循環サイトカインTNFのスパイク

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9119 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

循環系と筋骨格系の間の分子輸送は、健康と病気における関節関節の生理機能を調節します。変形性関節症 (OA) は、全身的および局所的な炎症に関連する変性関節疾患です。炎症事象には、免疫系の細胞によって分泌され、組織界面を横切る分子輸送（タイトジャンクション [TJ] バリア機能と呼ばれます）を調節するサイトカインが関与します。私たちのグループの以前の研究では、OA膝関節組織は、単一ボーラスとして心臓に送達された異なるサイズの分子のサイズ分離を示すことが示されました（Ngo et al. in Sci. Rep. 8:10254, 2018）。今回、並行デザインのフォローアップ研究として、変形性関節症の病因および一般的な免疫状態において多面的な役割を持つ 2 つの一般的なサイトカインが、関節組織界面のバリア機能特性を調節するという仮説を検証します。具体的には、組織内および循環系と筋骨格系の組織界面を横切る分子輸送に対するサイトカインの急性増加（スパイク）の影響を調査します。蛍光タグ付き 70 kDa デキストランの単回ボーラスを、単独で、または炎症誘発性サイトカイン TNF-α または抗炎症性サイトカイン TGF-β とともに心臓内に送達し、骨格が成熟するまで（生後 11 ～ 13 か月） ) モルモット (ダンキン・ハートレー、自発的 OA 動物モデル)。 5 分間の循環後、膝関節全体を連続切片にし、ほぼ単一細胞の解像度で蛍光ブロック面の低温画像化を行いました。 70 kDa の蛍光タグ付きトレーサーは、最も一般的な血液輸送タンパク質であるアルブミンとサイズが類似しており、トレーサーの蛍光強度の定量化によりトレーサー濃度の尺度が得られます。 5分以内に、循環サイトカインTNF-αまたはTGF-βのスパイク（急性倍加）により、循環系と筋骨格系の間のバリア機能が著しく破壊され、TNF-αグループではバリア機能が本質的に消失した。関節の全体積（すべての組織区画および境界筋構造を含む）において、TGF-β-およびTNF-α-のトレーサー濃度は、対照群と比較して有意に減少した。これらの研究は、炎症性サイトカインが関節の組織区画内および組織区画間の分子通過の門番であることを示唆しており、薬学的および/または物理的手段を使用して、OAなどの変形性関節疾患の発症を遅らせ、進行を軽減する新しい手段を開く可能性があります。

軟骨、滑膜、骨、軟骨下骨、関節周囲筋組織、半月板、靱帯、その他の結合組織を含む関節組織は、統合された生体システムを形成しています。筋骨格細胞は、その生存のために、心臓血管系から関節内の血管新生組織区画と無血管組織区画へ、およびそれらの間の分子の移動に依存しています1、2、3。私たちのグループによる最近の研究では、筋骨格組織コンパートメントが分子サイズ選択性を示すことが示され、骨膜や滑膜などの組織界面に機能的バリア特性が存在することが示唆され、OA の発症における分子輸送の加齢に伴う変化が示唆されています4。血漿中の主要なキャリアタンパク質であるアルブミン (67 kDa) は、機械的負荷がない場合、骨組織における分子サイズの透過性に上限を示します5。アルブミンおよびより大きなタンパク質が滑膜関節複合体の組織区画にどの程度浸透するかは、現時点では不明である。

OA の根本的なメカニズムはほとんど理解されていませんが、全身性炎症によってもたらされる組織コンパートメント内および組織コンパートメント間の分子輸送の変化が、患者を OA に裏付けている、または少なくとも患者を OA にしやすくしている可能性があるという証拠が増えています 6,7,8。 OA は長い間、軟骨のみの疾患であると考えられてきました。現在のパラダイムでは、OA を関節全体の状態として考慮しており、関節の組織間の細胞コミュニケーションの崩壊が OA の発症と進行の中心となっています 9。現在まで、心臓血管系と筋骨格系の間の分子輸送のゲートキーパーとしての組織界面の役割に取り組んだ研究はほとんどありません。マルチスケールのアプローチ、すなわち、サブ細胞から組織、臓器へのアプローチは、OA に典型的な慢性全身性炎症、外傷または細菌/ウイルスへの曝露に関連する急性炎症性サイトカインのスパイク、および組織コンパートメント内および組織コンパートメント間の分子輸送の相互作用を理解するのに特に有用である可能性があります。ジョイント。これは、重要であるにもかかわらず無視されているこの分野の知識のギャップを表しており、OA や他の変形性関節疾患の病因を理解する上で重要な役割を果たす可能性があります。

慢性の軽度の全身性炎症は、炎症性サイトカインのレベルが持続的に上昇することを特徴とします。腫瘍壊死因子アルファ (TNF-α) やトランスフォーミング成長因子ベータ (TGF-β) などのサイトカインの増加は、全身性炎症と変形性関節症などの加齢に伴う変性疾患の両方に関連します 10、11、12。炎症誘発性サイトカイン TNF-α と抗炎症性サイトカイン TGF-β は、タイトジャンクション (TJ) タンパク質複合体の制御を通じて傍細胞透過性を制御することにより、循環系とさまざまな組織の間の界面での分子輸送動態を調節することが示されています 13。外傷や細菌/ウイルスへの曝露による急性炎症は、サイトカインのスパイクを引き起こします。

動的なサイトカイン濃度（全身的および局所的）に応答し、血液および間質液の流れによって促進される、循環系と関節組織との間の分子輸送の相対的変化の観察には、サブミクロンから関節組織までのマルチスケールイメージングが必要です。細胞、組織、関節器官にわたるメソスケール。ここで我々は、免疫調節サイトカインの急性変化により、筋骨格系と循環系の組織間の組織界面における機能的バリア特性が変化するという仮説を立てた。この仮説を検証するために、我々は、以前の研究と並行したアプローチ、すなわちタグ付き70 kDa分子トレーサーとサイトカインを心臓から注射した麻酔モルモットを用いて、変形性関節症の関節の組織区画内および組織区画間の分子輸送の変化を定量化した。 TNF-α または TGF-β3、14、15、16。

私たちの最も重要な目的は、それぞれ炎症誘発性サイトカインまたは抗炎症性サイトカイン、TNF-α または TGF-β の急性スパイク後の膝組織への灌流における全体的および局所的な違いを理解することでした。まず、各グループ内の各動物の組織ブロック全体の平均トレーサー強度を測定しました。膝関節灌流のこの大量の測定には、関節と周囲の筋肉組織が含まれます。その後、関節の組織区画間、グループ内およびグループ間（サイトカイン処理対照および未処理対照）の平均トレーサー強度を比較した。最後に、関節の組織内の血管界面におけるバリア機能を、骨および筋肉組織の血管区画と組織区画との間の差異として測定した。

アルブミンなどの大きな分子の透過性は、70 kDa の蛍光分子トレーサーを使用して測定されました。トレーサーの強度は濃度に正比例します 17。トレーサー強度の低下は、トレーサー濃度の低下、したがってトレーサー透過性の低下を示します。逆に、トレーサー強度の増加は、トレーサー濃度の増加、したがってトレーサー透過性の増加を示します。各動物グループ (2 つのサイトカイン処理グループ (TNF-α または TGF-β) と未処理の対照グループ) 内で、組織コンパートメント間のトレーサー濃度の相対的な差により、それぞれの組織間のバリア機能の尺度が得られます。

70 kDa トレーサーとサイトカイン (TNF-α または TGF-β) の同時送達が分子輸送 (透過性または組織浸透) を調節するという仮説を検証するために、まず平均トレーサー強度を対照と各実験サイトカイングループの間で比較しました。 Tukey の事後検定で一元配置分散分析を使用します (図 1)。 TGF-β および TNF-α グループは、対照グループよりも有意に低い平均強度を示しました (p < 0.05)。サイトカイン治療群間で有意差は観察されませんでした。

関節および周囲の筋肉組織を含む組織ブロック全体における平均 70 kDa のトレーサー強度。エラーバーは平均値の標準誤差を示します (n = 3)。 *有意差は、Tukey の事後分析を使用した一元配置分散分析によって決定され、統計的有意性は p < 0.05 で定義されます。

関節ボリューム全体の三次元 (3D) レンダリング (図 2A) では、70 kDa トレーサーの分布における大きな相対的な違いが示されました。これらは、関節の異なる組織区画、およびそれぞれの組織の血管外区画と血管内区画の間の平均トレーサー強度の定量的測定によって確認され、組織バリア機能の定量的測定が得られます。

循環サイトカインの急激な増加により、対照と比較して組織区画間のバリア機能が破壊されます。バリア機能は、トレーサー濃度の（有意な）差が最も大きい組織コンパートメント間で最も高くなります。 (A) 関節内の全体的なトレーサー分布を示す 3D レンダリング。対照群（左パネル）では、周囲の筋肉組織と比較して、骨、軟骨、骨髄腔内のトレーサー強度が著しく高く、トレーサーは靭帯にも現れていました。軟骨、骨、靭帯は、トレーサー (外因性蛍光、赤色) と組織の自己蛍光 (コラーゲンの内因性蛍光、緑色) の共局在により黄緑色に見えました。周囲の筋肉組織は蛍光をほとんどまたはまったく示さず、境界筋膜はやや高いレベルのトレーサーを示しました。コントロールグループとTGF-βグループの両方とは対照的に、TNF-αグループ（中央のパネル）は、筋肉コンパートメントをはっきりと輪郭を描く境界筋膜と筋肉血管系の両方で、肉眼で最も高いレベルのトレーサーを示しました。。また、対照群とは対照的に、TNF-α および TGF-β グループは、軟骨、靭帯、および骨のトレーサーが少なく、ほとんど緑色のみに見えました (つまり、自己蛍光は示すが、赤いトレーサーの証拠はほとんどまたはまったくありません)。同様に、低レベルのトレーサーが骨髄腔内で観察されました。 TGF-β グループは、筋肉内の赤色蛍光強度がはるかに低かったにもかかわらず、同様のパターンのトレーサーを示しました (右パネル)。組織の自己蛍光 (緑色) と蛍光タグ付き 70 kDa トレーサー (赤色) は、共局在すると黄色のシグナルを発します。 (B-概要) すべてのグループの組織コンパートメントにわたる平均トレーサー濃度の比較。 TNF-α のスパイクにより、骨、軟骨、骨髄内のトレーサー濃度が大幅に減少します。 TGF-β のスパイクにより、軟骨および骨髄内のトレーサー濃度が大幅に減少します。コントロール (B1)、TNF-α (B2)、および TGF-β (B3) グループを含む各特定のグループを考慮すると、実験グループよりもコントロールグループ (B1) の組織コンパートメント間でトレーサー濃度の有意な差が観察されます。グループ（B2、B3）。対照群の組織間の界面における無傷の機能的バリアと比較して、TGF-β群ではバリア機能が低下し、TNF-α群では完全に消失しているようである。エラーバーは標準誤差 (n = 3) を示します。 Shapiro-Wilk 検定では、定量的データが正規分布していることが示されました。有意差は、二元配置分散分析およびシダックの多重比較事後分析によって決定されました。統計的有意性はそれぞれ *、**、***、**** (p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001、および p < 0.001) で示されます。

対照群では、トレーサー濃度は骨および軟骨区画で最も高かった（有意差はなかった）。対照膝関節の骨および軟骨区画は両方とも、骨髄よりも有意に高いトレーサー濃度を示し、骨髄区画は筋肉および骨と筋肉のそれぞれの血管区画よりも有意に高いトレーサー濃度を示した。総合すると、対照膝の組織区画間のそれぞれのトレーサー濃度におけるこれらの有意な差は、未治療の対照群の関節組織間の無傷のベースラインバリア機能を示しています(図2B1)。

グループ内では、組織コンパートメント間のトレーサー濃度の違いにより、それぞれの組織コンパートメント間のバリア機能の尺度が得られます。トレーサーとサイトカイン、TNF-α または TGF-β の共送達により、関節、周囲の筋肉組織、および血管系のさまざまな組織区画内のトレーサーの量と空間分布が変化するという仮説を検証するには、トレーサー濃度を調べます。コントロール、TNF-α および TGF-β グループのセグメント化された組織コンパートメント間で比較されました。対照グループでは、骨、軟骨、および骨髄組織コンパートメントは、TNF-α グループと TGF-β グループの両方のそれぞれの組織コンパートメントよりも有意に高いトレーサー濃度を示し、定性的で肉眼的な観察が確認されました (図 2B1)。さらに、コントロールグループの各組織コンパートメントは、TGF-βグループのトレーサー濃度よりも統計的に有意な濃度差を示し（図2B3）、TGF-βグループは、コントロールグループの各コンパートメントよりも統計的に有意な濃度差を示しました。 TNF-α グループ (図 2B2)。

したがって、これらのデータは、サイトカイン、TNF-αおよびTGF-βの同時送達が、組織間の差異が減少するように関節組織内のトレーサーの濃度および分布を変化させ、組織区画間のバリア機能の損失を示唆していることを示唆している。 TGF-β群では、対照群に比べてバリア機能が低下した。 TNF-α グループでは、そのグループの組織コンパートメント間でトレーサー濃度に有意な差がなかったため、バリア機能が完全に無効になっているように見えました。

トレーサーとサイトカイン、TNF-α または TGF-β の共送達により、骨膜 (骨と筋肉の間) および血管内皮 (血管内区画と血管外区画) を含む界面組織のバリア機能が変化するという仮説を検証するには、平均値の差トレーサー濃度は、骨と筋肉の血管外組織区画とそれぞれの血管内区画 (血管) の間で比較されました。 TNF-α または TGF-β の急性送達は、組織と血管の境界面でのバリア機能を低下させることが示されました。具体的には、骨における血管内と血管外の70 kDa トレーサー輸送の差は、TGF-β グループよりもコントロールグループで有意に大きく、バリア機能が損なわれていないことを示しています。さらに、対照群では、骨のバリア機能が有意に大きく、筋肉よりも骨のほうが逆の方向でした。対照的に、TNF-αまたはTGF-βを注射したグループは、組織区画における血管内輸送と血管外輸送との間で測定したバリア機能に有意な差を示さなかった(図3)。

対照群およびTNF-αまたはTGF-β群における、骨および筋肉を含む組織区画との血管界面におけるバリア機能。骨と筋肉は、コントロールグループのバリア機能において有意な大きさと方向の違いを示しますが、TNF-α グループや TGF-β グループではそうではなく、両方のサイトカイングループのバリア機能が低下していることを示しています。さらに、骨の血管区画と組織区画の間のバリア機能の有意な差が、対照群とTGF-βグループとの間で観察され、TGF-βの送達により血管と骨の間のバリア機能が大幅に低下することが示された。エラーバーは標準誤差 (n = 3) を示します。有意差は、二元配置分散分析およびシダックの多重比較事後分析によって決定されました。統計的有意性は * (p < 0.05) および *** (p < 0.001) で示されます。

この研究では、免疫調節サイトカインである TNF-α または TGF-β のスパイクが、自然発生的な加齢関連 OA を患うモルモットの膝関節内の組織境界面で組織バリア機能の変化を誘発するかどうかを、ほぼ単一細胞解像度の 3D クライオシステムを使用して調査しました。サイトカインと蛍光タグ付きトレーサーを心臓に送達してから 5 分後の関節全体のイメージング。蛍光タグ付きの 70 kDa トレーサー分布におけるはっきりと肉眼で観察できる変化は、関節周囲筋コンパートメント、ならびに関節複合体の軟骨、骨、および骨髄空間の肉眼レンダリングで観察できました。対照群では、骨、軟骨、骨髄、筋肉コンパートメントの組織コンパートメントとそれぞれの血管コンパートメント内のトレーサー濃度の定量化により、複数のコンパートメント間の有意な差が実証され、コンパートメント間の境界面でのバリア機能が損なわれていないことを示しました。 TGF-β グループでは、それぞれのバリア機能が低下しているようでした。測定されたどの組織区画間でもトレーサー濃度の有意差は観察されなかったため、TNF-αグループではバリア機能が完全に無効になっているようでした。さらに、対照群の骨と筋肉の血管区画と血管外区画との間では、トレーサー輸送の大きさと方向に有意な差が観察された。これは、バリア機能が損なわれていないことを示し、骨と筋肉の間の分子ゲートキーパーとしての骨膜の役割に関する以前の研究を裏付けるものである18。。

現在の実験で投与された TNF-α および TGF-β の投与量は、特定の動物の変形性関節症の疾患状態に起因する固有の慢性 (病態) 生理学的レベルを超えるサイトカインレベルの急激な増加 (スパイク) を表します。ＴＮＦ－αおよびＴＧＦ－βの血清レベルの等価スパイク（心臓への投与後５分）は、それぞれ１６．５ｎｇ／ｍｌおよび８３．２５ｎｇ／ｍｌと計算された。健康なモルモットおよび OA モルモットにおけるベースラインの TNF-α および TGF-β 血清レベルはまだ報告されていません。サイトカインの血清レベルは、OA の誘発齧歯動物モデルで特徴付けられています。現在の実験で投与された TNF-α の血清レベルは、マウス OA モデルのベースラインレベルの 2 倍を表し、TGF-β の血清レベルは報告値の 62% を占めます 19,20。したがって、今回の研究におけるサイトカイン投与の効果は、TNF-αおよびTGF-βがベースラインレベルを超えてほぼ即時に2倍になったことを示しています。これをモルモットモデルで考慮すると、TNF-α がベースラインレベルをほぼ即時に 2 倍にすると、組織間のバリア機能が完全に消失するように見えますが、TGF-β の急激な約 62% 増加により、組織間のバリア機能が緩和され、レベルが低下しました。ベースラインバリア機能を超える程度（対照群）。換言すれば、ベースラインレベルを超えるサイトカイン濃度のより高いスパイクは、組織間のバリア機能に対するより大きな影響、すなわち減少と関連していた。

公表された文献では、肺、肝臓、腎臓、脳、坐骨神経、網膜、十二指腸、空腸、盲腸、胸部大動脈を含む複数の組織を調査する生体内マウスモデルで実施された研究において、外因的に投与されたTNF-αによる血管アルブミン透過性の増加が報告されています。、皮膚および横隔膜２１． TNF-α送達後5分の変化を観察した現在の急性研究とは対照的に、マウス研究ではTNF-α送達後12～18時間まで有意な増加は観察されなかった。さらに、発表されたマウス研究では、TNF-αを20 ng/gで投与したが、これは現在の研究と比較して用量が30倍以上増加した。これらの違いは、健康なマウスモデルとモルモットのOAの自然モデルの間の本質的な違いも反映している可能性があります。

現在の研究では、TNF-α および TGF-β グループは筋肉および関節組織内のトレーサー濃度が著しく低く、これは透過性の低下を示しています。これは、TGF-β活性の低下により血液脳関門の透過性が低下したという、公表されているin vivo研究とは対照的である22。しかし、TGF-βは、腸上皮細胞、脳微小血管細胞、結腸上皮細胞、内皮および角膜内皮細胞、肺胞上皮細胞およびセルトリ細胞において、それぞれin vitroのバリア機能を強化および破壊することが示されている23、24、25。 26、27、28。口腔上皮細胞では、TGF-β が減少し、その後機能的バリア透過性が増加することが示されています 29。 in vivo 実験では、骨折後に 1.8 kDa の小分子に対する全身組織透過性の増加が実証されました 30。骨折に反応して血清 TGF-β レベルの上昇も検出されています 31。全体的に見ると、TGF-β の機能的バリア調節の効果は、組織、時間、分子サイズに依存する可能性があります。

骨膜を介した骨と筋肉のクロストークは、他の加齢に伴う変性組織状態、すなわちサルコペニアや骨粗鬆症と関連しています 32,33。しかし、変形性関節症におけるその役割はそれほど広く認識されていません。骨膜は、骨を覆う機能的な障壁膜として、また骨と筋肉の間の刺激に応答するインターフェースとして機能します18、34、35、36。特に注目すべきは、骨膜のバリア機能は方向に依存しており、骨から筋肉への方向の透過性は筋肉から骨への方向よりも大幅に低いことが以前に示されている。これらの影響は、プレストレスだけでなく流量の変化にも刺激に反応し、どちらも外傷の即時指標となります 18,35,37。現在の研究に関連して、サイトカインTNF-αおよびTGF-βの急速なスパイクに起因するバリア機能の損失は、筋肉から骨への、またはその逆の分子輸送を介したシグナル伝達を増幅すると考えられます。したがって、骨膜は循環系と関節の間の重要なインターフェースを提供します。組織コンパートメントを比較すると、70 kDa 分子の骨、軟骨、骨髄腔への輸送が TNF-α と TGF-β によって大幅に妨害されることがわかります。対照的に、筋肉および血管系の区画はほとんど影響を受けません。これは、骨膜が炎症性サイトカインに応答して筋肉と骨の間の高分子の動きを積極的に調節していることを示唆しており、骨膜が機能的な組織障壁であることを示唆しており、骨膜由来細胞によるタイトジャンクション関連タンパク質発現の公表された観察によってさらに裏付けられています34。

血管機能の乱れは OA の発症または進行に関係しており、血流不足により関節の組織全体で細胞死が引き起こされるという仮説が立てられています 38。対照動物では、骨と筋肉、およびそれぞれの血管系を比較すると、筋肉よりも骨の方が平均トレーサー強度のレベルが著しく高いことが明らかになりました。これは、骨内の内皮バリアが筋肉よりも活性なバリア特性を持っていること、および/または相対的なリンパ系関節排液効果が骨組織よりも筋肉の方が潜在的に大きいことを示唆しています（以下の議論を参照）。骨血管構造内のこの内皮バリアの透過性も、TNF-α と TGF-β の両方によって大きく影響され、血管バリア機能不全における炎症性サイトカインの増加に関係します。それに伴う栄養素、サイトカイン、タンパク質分解酵素の細胞および骨や軟骨の細胞外マトリックスへの輸送の混乱、およびそれに伴う組織恒常性の混乱は、軽度の全身性炎症が組織変性やOAの発症につながる寄与するメカニズムを表している可能性があります。

今回の研究では、循環サイトカインに反応してリンパ管の関節排出能力を変化させる可能性があるリンパ管内のトレーサー濃度を調べることはできなかった39、40、41。リンパドレナージは、関節炎の初期の発症時と慢性的な進行に伴い、それぞれ増加および減少することが示されており、持続的な炎症はリンパ管の構造および機能の破壊に関連しています40。現在の研究では、モルモットはOAの自然発生モデルであるため、モルモットの組織は、慢性疾患の特徴（リンパ排液の減少に伴う）と、サイトカインTGF-βまたはTNFの急性スパイクへの曝露の両方を示す可能性が高い。 -α (リンパ排液の増加を伴う); さらに、モルモット相当物に対するヒト TNF-α および TGF-β の特異性は不明です。また、筋肉にはリンパ管が豊富にある一方、骨は骨膜組織を通るリンパ液の排出に依存していることも考慮する必要があります 18,36。新しい方法論の開発により、将来的には、リンパドレナージ機能に伴う血管系と筋骨格系の間のバリア機能の相互関連効果を解読できる可能性があります。

現在の研究のさらなる制限は、選択されたデキストランはアルブミンと同様の分子量（67 kDa アルブミンと比較して 70 kDa）であるにもかかわらず、デキストランはキャリアタンパク質アルブミンの球状構造とは異なり直鎖であることです。分子の輸送は形状の影響を受け、線状分子は流体力学的半径が大きいため、球状分子よりも拡散が遅くなります。したがって、70 kDaのタグ付きデキストラン「生物学的類似体」の輸送は、わずかに高い分子量と小さな開口部を「通過する」能力によっていくらか相殺されるものの、67 kDaの球状アルブミン分子の等価輸送のより高い推定値を表す可能性があります。さらに、今回の研究で使用されている蛍光タグ付きデキストランは中性電荷ですが、この分子は「両性イオン」とラベルされているように極性です。対照的に、アルブミンはマイナスに帯電しています。分子の電荷は分子の輸送に影響を与えることも示されています。しかし、電荷は組織内の大きな分子（66 kDa）の拡散に影響を及ぼさないことが示されています42。さらに、ブロックフェイスクライオイメージングにより、非常に動的なプロセスの単一時点でありながら、複数の長さのスケールにわたる生体の組織コンパートメントおよびシステム内および間の輸送経路の前例のない 3D シームレスイメージングが可能になります。これは、循環サイトカインのほぼ即時的な増加の影響を評価する現在の研究にとって利点です。縦断的および生体内（例、ほぼリアルタイムのイメージングモダリティ 3,32,43）を追跡する実験は、輸送動態、ならびにサイトカインストームから全身炎症までを模倣する急性から慢性のサイトカイン増加の時間的展開に対する影響についての理解を深めるだろう。循環系と筋骨格系の間の分子交通パターンの解析。

本研究はさらに、サイトカインの急激な変化が、循環系と筋骨格系の組織間の界面におけるバリア機能のほぼ即時的な変化に関係していることを示唆している。将来的には、このバリア機能の低下を利用して、軟骨（軟骨細胞）や骨（骨芽細胞、骨細胞）内の常在細胞に薬剤を標的として送達し、OA44などの変性疾患によって破壊された組織を修復および再構築することが可能になるかもしれない。今回の研究では時間的影響については特に言及されていないが、OAにおける軽度の全身性炎症を背景に、サイトカインTNF-αおよびTGF-βの急激な増加により、組織と血管の界面でのバリア機能が即座に破壊されると考えられる。さらに、この研究は、組織区画間に存在するバリア特性の免疫調節能力を実証し、OA におけるクロストークの役割を軟骨および軟骨下から関節内のすべての組織に拡張します。炎症性サイトカインに応答して、機械的負荷と能動輸送が関節組織内の分子輸送をどのように変化させるかは、現時点では不明です。最近の研究では、局所関節リンパ管への医薬品の「直接送達」による有効性の向上が示唆されています41。全体として見ると、これらの研究は、関節の生理学と組織変性を理解し、病気の発症と進行を防ぐための薬学的および物理的対策を開発するための新たな機会を提供する可能性があります。

今回我々は、心血管系から関節の組織区画への、および関節の組織区画間の70 kDaタグ付きデキストランの輸送に対する、炎症性サイトカインの急激な増加の影響を研究した。以下に簡単に説明する方法論の完全なプロトコルは、45 にあります。

70 kDa タグ付きデキストランは、骨、靭帯および関節全体における分子ふるいを示す以前の実験に基づいて選択されました。さらに、アルブミン（67 kDa）などの大きな分子の類似体としても機能します。アルブミンは、血液中で最も一般的なキャリアタンパク質であり、この輸送を促進するのに不可欠です1、3、4、5、46、46、48。ダンキン・ハートレーモルモットは、膝やその他の滑膜関節の加齢に伴う自然発生的な OA の十分に確立されたモデルであり、病態生理学的プロセスはヒトの原発性 OA を反映しています 3,4,14,15,16。実験は、骨格的に成熟した（生後11～13か月）雄のダンキン・ハートレーモルモット（チャールズ・リバー）を用いて行われた。このモルモットは、我々のグループの以前の研究で、複数の骨棘や顕著な骨を伴う広範囲の軟骨欠損を含むOA表現型を示すことが示されている。骨上の軟骨びらん4.

蛍光トレーサーの調製、投与、および 5 分間の循環時間は、前述の方法に従って実行されました 4、5、48。組換えヒトＴＮＦ－α（ＲａｎｄＤＳｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を０．９％滅菌生理食塩水に溶解し、０．６６ｎｇ／体重ｇの用量で混合ボーラスに添加し、その後、麻酔をかけたモルモットの心臓に投与した。組換えヒトＴＧＦ－β１（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス、簡略化のため本文中ではＴＧＦ－βと呼ぶ）も同様に３．３３ｎｇ／ｇ体重の用量で調製した。

この研究は、ARRIVE のガイドラインと規制に従って実施されました。この方法は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施されました。この研究は、ケースウェスタン大学の施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって承認されました (プロトコル #2012-0100)。 3 つの動物グループ (n = 3) をイソフルランで麻酔しました。適切な鎮静の後、中性電荷の70 kDa テキサスレッドタグ付きデキストラン（Life Technologies、カールスバッド）を単独（対照）またはTNF-αまたはTGF-βとともに、単一混合ボーラスとして心臓を介して注射した。５分間循環させた後、動物は麻酔下のまま安楽死させた。安楽死後、周囲の筋肉組織を損傷しないように注意しながら、膝関節を直ちに切除し、近位および遠位で骨切りを行いました。次に、接合部を液体窒素に浸漬して急速冷凍し、高解像度のクライオイメージング用に光学切断温度化合物を埋め込みました。

OCT に包埋された組織ブロック全体を CryoViz™ 自動ブロック面クライオイメージングシステム (BioInvision Inc.、オハイオ州クリーブランド) を使用して 40 μm ごとに切片化し、イメージングしたことで、メゾスコピック標本の蛍光団の 3 次元に近い単一細胞の解像度が可能になりました 49。明視野および蛍光 (502 ～ 543 nm および 603 ～ 664 nm) 画像は、平面解像度 10.2 × 10.2 μm で取得されました。組織コンパートメントは手動でセグメント化され、対象領域の平均蛍光強度がトレーサー透過の尺度として使用されました。

GraphPad Prism 8 (GraphPad Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を統計分析に使用し、平均値と標準誤差を報告しました。複数の組織コンパートメント間の比較には、一元配置 ANOVA 統計分析と Tukey の事後分析を使用しました。 P < 0.05 は有意であるとみなされました。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、MechBio リポジトリ https://mechbio.org で入手できます。

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著者らは、2014 年に改正されたプロトコル #2012-0100 に基づく動物研究の実施に対する Case Western Reserve Animal Research Center の支援に感謝します。また、BioInVision の CEO である Debashish Roy 博士の設計および設計に関する専門家のアドバイスに感謝します。クライオイメージングプロトコルの実施。さらに、UNSW Biomedical Imaging Facility の共焦点イメージングおよび関連画像解析研究への支援に感謝いたします。この研究は、ポール・トレーナー・チェア財団の寄付金、ブルー・マウンテンズ世界学際イノベーション研究所、および国立衛生研究所を通じて部分的にさらに支援された。

ニューサウスウェールズ大学、シドニー、オーストラリア、生体医工学大学院 MechBio チーム

ルーシー・ンゴ

ブルーマウンテンズ世界学際イノベーション研究所、ニューサウスウェールズ州、オーストラリア

メリッサ・L・ノット・テイト

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モルモット実験の設計と実施: MKT イメージング研究の設計: MKT、LN イメージング研究の実施: MKT および BioInvision (エピスコピッククライオイメージング)、LN (共焦点イメージング)。画像セグメンテーション: LN データ収集: LN、MKT 画像およびデータ分析: LN、MKT、データ解釈: LN、MKT 原稿草稿: LN、MKT 原稿内容の修正: LN、MKTMKT および LN はデータ分析の完全性に対して責任を負います。著者全員が原稿をレビューしました。

メリッサ・L・ノット・テイトへの通信。

すべての著者は、この記事の主題に関して競合する利益が存在しないことを宣言します。完全な開示を目的として記載すると、MLKT は共同創設者であり、臨床および再生医療分野のいくつかの新興企業で取締役および科学的および技術的助言の役割を担っています。 MLKT は、外科および再生医療分野におけるいくつかの特許の発明者として指名されています。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Ngo, L.、Knothe Tail, ML 循環サイトカイン TNF-α および TGF-β のスパイクは、血管組織と筋骨格組織の間のバリア機能を変化させます。 Sci Rep 13、9119 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30322-7

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受信日: 2022 年 2 月 10 日

受理日: 2023 年 2 月 21 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30322-7

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