質の上方制御が明らかになった（図9g）。 IL-17サプリメントは、IL-17KO 6.5 CD4+ T細胞におけるTRAF4の上方制御を用量依存的に増強し、0.1μg/mlよりも1.0μg/mlの組換えマウスIL-17でさらに増強した（図9g）。 EGFR阻害剤ゲフィチニブは、6.5 CD4+ T細胞におけるTRAF4アップレギュレーション、およびIL-17KO 6.5 CD4+ T細胞におけるIL-17誘導性のTRAF4アップレギュレーションを緩和しました（図9g）。 ナイーブWTマウスからの野生型CD4+ T細胞は対照として機能し、IL-17サプリメントはTRAF4アップレギュレーションを増強し、ゲフィチニブはTRAF4アップレギュレーションを減弱させた（図9g）。

共焦点顕微鏡により、インビトロで0.03 MOIのインフルエンザウイルスによるナイーブ6.5マウスの脾細胞の48時間刺激により、6.5 CD4+ T細胞におけるEGFRシグナル伝達複合体へのTRAF4の転座が明らかになった（図9h）。 TRAF4 と EGFR の共局在は、IL-17KO 6.5 CD4+ T 細胞よりも 6.5 CD4+ T 細胞においてより顕著でした。 IL-17サプリメントは、刺激されたIL-17KO 6.5 CD4+ T細胞におけるTRAF4とEGFRの共局在を増強しました（図9h）。 EGFR阻害剤ゲフィチニブは、6.5 CD4+ T細胞におけるTRAF4とEGFRの共局在、およびIL-17KO 6.5 CD4+ T細胞におけるIL-17誘導性のTRAF4とEGFRの共局在を緩和した（図9h）。

ゲフィチニブは、標的細胞の上皮成長因子受容体 (EGFR) を介したシグナル伝達を遮断する EGFR 阻害剤です。 ゲフィチニブはマウスのインフルエンザウイルス感染症を悪化させた。 ゲフィチニブによるEGFR阻害の影響は、感染6.5マウスで最も高く、感染野生型マウスで中等度であり、感染IL-17KOマウスでは無視できるほどであった(図10a)。 感染した野生型マウスでは、鼻腔内IL-17サプリメントによりある程度の防御が得られたが、ゲフィチニブの治療により防御は失われた(図10b)。 利益の損失は、肺におけるTRAF4およびTRAF6の上方制御の変化に関連していた。 IL-17サプリメントは、感染した野生型マウスの肺におけるTRAF4に対するTRAF6の優位性を変化させ、ゲフィチニブ治療とともにIL-17サプリメントを与えた場合、変化は制限された(図10b)。

ゲフィチニブによるEGFR阻害は、インフルエンザウイルスに感染した6.5匹のマウスの体重減少と死亡率の増加をもたらした。 感染した野生型マウスとIL-17KOマウスを対照として使用した。 b ゲフィチニブ治療は、IL-17 サプリメントによってもたらされる防御も低下させ、感染した野生型マウスの体重減少と死亡率の増加をもたらしました。 この変化は、TRAF6 mRNA レベルに対する TRAF4 の優位性の変化と関連していました。 値は少なくとも 3 回の実験の平均値 ± SD です。 (n = 6/グループ; ***p < 0.0001; NS 非有意、p > 0.05; 特定の時点で 2 つのグループを比較する対応のない t 検定の両側 P 値、体重の二元配置分散分析曲線、および生存曲線については Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定)。

今回我々は、インフルエンザウイルスによって活性化されたTh1細胞のTGF-βが、最近の胸腺移民のTh17進化を導くことを実証した。 非標準的な IL-17 受容体 EGFR を介した IL-17 シグナル伝達は、重症インフルエンザの肺炎症の緩和中に TRAF6 よりも足場タンパク質 TRAF4 を活性化します。 養子移入された HA 特異的 6.5 CD4+ T 細胞は、野生型マウスの感染に対する IFN-γ 産生 Th1 応答により付随的な損傷を引き起こしました。 ナイーブ HA 特異的 6.5 CD4+ T 細胞のドナー マウス、6.5 TCR トランスジェニック マウスは、インフルエンザ ウイルスの HA 抗原に応答するすべての CD4+ T 細胞を持っています。 感染した 6.5 マウスにおける圧倒的な CD4+ T 細胞応答は、より多くの損傷とより重篤な疾患を引き起こす可能性があります。 最初は病気の悪化がありましたが、その後の顕著な Th17 応答の進化により病気は軽減され、6.5 マウスは野生型マウスよりも生存率が高くなりました。 Th1 および Th17 CD4+ T 細胞は両方とも、ZAP-70 リン酸化から T-bet 誘導までの同等の TCR シグナル伝達により、Th1 コミットメントに関して活性化されました。 Th17 の進化は ROR-γt の上方制御と関連しており、ROR-γt に対する T-bet の優勢性が減少しました。 胸腺摘出術、高齢マウスの実験、および反復的な養子移植実験により、Th1細胞上のウイルスノイラミニダーゼ活性化TGF-βと関連して、Th1 CD4+ T細胞がTh17進化を誘導することが明らかになった。 6.5 匹の CD4+ TCR トランスジェニック マウスでは、EGFR を介した IL-17 シグナル伝達が、IL-17RA に対して相対的に豊富な EGFR で起こりました。 このシグナル伝達は、足場タンパク質 TRAF4 を TRAF6 よりも活性化します。 ゲフィチニブの遮断は、重度のインフルエンザにおける肺炎症の軽減におけるEGFRを介したIL-17シグナル伝達の重要性を実証した。

IFNγ と IL-17 は両方とも、肺炎を伴う重症インフルエンザにおけるサイトカインストームの基本的な構成要素です 31。 IFN-γ は、ウイルス除去に不可欠な特徴的な Th1 サイトカインです 32。 私たちの実験系では、肺浸潤 HA 特異的 CD4+ T 細胞が感染に応答して IFN-γ を産生します 17,18。 転写因子 T-bet は、Th1 系統および IFN-γ 産生への関与を指示します 33,34。 ここで我々は、Th17 の進化の前に、ZAP-70 リン酸化から T-bet 誘導まで同等の強度の TCR シグナル伝達を伴う Th1 コミットメントも存在することを発見しました。 TGF-β は、インビトロでのナイーブ CD4+ T 細胞の Th17 極性化に不可欠です 25。 われわれは、Th1 CD4+ T細胞のウイルスノイラミニダーゼ活性化TGF-βがTh1誘導進化のTh17細胞に必須であることを明らかにした。 Th1 CD4+ T 細胞は、Th17 特異的転写因子 ROR-γt の活性化と Th17 特異的サイトカイン IL-17 の産生を制御します。

Th1 転写因子 T-bet は、Th2 および Th17 の分化を抑制することが示されています 35,36。 しかし、IFN-γ と IL-17 の共産生はヒト CD4+ T 細胞で検出され 25,37、IFN-γ と IL-10 の共産生はマウス CD4+ T 細胞で記録されています 18。 転写因子 T-bet、GATA-3、および ROR-γt の相対的な発現レベルは、従来の Th1/Th2/Th17 パラダイムの異なる系統間のバランスを微調整する可能性があります。 GATA-3 および ROR-γt に対する T-bet の優勢性が低下すると、我々の実験系では肺浸潤 HA 特異的 CD4+ T 細胞の IFN-γ 産生が消失します 17。 ここで、重症インフルエンザの同じ実験系において、ROR-γt に対する T-bet の優位性が低下した Th17 分化を​​実証しました。 この過剰な ROR-γt 活性化により、Th1 関与 CD4+ T 細胞が Th17 系統に移行し、IFN-γ 産生が消失しました。

IL-17の役割は依然として不明瞭であった。 IL-17 は局所的な炎症と特定の自己免疫疾患の病原性と関連しており、IL-17 はその標準受容体 IL-17RA に結合し、TRAF6 とそれに続くシグナル伝達カスケードを活性化します 26、28、38。 IL-17 は他の疾患において抗炎症作用があります 39,40,41。 IL-17 は非常に汎用性が高く、組織修復や癌などの他の非病原性状態にも関与していると考えられています 42。IL-17 は、受容体複合体でリクルートされた EGFR に結合し、TRAF4 とその後のシグナル伝達カスケードを活性化します 27,39。 TRAF4 の活性化は、IL-17 媒介の病原性プロセスを制限する可能性があります 30。 私たちの HA 特異的 Th17 細胞は、IFN-γ を産生せず、炎症を促進しないため、非病原性 Th17 細胞 25 に似ていました。 EGFR を介したシグナル伝達とその後の TRAF4 の活性化もありました。 Th17 応答は、重症インフルエンザのマウス モデルの炎症を軽減しました。

高齢者は重症インフルエンザのリスクが高くなります43。 彼らはまた、SARS および現在進行中の新型コロナウイルス感染症のパンデミックの際に過剰な死亡率にも悩まされました44,45、https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/need-extra-precautions/index.html。 2022 年 8 月 23 日にアクセス。これらの併存疾患がこの事実の一因となっていますが、免疫系の混乱も関係している可能性があります。 加齢に伴う胸腺退縮と胸腺排出量の減少が問題である可能性があります。 50歳の時点で、ヒトの胸腺は若い人と比べてT細胞の15～20％しか生成しません。 65 歳までに新しい T 細胞をほとんど作ることができなくなります (参考: 46)。 マウスの胸腺退縮は生後 3 か月から始まります 47。 疾患を緩和するTh17細胞は、最近の胸腺移民の表面マーカーを示した。 胸腺摘出術により Th17 反応は消失し、Th17 は加齢とともに減少しました。 高齢者は、疾患を修飾するTh17細胞の喪失により、重篤な疾患に苦しむ可能性があります。 私たちの結果は、重度の気道感染症におけるIL-17反応の調節に関して警鐘を鳴らしています。 IL-17 は必ずしも炎症誘発性であるとは限らないため、不適切なサイトカイン操作を避けるように注意する必要があります。

マウスを含むすべての実験は、長庚記念病院の「動物管理使用委員会」によって承認されたプロトコールに従って実行されました（承認番号：IACUC 2016030301）。 委員会は、マウスを含むすべての実験が中華民国台湾行政院農業委員会による動物保護法と、公布された実験動物の管理と使用に関するガイドに含まれるガイドラインに厳密に従って実施されたことを認証した。米国国立研究評議会実験動物資源研究所による

すべてのマウスは C57BL/10.D2 遺伝的背景を持ち、高齢マウスを使った実験を除き、雌雄とも 8 ～ 12 週齢のマウスを実験に使用しました。 TCRトランスジェニックマウス系統6.5は、PR8インフルエンザウイルスのHAのI-Ed制限HAエピトープ（110SFERFEIFPKE120）を認識するTCRを発現する（ハーバード大学、ボストン、マサチューセッツ州のH. Von Boehmer氏のご厚意により提供）。 6.5 マウスを同系 IL17KO または IL10KO マウスと交配して、それぞれ 6.5 IL17KO TCR トランスジェニック マウスまたは 6.5 IL10 KO TCR トランスジェニック マウスを生成しました。 同系 IL17KO マウスは、B6 遺伝的背景の IL17KO マウス (台湾、長庚記念病院の YC. Day よりご提供) を C57BL/10.D2 遺伝的背景のマウスと >9 世代にわたって交配することによって生成されました。 同系 IL10 KO および 6.5 IL10 KO TCR トランスジェニック マウスは以前に記載されています 18。 マウスは特定の病原体のない条件下で維持されました。

インフルエンザ ウイルスの PR8 (A/PR/8/34) 株は、生後 10 日の発育鶏卵の尿膜腔液で生成され、台湾の長庚大学の中核施設によって特徴付けられました。 軽いイソフルラン（Aesica Queenborough Ltd.、英国ケント州）麻酔下に、50μlのPBS17、18、19、20、21、22、34中の2.5×103プラーク形成単位（pfus）をマウスに鼻腔内経路で接種した。

HA が挿入されたワクシニア ウイルス 48、49、50 は、BCS-1 細胞を使用して増幅されました。 1 × 106 プラーク形成単位 (pfus) の感染量を 100 μl の PBS 中で腹腔内注射しました。

組換えマウス IL-17A (キャリアフリー) は、BioLegend (米国カリフォルニア州サンディエゴ; カタログ番号 576006) から購入しました。 20μl PBS中の適切な濃度のIL-17Aを、イソフルラン(Aesica Queenborough Ltd.、ケント、英国)麻酔中に5日間、鼻腔内経路を通じて毎日補充した。

EGFR 阻害剤ゲフィチニブは AstraZeneca から購入しました。 最初にDMSO中のストック溶液を作成し、アリコートを-80℃で保存しました。 新鮮な最終溶液を毎日ＰＢＳ中で調製し、１００μｌ中の１００ｍｇ／ｋｇのゲフィチニブを強制経口投与した。

クローン型 HA 特異的 CD4+ TCR トランスジェニック T 細胞は、HA 特異的 CD4+ TCR トランスジェニック 6.5 マウスのプールされた脾臓およびリンパ節から調製されました 17、18、19、20、21、22、34、48、49。 クローン型IL17 KOまたはIL10 KO HA特異的CD4+ TCRトランスジェニックT細胞を、それぞれ6.5匹のIL17 KOまたは6.5匹のIL10 KO TCRトランスジェニックマウスのプールされた脾臓およびリンパ節から調製した。 クローンタイプのパーセンテージは、フローサイトメトリー分析によって決定されました。 ナイーブ表現型は、活性化マーカー CD44 (抗マウス CD44; 553133、BD Biosciences; 希釈 = 1/100) および CD62L (抗マウス CD62L; 553150、BD Biosciences; 希釈 = 1/100) のプロファイルを評価することによって確認されました。 感染応答性 6.5 CD4+ T 細胞を、感染した HA 特異的 CD4+ TCR トランスジェニック 6.5 マウスの肺から回収しました。 CD4+ T 細胞は、磁気ビーズを使用したネガティブ選択によって濃縮され、ドナー細胞は、CD90.1 に対する蛍光色素結合抗体 (Thy1.1; 抗マウス CD90.1; 554898、BD Biosciences; 希釈 = 1/1000) を使用して同定されました。 CD90.2 (Thy1.2; 抗マウス CD90.2; 553006; BD Biosciences; 希釈 = 1/200)。 シングルバッチ移入実験では、2.5 × 106 クローン型 6.5 CD4+ T 細胞を、0.2 ml のハンクス平衡塩類溶液 (HBSS) に溶かした Thy1.2/Thy1.2+ 野生型レシピエント マウスに尾静脈を介して注射しました。 2 バッチ移入実験では、最初のバッチの 0.5 × 106 個のクローン型 6.5 CD4+ T 細胞を感染時に注射し、2 番目のバッチの 1.5 × 106 個のクローン型 6.5 CD4+ T 細胞を感染 4 日目に Thy1 に注射しました。 2/Thy1.2+ 野生型マウス。

クローン型 T 細胞 (1 × 107 細胞/ml) を HBSS 中で 5 μM C​​FSE (5,6-カルボキシフルオレセイン ジアセテートスクシンイミジル エステル; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) で 10 分間染色しました。 細胞をHBSSで3回洗浄し、CFSE染色した6.5 CD4+ T細胞（2.5×106）を尾静脈を介してレシピエントマウスに移植した。

細胞懸濁液を、メーカーの推奨に従って、FACS緩衝液(PBSプラス0.5% BSAおよび0.02% NaN3)中の飽和濃度の蛍光色素標識mAbとともに氷上でインキュベートした。 ドナー CD4+ T 細胞は、以下の mAb を使用して同定されました: ビオチン結合抗クロノタイプ 6.5 TCR (H. Von Boehmer 提供; 希釈 = 1/100)、アビジン-PE (A1204、Caltag、カリフォルニア州バーリンゲーム、希釈 = 1 インチ) 200）、またはストレプトアビジン-APC（SA 1005、カリフォルニア州バーリンゲームのカルタグ、希釈 = 1/200）、および PerCP または FITC 結合抗 CD4（553052 または 553047、BD Biosciences、両方とも希釈 = 1/100）。 T-bet およびマウス IgG1κ アイソタイプ コントロール (45 ～ 5825、45 ～ 4714、eBiosciences、希釈 = 1/50)、FITC-Phospho-EGFR (Tyr1068) ウサギを除き、すべての蛍光色素結合抗体は BD Biosciences から入手しました。抗ヒト、マウス (MA5-27995、Invitrogen; 希釈 = 1/10)、および PE-TRAF4 (SC-390232、Santa Cruz Biotechnology; 希釈なし)。 FACS CALIBURを使用して細胞を取得し、CellQuest Pro (BD Biosciences)、FACSuite (BD Biosciences)、またはFlowJo (Tree Star, Inc.) ソフトウェアを使用して分析を実行しました。

採取した臓器からの単細胞懸濁液 (24 ウェル プレートに 5 ～ 10 × 106 細胞ウェル -1) を、5 μg ml の存在下、10 μg ml -1 の MHC クラス II 制限 HA ペプチド (SFERFEIFPKE) で 5 時間再刺激しました。 −1 ブレフェルディン A (SI-B7651、Sigma-Aldrich)。 Brefeldin-A 濃度は、細胞内サイトカイン染色全体にわたって維持されました。 再刺激された細胞は、上記のように抗 CD90.1 および抗 CD4 で表面染色され、IC 固定バッファー (00-8222、eBiosciences) で固定され、洗浄され、以下を含む透過化バッファー (00-8333、eBiosciences) で染色されました。標的サイトカインに対する蛍光色素結合抗体。 Foxp3 (11-5773、eBiosciences; 希釈 = 1/50) および T-bet の場合、細胞は固定/透過化バッファー (00-5523、eBiosciences) で表面染色、固定、透過化され、洗浄され、透過化バッファーで染色されました。 (00-8333、eBiosciences) 蛍光色素結合抗体を含む。 いくつかの実験では、細胞を体外で分析し、再刺激せずに染色しました。

単細胞懸濁液を、HA 特異的 TRC トランスジェニック 6.5 マウスの脾臓から調製しました。 脾細胞 (2.5 × 105) を、5% CO2 存在下、37 °C でクラス II 制限 HA ペプチド (SFERFEIFPKE) を用いて 72 時間再刺激しました。 トリチウム化チミジンを採取の18時間前に添加した。 各ウェル内の DNA に取り込まれた放射能の量は、前述のようにシンチレーション カウンターで測定されました 17,34。 本文に記載されているように、感染マウスから回収した肺浸潤 HA 特異的 CD4+ T 細胞を共培養し、増殖に対するそれらの影響を測定しました。

サイトカイン産生のために、IL-17 コンピテント (IL-17+/+) 6.5 マウスの脾細胞の単細胞懸濁液 (ウェルあたり 2.5 × 106 細胞) をインフルエンザ ウイルス (PR8 株; 0.03 (MOI) 感染多重度) で刺激しました。 ）4日目の感染マウスからの肺浸潤HA特異的6.5 CD4+ T細胞の存在下、1:5の比率で、完全RPMI-1640中で48時間インビトロで培養した。 感染マウスからの細胞を含まないナイーブ脾細胞を対照として使用した。 組換えマウスTGF-β(10ng ml-1、GF346、Millipore)または抗TGF-β(10μgml-1、MAB1835、R&D)を開始時に培養物に添加した。 同族HAペプチド(100μgml-1)を最後の5時間培養物に添加した。 Brefeldin-A を刺激の最後の 3 時間に添加し、その後細胞を細胞内染色のために処理しました。

TRAF4 染色の場合、ナイーブ WT、IL-17 コンピテント (IL-17+/+) 6.5、または IL-17 ノックアウト (IL-17-/-) からの脾細胞の単細胞懸濁液 (ウェルあたり 2.5 × 106 細胞) 6.5匹のマウスを、完全RPMI-1640中のインフルエンザウイルス(PR8株;0.03(MOI)感染多重度)でインビトロで48時間刺激した。 組換えマウスIL-17 (0.1または1.0 μgml-1; 576006、Biolegend)および/またはゲフィチニブ(0.1または1.0 μgM; Iressa、AstraZeneca)を開始時に培養物に添加した。 同族HAペプチド(100μgml-1)を最後の5時間培養物に添加した。 Brefeldin-A を刺激の最後の 3 時間に添加し、細胞内染色の場合と同様に細胞を処理しました。

リン酸化 EGFR 染色の場合、ナイーブ WT、IL-17 コンピテント (IL-17+/+) 6.5、または IL-17 ノックアウト (IL-17-/) からの脾細胞の単細胞懸濁液 (ウェルあたり 2.5 × 106 細胞) −）６．５匹のマウスを、完全ＲＰＭＩ−１６４０中のインフルエンザウイルス（ＰＲ８株；感染多重度０．０３（ＭＯＩ））でインビトロで４８時間刺激した。 組換えマウスIL-17 (0.1または1.0 μgml-1; 576006、Biolegend)および/またはゲフィチニブ(0.1または1.0 μgM; Iressa、AstraZeneca)を開始時に培養物に添加した。 同族HAペプチド(100μgml-1)を最後の5時間培養物に添加した。 Brefeldin-A を刺激の最後の 3 時間に添加し、その後細胞を染色のために処理しました。 簡単に説明すると、まず細胞を冷パーマバッファー III (558050、BD Biosciences) に 30 分間置き、染色バッファー (554657、BD Biosciences) で洗浄し、FITC-Phospho-EGFR (Tyr1068) Rabbit anti-Human、染色バッファー中のマウス (MA5-27995、Invitrogen; 希釈 = 1/10)。 細胞は、フローサイトメトリー用に BD LSRFortessa™ Cell Analyzer で取得するか、共焦点顕微鏡 (Leica) で視覚化しました。

我々は、以前に記載されているように、改変されたMadin-Darbyイヌ腎臓細胞（MDCK; The American Type Culture Collection）プラークアッセイを使用して、感染マウスの臓器内の生きたインフルエンザウイルス力価を測定しました17、18、19、20、21、22、34。 臓器を指定の時間に 1 mL DMEM に収集し、液体窒素中で急速冷凍し、分析まで -80 °C で保存しました。 組織ホモジネートの１０倍希釈物を、１０％ＦＣＳ、抗生物質抗真菌薬（１５２４０－０６２、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、および０．０００２５％トリプシンを補充したＤＭＥＭ中で調製した。 各希釈液の合計 500 μl を 6 ウェル プレート内の MDCK 細胞のコンフルエントな単層に添加し、35 °C、5% CO2 で 1 時間インキュベートしました。 次いで、各ウェルに２ｍＬの寒天重層（０．３％）を加え、３日間インキュベートした。 細胞を10%ホルマリンで固定し、寒天オーバーレイを除去し、固定された単層をクリスタルバイオレット(2%エタノール中0.02%)で染色した。 結果は、プラーク形成単位（PFU）/ml = (プラークの平均数 × 2) × (希釈率 - 1) として表されました。

感染後 7 日目に実験マウスの肺を採取し、10% 中性緩衝ホルマリン溶液で固定しました。 固定後、肺をパラフィンに包埋し、5μmの切片を切り出した。 切片をヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色し、盲検で採点しました。 リンパ球、好中球、形質細胞などの炎症細胞の浸潤は、浸潤密度に応じて病理学者によって陰性、1+、2+、または 3+ として個別にスコア付けされました。 血管炎および線維症も、前述のように、重症度に基づいて陰性、1+、2+、または 3+ としてスコア付けされました 17、18、19、20、21、22、34。 肺の全体的な炎症は、これらのスコアの平均によって表されました。

データは平均±標準偏差として表されます。特定の時点で 2 つのグループを比較するための Student t 検定分析には Graphpad Prism バージョン 8 を使用しました。 また、体重曲線については二元配置分散分析を、生存曲線については Gehan-Breslow-Wilcoxon 検定を分析しました。 p 値 < 0.05 を有意であるとみなしました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究結果を裏付けるすべてのデータは、論文とその補足情報で入手できます。 グラフの数値ソース データは補足データ 1 にあります。

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長庚記念病院の放射線研究中核実験室のフローサイトメトリー機器のサポートに感謝します。 新興ウイルス感染症研究センターは、台湾教育省（MOE）による高等教育芽生えプロジェクトの枠組み内の注目分野研究センタープログラムおよび国立科学研究センターからのNSTC 111−2634-F-182-001の支援を受けています。および台湾技術評議会。 この作品は、プロジェクト MOST 111-2314-B-182-029 (AD)、MOST-105-2321-B-182A-003-MY3 (AD)、および MOST-106-2314-B-182A-160- によってサポートされました。台湾科学技術省の MY3 (CTH)、および台湾の長庚記念病院医学研究プロジェクト基金の CMRPVVJ0052 (CYH)、CMRPG 3E2081-3、および 3J0721 (CTH) による。

長庚大学医学部新興ウイルス感染症研究センター、亀山-33302、台湾桃園市

アヴィジット・ダッタ

台湾桃園市亀山-33333 長庚記念病院内科感染症科

アヴィジット・ダッタ、ソンハン・シャオ、チアシャン・チャン、チンタイ・ファン

台湾桃園市亀山-33333、長庚記念病院内科、呼吸器科

チェン・ユ・フン

長庚記念病院病理学部、亀山-33333、桃園市、台湾

ツェーチン・チェン

長庚大学医学部病理学教室、亀山-33302、桃園市、台湾

ツェーチン・チェン

台湾桃園市亀山 33333 長庚記念病院内科血液腫瘍科

リン・ヨンチャン

長庚大学医学部血液腫瘍科、亀山-33302、台湾桃園市

リン・ヨンチャン

台湾桃園市亀山-33333、長庚記念病院内科、肝胃腸科

リン・チュンイェン

長庚大学医学部肝胃腸科、亀山-33302、台湾桃園市

リン・チュンイェン

長庚大学医学部感染症科、亀山-33302、台湾桃園市

チンタイ・ファン

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AD と C.-TH は調査研究を計画し、データを分析し、論文を執筆しました。 T.-CC は肺切片の病理学的スコアリングを実施しました。 AD、C.-YH、S.-HH、C.-SC、T.-AC、Y.-CL、C.-YL が調査を実施しました。

黄清泰氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Hugh D Mitchell と他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Damon Tumes、Eve Rogers、Christina Karlsson Rosenthal。 査読ファイルが利用可能です。

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転載と許可

Dutta、A.、Hung、CY、Chen、TC。 他。 IL-17-EGFR-TRAF4 軸は、重度のインフルエンザにおける肺炎症の軽減に寄与します。 Commun Biol 6、600 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04982-0

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受信日: 2022 年 9 月 11 日

受理日: 2023 年 5 月 25 日

公開日: 2023 年 6 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04982-0

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