細胞外マトリックスと細胞骨格間の不適応フィードバック機構が肥大型心筋症の病態生理学に寄与する

Communications Biology volume 6、記事番号: 4 (2023) この記事を引用

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12 オルトメトリック

メトリクスの詳細

肥大型心筋症は、収縮性タンパク質の変異が原因で硬くなり、収縮性の高い心筋を引き起こす遺伝性疾患です。病気の進行における心臓の硬さの役割を理解するために、ここではヒドロゲル技術を利用して肥大型心筋症の in vitro モデルを作成します。肥大型心筋症の心筋を模倣したヤング率（硬さ）を有するヒドロゲル上で野生型心筋細胞を培養することは、健康な心筋を模倣したヒドロゲル上にプレーティングされた筋細胞と比較して、代謝亢進状態のミトコンドリア状態を誘導するのに十分である。重要なことに、これらのデータは、ヒト肥大型心筋症のマウスモデル (cTnI-G203S) から単離された筋細胞のデータを反映しています。逆に、cTnI-G203S 筋細胞のミトコンドリア機能は、健康な心筋を模倣したハイドロゲル上にプレーティングすると完全に回復します。私たちは、健康な状態ではミトコンドリアの機能を調節するが、サルコメア遺伝子の変異に起因する肥大型心筋症の病態生理の進行に関与する、細胞外マトリックスと細胞骨格ネットワークの間の機械感覚フィードバック機構を特定します。重要なのは、潜在的な治療標的を表す可能性のあるこのスキーマ内の重要な「リンカー」部位を正確に特定することです。

肥大型心筋症 (HCM) は、一般人口の 1:500 が罹患する常染色体優性遺伝性心疾患です1。これは、若者（5 ～ 15 歳）の心臓突然死の主な原因です2。 HCM は主にサルコメアタンパク質の遺伝子変異によって発生します 3,4。 HCM の臨床的特徴には、血行力学的仕事量の増加がない場合の左心室肥大、および駆出率が維持または増加した非拡張左心室が含まれます 1,4。細胞レベルでは、HCM は心筋細胞のリモデリング、サルコメアタンパク質の組織の崩壊、間質性線維症、およびエネルギー代謝の変化によって特徴付けられます5。我々は以前に、HCM の病態生理学における心臓 L 型カルシウムチャネル (LTCC) の役割を特定しました 6,7。

心臓の LTCC は、心臓の興奮と収縮の連動を維持するために重要な「カルシウム誘発性カルシウム放出」を引き起こします8。心臓の LTCC は、カルシウム依存性メカニズムとカルシウム非依存性メカニズムの両方を介してミトコンドリア機能の調節にも重要な役割を果たしています 9,10。具体的には、LTCC の活性化は、カルシウムの存在下または非存在下でミトコンドリア膜電位 (Ψm) の増加を引き起こします9。これは、チャネルとミトコンドリアの間の構造的機能的関連によって促進されます。心臓の LTCC は、α1C、α2δ、および β2 サブユニットで構成される膜貫通タンパク質です。 β2 サブユニットは、α-相互作用ドメイン (AID) を介して細孔形成α1C サブユニットに結合します11。 β2 サブユニットは、同じく F-アクチン 12 に固定されている、大きな筋鞘下タンパク質であるデスモヨーキンとしても知られる神経芽細胞分化関連タンパク質 AHNAK とも関連しています。 F-アクチンを含む細胞骨格タンパク質は、ミトコンドリア外側ドッキングタンパク質に結合することによってミトコンドリアと直接相互作用します13、14、15。 LTCC とミトコンドリアの間のこの構造的つながりは、生理的条件下でのミトコンドリア機能の調節に重要な役割を果たしており、拍動ごとに LTCC β2 サブユニットで起こる構造変化がミトコンドリア機能の下流の変化につながります9。

この細胞内ネットワークの障害は、ミトコンドリア機能の調節不全と病理学的状態の発症に関連しています6、7、16、17。我々は以前、トロポニン I (cTnI) 遺伝子変異 Gly203Ser (cTnI-G203S) を引き起こすヒト HCM のマウスモデルが、細胞骨格構造の破壊、LTCC とミトコンドリア間の構造機能的コミュニケーションの障害、およびその結果として生じるミトコンドリアの代謝亢進状態を示すことを示しました 6,17 。同様の所見は、β-ミオシン重鎖変異Arg403Gln7を引き起こすヒト疾患を有するマウスでも記録されている。注目すべきことに、これらの反応は肥大状態の発症に先行していました。

確立されたヒト HCM 表現型は、硬い心筋によって特徴付けられます 18,19。これと一致して、細胞外マトリックス (ECM) タンパク質合成の増加がヒト HCM 病理の進行に関与していると考えられています 20、21、22。実際、HCM のブタモデルから採取した脱細胞化心筋片に健康なヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を播種して作製した人工心臓組織は、剛性の増加を示します 21。 ECM は、膜貫通型機械感知タンパク質インテグリンを介して心筋細胞と相互作用し、これは心肥大の発症にも関与しているとされています 23,24。サイトゾルタンパク質ビンキュリンは、インテグリンの F-アクチンへの結合を媒介し、機械力を細胞膜から細胞骨格に伝達します 23、25、26。したがって、LTCCとミトコンドリアの間の細胞内ネットワークに加えて、ECMとF-アクチンの間にも構造機能的関連が存在すると考えられます。今回我々は、HCM 心筋硬直を模倣する in vitro プラットフォームを作成することにより、LTCC とミトコンドリアが関与する HCM の病態生理学の発展におけるこのリンクの役割を探索します。

我々は、肥大型心筋症の in vitro モデルの開発を目指しました。私たちは、健康な (「柔らかい」) 心筋と HCM (「硬い」) 心筋を模倣するために製造されたヒドロゲルの圧縮ヤング率 (剛性) を評価することから始めました。原子間力顕微鏡を使用して、ヒドロゲルの全体的な圧縮剛性はそれぞれ 12.5 ± 0.4 および 34.1 ± 0.9 kPa と記録されました (p < 0.05、図 1b)。次に、ラットの心室組織から単離した H9C2 筋芽細胞株を利用して、in vitro プラットフォームをテストしました。 H9C2 細胞を、ECM タンパク質ラミニンでコーティングされたヒドロゲル基板上にプレーティングしました。硬いヒドロゲル上にプレーティングされた H9C2 細胞は、柔らかいヒドロゲルと比較して圧縮剛性の大幅な増加を示しました（p < 0.05、補足図1a）。さらに、免疫組織化学研究では、硬さの細胞マーカーであるラミン A と機械感知タンパク質ビンキュリンの有意な増加が明らかになりました（p < 0.05、補足図 1b–e）27、28、29。これらのデータは、ヒドロゲルプラットフォームの圧縮剛性を変更するだけで、セルの剛性を変更するのに十分であることを示しています。

a 野生型心筋細胞におけるL型カルシウムチャネル、細胞骨格ネットワークおよびミトコンドリアの間の構造機能的つながりを示す概略図。標的リンカー部位 (1) L型カルシウムチャネルα相互作用ドメイン(AID)、(2) L型カルシウムチャネルβ2サブユニットとAHNAKとの相互作用部位、(3) F-アクチン、(4) β-チューブリン、 (5) β1 インテグリン。 b 平均±SEMを含む、製造条件（柔らかいおよび硬い）下でのポリアクリルアミド（PA）ヒドロゲルの圧縮剛性（kPa単位）。 c 平均±SEMを含む、柔らかいおよび硬いヒドロゲル上にプレーティングされたwt心筋細胞の圧縮剛性（kPa単位）。平均±SEMを含む、ラミンA（d、e）、ビンキュリン（f、g）、およびインテグリン（h、i）について染色された、柔らかいおよび硬いヒドロゲル上にプレーティングされたwt心筋細胞の代表的な画像および定量化されたデータポイント。 n = セルの数、N = ヒドロゲルの数。統計的有意性はマン・ホイットニー検定によって決定されます。

次に、生後 10 ～ 15 週の野生型 (wt) マウスから単離した心筋細胞の研究を行いました。ラミニンでコーティングされた柔らかいおよび硬いヒドロゲル基板上にプレーティングされた筋細胞は、それぞれ約2および4 kPaの剛性をもたらしました（p < 0.05、図1c）。重要なのは、これらの値は、20 ～ 40 歳の健康な成人および HCM 成人で評価された心筋硬さの以前に報告された測定値と一致しています 18。硬いヒドロゲル上に播種された筋細胞は、ラミン A、ビンキュリン、および出生後の心臓で最も豊富に発現されるインテグリンアイソフォームである β1 インテグリンの有意な増加も示しました 23,30 (p < 0.05、図 1d–i)。これらのデータは、当社の in vitro プラットフォームが人間の状態を適切に表していることを示しています。

我々は、cTnI-G203S 心筋細胞が、LTCC の活性化に応答して、ミトコンドリア代謝活性の増加とヒトの状態 31 と一致する Ψm を示すことを以前に実証しました 6,17。ここで、我々は、HCM心筋を模倣した剛性を有するヒドロゲル上に野生型心筋細胞をプレーティングするだけで、これらの反応を反映するのに十分であるかどうかを検討した。我々は、チャネルアゴニストBayK(-)を使用して、LTCCの活性化に応答した、10〜15週齢のwtマウスから単離した心筋細胞におけるミトコンドリア代謝活性およびΨmに対する基質剛性の影響を試験した。代謝活動は、酸素消費と電子伝達系におけるミトコンドリアの電子輸送に依存します。したがって、フラボタンパク質の酸化の変化（自己蛍光として）をモニタリングすることにより、少なくとも3時間、柔らかく硬いヒドロゲル上にプレーティングされた無傷の心筋細胞におけるミトコンドリアの電子輸送の変化を測定しました。我々は、柔らかいヒドロゲルと硬いヒドロゲル上にプレーティングされた野生型筋細胞の両方が、アゴニストとして作用しないBayKの(+)エナンチオマー(BayK(+))と比較して、BayK(-)への曝露後にフラボタンパク質酸化の有意な増加を示すことを発見した(図1)。 2a–c)。ただし、BayK(-) 応答の大きさは、硬いヒドロゲルと柔らかいヒドロゲルで大幅に大きくなりました。重要なことに、BayK(-) によって誘導されるすべての応答は、LTCC アンタゴニストニソルジピンの適用により減弱され、LTCC が応答を媒介することが確認されました。これらのデータは、ECM の剛性の変化が LTCC によるミトコンドリア機能の調節を変化させるのに十分であることを示しています。

代表的なレシオメトリックフラボタンパク質 (a、b) および JC-1 (e、f) 蛍光。ニソルジピン (15 μM、Nisol) の有無。 JC-1 研究は、カルシウムを含まない条件 (0 mM カルシウム) で実施されました。矢印は薬物の追加を示します。シグナルの起源がミトコンドリアであることを確認するために、各フラボタンパク質実験の最後に FCCP (50 μM) を適用してフラボタンパク質の酸化を増加させました。 NaCN (40 mM) を各 JC-1 実験の最後に適用して、Ψm を崩壊させました。示されている薬物に曝露されたすべての筋細胞 (n) のフラボタンパク質全体 (c) および JC-1 (d) の蛍光 (平均 ± SEM を含む)。 d–h、BayK(+) または 10 μM BayK(-) への曝露後に心筋症 cTnI-G203S マウスおよび野生型対応マウスから分離された心筋細胞 (n、懸濁液中) のフラボタンパク質 (d) および JC-1 (h) の蛍光 17 。すべての統計的有意性は、クラスカル-ウォリス検定、またはブラウン-フォーサイスおよびウェルチの ANOVA 検定 (i) によって決定されます。

チャネルとミトコンドリアの間の構造-機能伝達に対する基板の剛性の影響を調べるために、カルシウムのない条件下でのΨmの変化も評価しました。酸化的リン酸化はカルシウム依存性のプロセスですが、Ψm は細胞内カルシウムが低い (0 ～ 535 nM) 条件下では高度に分極したままです 32,33。実際、マウスおよびモルモットの心筋細胞で行われた研究では、細胞膜の電位固定、高 K+ 溶液または BayK(-) の適用による LTCC の活性化により、カルシウムが存在しない場合でも Ψm が増加することが実証されています9 。ラトランキュリン A またはコルヒチンによるアクチンまたは β-チューブリンの解重合、またはジストロフィンの非存在下では、Ψm の上昇が減衰します。これは、応答が無傷の細胞骨格構造に依存していることを示しています 6、7、9、16。ここで、観察されたフラビンタンパク質酸化の変化と一致して、我々は、軟らかいヒドロゲルおよび硬いヒドロゲル上にプレーティングされ、カルシウムを含まないHBSおよびEGTA含有HBS中で少なくとも3時間インキュベートされた野生型筋細胞の両方が、BayK(- ) 対 BayK(+) (図 2e–g)。もう一度言いますが、BayK(-) 応答の大きさは、硬いヒドロゲルと柔らかいヒドロゲルで著しく大きかった。 BayK(-) 誘発反応はすべてニソルジピンにより消失し、LTCC が反応を媒介したことが確認されました。これらのデータは、ECM の剛性の変化が LTCC とミトコンドリアの間の構造機能的コミュニケーションを変化させるのに十分であることを示しています。

重要なことに、硬いヒドロゲルと柔らかいヒドロゲル上にプレーティングされた野生型筋細胞で観察された代謝活性とΨmの変化は、cTnI-G203S対野生型心筋細胞から得られた以前のデータを模倣しました（図2d、h）6、17。これらのデータは、ECM の剛性の増加が HCM の病態生理の進行に寄与する可能性があることを示しています。

我々は、基板剛性の増加に応じたミトコンドリア機能の潜在的なメディエーターとして、LTCCとミトコンドリアの間のさまざまな「リンカー」部位を調べた。我々は、LTCC β2 サブユニット（AID-TAT）を固定化する心臓 LTCC AID に対して特異的に誘導されたペプチドの存在下で、BayK（−）によって誘発されるフラボタンパク質酸化とΨm の両方の増加が、柔らかく硬いヒドロゲル上にプレーティングされた野生型筋細胞において大幅に減弱されることを発見した。ペプチド、図 1a) (図 3a ～ f)。同様の結果が、LTCC β2サブユニットとAHNAKの間の相互作用部位を標的とするペプチド（AHNAK-P4N-TAT、図1a）の存在下でも観察されました（図3a〜f）。同様に、BayK（-）によって誘発されたフラボタンパク質酸化とΨmの両方の変化は、アクチンまたはβチューブリン脱重合剤であるラトランキュリンAまたはコルヒチンの存在下でそれぞれ消失しました（図3g-l）。これらのデータは、ECM の剛性が変化した条件下でミトコンドリアの機能を調節する細胞骨格ネットワークを介した、心臓の LTCC とミトコンドリアの間の重要な構造機能ネットワークを確認します。

10 μM BayK(+) への曝露前後に、軟質および硬質ヒドロゲル上にプレーティングされた野生型心筋細胞から記録された、代表的なレシオメトリックフラボタンパク質 (a、b および g、h) および JC-1 (d、e および j、k) 蛍光、またはAID-TAT (10 μM)、AHNAK-P4N-TAT (1 μM)、Latrunculin A (Latrunc、5 μM、20 分間プレインキュベーション) またはコルヒチン (Colch、1) の非存在下または存在下での 10 μM BayK(-) μM、3 時間のプレインキュベーション 51)。 JC-1 研究は、カルシウムを含まない条件 (0 mM カルシウム) で実施されました。矢印は薬物の追加を示します。シグナルの起源がミトコンドリアであることを確認するために、各フラボタンパク質実験の最後に FCCP (50 μM) を適用してフラボタンパク質の酸化を増加させました。 NaCN (40 mM) を各 JC-1 実験の最後に適用して、Ψm を崩壊させました。示されている薬物に曝露されたすべての筋細胞 (n) の全体的なフラボタンパク質 (c および i) および JC-1 (f および l) の蛍光 (平均 ± SEM を含む)。すべての統計的有意性はクラスカル-ウォリス検定によって決定されます。

細胞骨格ネットワークを介したLTCCとミトコンドリア間の細胞内リンクに加えて、インテグリンを介したECMとF-アクチンの間にも構造機能的関連が存在すると思われる。興味深いことに、ここでは、BayK（−）によって引き起こされるフラボタンパク質酸化とΨmの両方の変化が、マウスβ1インテグリン機能を遮断する抗体の存在下で、軟らかいヒドロゲルおよび硬いヒドロゲル上にプレーティングされた野生型筋細胞において著しく減弱されたことを発見した（CD-29、図1a） ) (図 4a ～ f)。全体として、これらのデータは、心臓のLTCCとインテグリンが、健康な表現型とHCM表現型を模倣するECM硬さの条件下でミトコンドリア機能の媒介にパートナーとして関与している可能性があることを示唆しています。私たちは、細胞内の剛性を操作することでこのネットワークをさらに調査しました。我々は、柔らかくて硬いヒドロゲル上にプレーティングされた野生型筋細胞を、F-アクチンを安定化し、それによって細胞骨格ネットワークを硬化させる薬剤であるジャスプラキノリドに曝露すると、フラボタンパク質の酸化とΨmの大幅な増加を誘導するのに十分であることを発見した（図4g-l）。これは、両方の条件下でのミトコンドリア機能の調節における細胞骨格の剛性の潜在的な役割を示しています。これらの発見は、細胞骨格タンパク質の変化がミトコンドリア機能に影響を与えるのに十分であることを実証する研究によって裏付けられています13、14、15。

10 μM BayK(+)、ジャスプラキノリドへの曝露前後に、軟質および硬質ハイドロゲル上にプレーティングされた野生型心筋細胞から記録された、代表的なレシオメトリックフラボタンパク質 (a、b および g、h) および JC-1 (d、e および j、k) 蛍光(Jasp、1μM、20分間プレインキュベーション)、またはCD-29の非存在下または存在下で10μM BayK(-)(5μg/ml、30分間プレインキュベーション)。 JC-1 研究は、カルシウムを含まない条件 (0 mM カルシウム) で実施されました。矢印は薬物の追加を示します。シグナルの起源がミトコンドリアであることを確認するために、各フラボタンパク質実験の最後に FCCP (50 μM) を適用してフラボタンパク質の酸化を増加させました。 NaCN (40 mM) を各 JC-1 実験の最後に適用して、Ψm を崩壊させました。示されている薬物に曝露されたすべての筋細胞 (n) の全体的なフラボタンパク質 (c および i) および JC-1 (f および l) の蛍光 (平均 ± SEM を含む)。すべての統計的有意性はクラスカル-ウォリス検定によって決定されます。

我々は、HCMが確立されたcTnI-G203Sマウスから単離された心筋細胞のΨmおよびミトコンドリア代謝活性に対する基質剛性の低下の効果を試験することにより、cTnI変異Gly203Serから生じるcTnI-G203Sの代謝亢進ミトコンドリア状態の可逆性を調査した。 cTnI-G203S マウスは、21 週齢から肥大や収縮亢進などの HCM の顕著な特徴を示します 5、6、17、35。したがって、生後30〜50週のcTnI-G203S心筋細胞と年齢が一致した野生型心筋細胞を、それぞれ先天性HCMと健康な状態を模倣するために、硬いヒドロゲルと柔らかいヒドロゲル上に少なくとも3時間プレーティングしました。次に、細胞の硬さとミトコンドリア機能の変化を評価しました。 10〜15週齢の野生型心筋細胞から収集されたデータと一致して、硬いヒドロゲル上に播種された30〜50週齢の野生型心筋細胞は、柔らかいヒドロゲルと比較して圧縮剛性の有意な増加を示しました（p < 0.05、図5a）。さらに、柔らかいヒドロゲル上にプレーティングされた30〜50週齢のcTnI-G203S筋細胞は、硬いヒドロゲル上にプレーティングされたものと比較して圧縮剛性の大幅な減少を示しました（p < 0.05、図5a）。これらのデータは、野生型心筋細胞の圧縮剛性を操作して cTnI-G203S 筋細胞の圧縮剛性を模倣することができること、またその逆も同様であることを実証しています。 HCM表現型と一致して、柔らかいまたは硬い条件で播種した場合、cTnI-G203S対野生型筋細胞で誇張された応答が観察されました（図5a）。ラミン A またはビンキュリンの発現の変化は観察されませんでしたが、ソフトヒドロゲル上に cTnI-G203S 筋細胞をプレーティングすると、β1-インテグリン発現が大幅に減少し（図 5b-g）、インテグリンが cTnI-G203S 筋細胞の重要な機械感知タンパク質であることが示唆されました。。

a 心筋症cTnI-G203Sマウスおよび軟らかいヒドロゲルおよび硬いヒドロゲル上にプレーティングされた野生型対応物から単離された心筋細胞の圧縮剛性（kPa単位）（平均±SEMを含む）。 b – g ラミンA（b、c）、ビンキュリン（d、e）、およびインテグリン（f、g）で染色された硬いおよび柔らかいヒドロゲルに播種されたcTnI-G203S心筋細胞の代表的な画像と定量データポイント（平均±SEMを含む）。 n = セルの数、N = ゲルの数。すべての統計的有意性は、Mann Whitney 検定または Kruskal-Wallis 検定によって決定されます (a)。

また、BayK(-)を用いたLTCCの活性化に応答した、硬質および軟質ヒドロゲル上に播種した30〜50週齢のcTnI-G203Sマウスから単離した心筋細胞におけるミトコンドリア代謝活性およびΨmの変化を測定した。硬いヒドロゲルと柔らかいヒドロゲル上にプレーティングされたcTnI-G203S筋細胞は両方とも、BayK（-）とBayK（+）への曝露後にフラボタンパク質の酸化とΨmの有意な増加を示すことがわかりました（図6a〜f）。 BayK(-) 応答の大きさは、柔らかいハイドロゲルと硬いハイドロゲルでは大幅に減少し、ECM の剛性が cTnI-G203S の病態生理学におけるミトコンドリア機能の変化の調節に重要な役割を果たしていることを示しています。 BayK（−）によって誘発されるすべての応答は、ニソルジピンまたはAID-TATの適用により減衰する可能性があり（図6a〜f）、LTCCとミトコンドリアの間の構造機能的コミュニケーションが応答を媒介することが確認されました。これに加えて、BayK（−）によって誘発されるフラボタンパク質の酸化とΨmの変化は、CD-29の存在下で大幅に減衰しましたが、ジャスプラキノリド単独の適用はフラボタンパク質の酸化とΨmの大幅な増加を誘発するのに十分でした（図6g-l）。。総合すると、これらのデータは、心臓のLTCCとインテグリンが、cTnI-G203S筋細胞によって示される代謝亢進状態のミトコンドリア状態の仲介にパートナーとして関与している可能性があることを示唆している。

10 μM BayK への曝露前後の硬質および軟質ハイドロゲル上にプレーティングされた心筋症 cTnI-G203S マウスから単離された心筋細胞を、代表的なレシオメトリックフラビンタンパク質 (a、b および g、h) および JC-1 (d、e および j、k) 蛍光で記録しました。 (+)、ニソルジピン (15 μM、Nisol)、AID-TAT (10 μM)、または CD- の非存在下または存在下でのジャスプラキノリド (Jasp、1 μM、20 分間のプレインキュベーション)、または 10 μM BayK(-) ２９（５μｇ／ｍｌ、３０分間のプレインキュベーション）。 JC-1 研究は、カルシウムを含まない条件 (0 mM カルシウム) で実施されました。矢印は薬物の追加を示します。シグナルの起源がミトコンドリアであることを確認するために、各フラボタンパク質実験の最後に FCCP (50 μM) を適用してフラボタンパク質の酸化を増加させました。 NaCN (40 mM) を各 JC-1 実験の最後に適用して、Ψm を崩壊させました。示されている薬物に曝露されたすべての筋細胞 (n) の全体的なフラボタンパク質 (c および i) および JC-1 (f および l) の蛍光 (平均 ± SEM を含む)。すべての統計的有意性はクラスカル-ウォリス検定によって決定されます。

疾患の進行におけるLTCCおよびβ1インテグリンの役割をさらに調査するために、心筋症前および心筋症後のcTnI-G203Sマウスから収集した全心臓ホモジネート中のLTCCおよびβ1インテグリンの発現レベルを評価した。心筋症前および後のcTnI-G203S心臓または年齢が一致した野生型心臓では、LTCC発現に有意差は見つかりませんでした（図7a、bおよび補足図2）。ただし、β1インテグリン発現の変化は、野生型と比較して心筋症前後のcTnI-G203S心臓で観察され、最も大幅な増加は心筋症後の心臓で発生しました（図7c、dおよび補足図2）。全体として、インテグリン発現の変化は、cTnI-G203S HCM 疾患の進行の後期に「悪化」するようです。これは不適応状態を示している可能性があります36。

L 型カルシウムチャネル (a、b) および β1 インテグリン (c、d) タンパク質発現の免疫ブロット分析は、心筋症前 (10 ～ 15 週齢) または心筋症後 (30 –50 週齢）cTnI-G203S マウスと同年齢の野生型対応マウス。代表的なイムノブロットは、L 型カルシウムチャネル α1C サブユニット (CaV1.2、a) または β1 インテグリン (c) 抗体、次に GAPDH モノクローナル抗体でプローブされました。関連する GAPDH 発現に対して正規化された、CaV1.2 (b) または β1 インテグリン (d) タンパク質発現のデンシトメトリー分析。 n = テクニカルリピートの数。 Browne-Forsythe および Welch ANOVA (b) または Kruskal-Wallis 検定 (d) により、統計的有意性が決定されました。 5匹の心筋症前または心筋症後cTnI-G203Sマウスおよび年齢が一致した野生型対応マウスのグループからプールされた細胞質（e）および核（f）画分に対して実行された、相対的なmTOR発現（リン酸化mTOR/総mTORとして計算）のデンシトメトリー分析。 β-チューブリンおよびヒストンH2B抗体を、それぞれ細胞質および核画分のローディングコントロールとして使用しました。 n = テクニカルリピートの数。 Browne-Forsythe および Welch ANOVA (e) または Kruskal-Wallis 検定 (f) により、統計的有意性が決定されました。 g 野生型およびcTnI-G203S心筋細胞におけるL型カルシウムチャネル、細胞骨格ネットワーク、ミトコンドリア、インテグリンおよび細胞外マトリックス間の構造機能的関連を示す概略図。 cTnI-G203S 心筋細胞における細胞骨格構造の破壊は、増加した細胞骨格と細胞外マトリックスの間で不適応なフィードバック機構を引き起こし、その結果ミトコンドリアの代謝亢進状態を引き起こす可能性があります。

哺乳類ラパマイシン標的 (mTOR) はカルシウム非依存性シグナル伝達経路であり、タンパク質合成、ミトコンドリア生合成、細胞代謝の重要な調節因子であり、HCM の発生に関与していると考えられています37、38、39。 cTnI-G203S マウスから単離された筋細胞は、野生型筋細胞と比較してミトコンドリアのサイズと密度の増加を示しますが、細胞内カルシウム濃度には変化がありません 2,3。したがって、ここでは、cTnI-G203S 心筋症の発症における mTOR の関与をテストしました。 LTCC 媒介ミトコンドリア代謝活性の変化と、その結果として生じるミトコンドリアの代謝亢進状態は、cTnI-G203S 病理の発症前に発生します 6,17。タンパク質発現の変化が疾患進行の初期に起こるか後期に起こるかを判断するために、心筋症前および心筋症後の cTnI-G203S マウスの心臓から調製した細胞質および核画分における mTOR 発現を評価しました。リン酸化mTOR（リン酸化mTOR）の発現を総mTORに対して正規化し、「相対」mTOR発現を求めました（個々のリン酸化mTORおよび総mTORデータについては補足図3および4を参照してください）。我々は、相対的なmTOR発現が心筋症後と心筋症前cTnI-G203Sおよび野生型細胞質（図7e）および核画分（図7f）で有意に増加していることを発見した。 mTOR が「正常な」心臓の老化プロセスに役割を果たしている可能性があるという考えを裏付けています 37。しかし注目すべきことに、相対的なmTOR発現は、心筋症前および後の両方のcTnI-G203S核画分と、年齢を一致させたwt対応物と比較して有意に上昇した(図7f)。これらのデータは、mTOR の活性化も疾患の初期段階に寄与している可能性があることを示唆しています。ただし、疾患進行における mTOR の因果的役割を確認するには、この研究で説明したプラットフォームを利用したさらなる機能研究が必要となります。

LTCC とミトコンドリアの間の細胞内「コミュニケーションの崩壊」は、cTnI および β-ミオシン重鎖遺伝子の変異から生じるミトコンドリアの代謝亢進状態に寄与します 6、17、31。これらの対応は HCM の開発に先立って行われます。 ECM タンパク質合成の増加は、ヒト HCM 病理の進行に関与していると考えられています 20、21、22。ここでは、HCM 心筋硬度を模倣する in vitro プラットフォームを利用して、基板の剛性の変化が LTCC とミトコンドリアの間の構造機能コミュニケーションを調節できることを実証します。これは、健康な条件下でもHCM条件下でも、細胞骨格ネットワーク内の主要な「リンカー」部位を介して起こるようです（図2および6）。これにより、LTCC の上流における ECM の剛性の増加が、Gly203Ser 遺伝子変異に起因する HCM の病態生理の進行に寄与している可能性があると考えられます。これを裏付けるように、健康なヒトの人工多能性幹細胞由来の心筋細胞を、HCM のブタモデルから採取した脱細胞化心筋のストリップ上に播種することによって作成された人工心臓組織は、剛性の増加を示します 21。

われわれは、機械感知タンパク質β1-インテグリンを阻害すると、ミトコンドリア代謝活性におけるLTCC誘発性の変化が消失する一方、細胞骨格の剛性の増加は、ミトコンドリア機能におけるLTCC誘発性の変化をシミュレートすることを見出した（図4および6）。興味深いことに、心臓の LTCC と β1-インテグリンは、構造的および機能的に F-アクチンと結合する膜貫通タンパク質です 12、23、25、26。心臓の機械伝達がインサイドアウトとアウトサイドインの両方で起こるという十分な証拠があります40,41。これにより、我々は、インテグリンを介したECMと細胞骨格ネットワーク間のフィードバック機構を提案する。この機構は、健康な状態下ではLTCCを介したミトコンドリア機能の変化の調節を支援するが、サルコメア遺伝子変異Gly203Serに反応して不適応となり、それによって症状の進行に関与する。 HCM の病態 (図 7g)。健康な条件とHCM条件の両方でLTCCによるミトコンドリア機能の調節に対する基質の剛性の変化の影響を評価するために、この論文のすべての研究は静止心筋細胞で行われました。さらに、LTCCとミトコンドリアの間の構造と機能のつながりの代謝調節の役割を調べるために、カルシウムを含まない条件下でΨmの変化を実施しました。この研究で特定されたメカニズムに対する ECM の剛性の役割をさらに解明するには、収縮性の測定を含む将来の研究が必要となるでしょう。

遺伝子研究により、HCM4 の発症に関連する 1,500 を超える異なるサルコメア遺伝子変異が特定されています。 HCM の病態生理学を調査した研究のレビューにより、いくつかの類似点が存在するものの、各変異は変異特異的な病態生理学につながるようであることが明らかになりました 42。したがって、サルコメア遺伝子変異を引き起こす特定の HCM の発生における提案されたメカニズムの関与を確認するには、さらなる研究が必要となります。治療の観点から、cTnI-G203S マウスを AID-TAT で治療すると、LTCC 動態、ミトコンドリア代謝活性が回復し、肥大の発症が防止されます 17。サルコメア遺伝子変異が確認された HCM 患者の心臓組織のプロテオミクス分析を含む他の研究では、微小管ネットワークが潜在的な治療標的であることが示唆されています 43。これらの発見は、ECM の硬さに対する下流の細胞反応を標的にすることが予防療法の開発において重要な考慮事項である可能性があるという考えを裏付けています 44。さらなる特徴付けにより、LTCCとミトコンドリアの間の重要な「リンカー」部位および/またはサルコメアタンパク質の修飾は、サルコメア遺伝子変異が確認された患者に対するHCM治療アプローチの開発における潜在的な治療標的となる可能性がある。

ポリアクリルアミド (PA) ヒドロゲルは、以前に記載された方法 45 に基づいて製造されました。健康な (柔らかい) 心筋と HCM (硬い) 心筋を模倣するヒドロゲル用のプレポリマーソリューションは、アクリルアミド (Bio-Rad)、ビスアクリルアミド (Bio-Rad)、ダルベッコ PBS (Mg2+ および Ca2+ フリー) (Life Technologies) および脱イオン H2O (レシピについては表 1 を参照)。カバースリップをオゾンクリーナー (Bioforce Nanosciences UV/Ozone ProCleaner) で各面 1 分間洗浄および活性化した後、メタクリル酸 3-(トリメトキシシリル)プロピル (0.5% V/V) (Merck) を含む溶液で 5 分間官能化しました。、氷酢酸 (3% V/V) および純粋なエタノール (96.5% V/V)。機能化されたカバースリップをエタノールで 1 分間洗浄し、空気中で乾燥させた後、ジメチルジクロロシラン (DCDMS) でコーティングして平らな非粘着性の表面を作成し、ヒドロゲルを作製しました。次に、10 μl の過硫酸アンモニウム (APS) (Bio-Rad) および 1 μl の N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED) (Bio-Rad) を 1 ml のプレポリマー溶液。次に、4 または 12 μl のポリマー溶液を DCDMS コーティングされたスライドガラス上にピペットで移し、最終高さ 50 μm を達成しました (それぞれ直径 10 mm の円形または 15 × 15 mm2 正方形のカバースリップの場合)。次に、機能化されたカバースリップをその上に静かに置きました。ヒドロゲルを 20 分間重合させた後、DCDMS コーティングされたスライドからカバースリップを取り外し、UV 滅菌しました。

ヒドロゲルを 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液 (HEPES) (50 mM、pH 8.5) (Life Technologies) で 3 回すすいでから、N-スルホスクシンイミジル-6-(4'-アジド-2) に浸漬しました。 '-ニトロフェニルアミノ) ヘキサノエート (スルホ-SANPAH; Thermo Scientific) HEPES (1 mg/ml)。 Sulfo-SANPAH を UV 光 (365 nm、10 分間) で活性化し、その後除去し、ヒドロゲルを HEPES で洗浄しました。次に、ヒドロゲルを HEPES (25 μg/ml) 中のマウスラミニン (ThermoFisher 23017015) に浸し、37 °C で一晩インキュベートしました。使用前に、ヒドロゲルを PBS ですすぎ、結合していないラミニンを除去しました。

原子間力顕微鏡 (AFM) を使用して、ヒドロゲルと単一細胞の圧縮剛性をヤング率で測定しました。測定は、MFP-3D 原子間力顕微鏡 (Asylum Research) を使用し、三角形の先端を備えた 200 μm クロム/金コーティングされたパイレックス窒化物カンチレバー (Nano World モデル PNP-TR) を使用して行われました。測定は 1× PBS (Mg2+ および Ca2+ を含まない) で行われ、2nN のくぼみでプローブされました (アプローチ速度: 2 μm/s、後退速度: 10 μm/s)。前述のように、接触によって生成された力曲線の線形部分は、Igor Pro でカスタム作成されたコードを通じてヤング率を決定するために使用されました 46。測定の安定性を確保するためにくぼみを 3 回作成し、平均してくぼみあたりの平均剛性を求めました。各ヒドロゲルの 6 つの点がランダムに選択され、凹みが付けられました。これら 6 つのくぼみの平均は、ヒドロゲルの全体的な圧縮剛性の推定値として使用されました 47。ヒドロゲルの剛性が一貫していることを保証するために、生物学的反復ごとに 2 つの技術的反復が特徴付けられました。細胞の硬さは、単一細胞の中心がくぼむことによって特徴づけられました。生物学的反復ごとに約 28 個の細胞がインデントされました 27,48。単一細胞の剛性については、生物学的反復ごとに 4 つの技術的反復が実行されました。条件ごとに少なくとも 4 つの生物学的反復を実行しました。

ラットの心室組織から単離された H9C2 筋芽細胞株は、European Collection of Cell Cultures (ECACC、英国ソールズベリー) から供給され、CellBank Australia (ニューサウスウェールズ州ウェストミード、カタログ番号 88092904) から購入しました。 H9C2 細胞は ECACC の指示に従って培養しました。細胞を、4 mM グルタミンおよび 10% ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM、高グルコース、ピルビン酸、ThermoFisher) で構成される完全増殖培地中で蘇生させました。細胞は 1 ～ 3 × 10,000 細胞/cm2 で播種されました。培地交換は 2 ～ 3 日に 1 回行った。継代培養は約 70 ～ 80% のコンフルエンスで実行されました。 PAヒドロゲル上に継代培養またはプレートするために、DMEMを除去して廃棄し、0.25%トリプシン-EDTA（ThermoFisher）に置き換え、約3分間（37℃）インキュベートした後、細胞懸濁液を1200 rpm（5分間）で遠心分離しました。次いで上清を除去し、ペレットを予め温めた完全増殖培地に再懸濁した。 PA ハイドロゲルの場合、細胞をハイドロゲル (柔らかいまたは硬い) あたり 10,000 細胞でプレーティングし、実験前に 37 °C で 24 ～ 48 時間インキュベートしました。

すべての研究には雄のマウスを使用しました。変異cTnI-G203Sを引き起こすヒトHCMをコードするヒトcTnI遺伝子を発現するマウスから単離された成体心筋細胞を使用した。マウスは 21 週目までに HCM の顕著な特徴を発現します 5、6、17、35。生後 10 ～ 15 週齢（心筋症前）および生後 30 ～ 50 週齢（心筋症後）の cTnI-G203S マウスを in vitro および ex vivo 研究に使用しました。正常なヒトcTnI遺伝子を発現する年齢を一致させたマウスを対照(wt)として使用した。雄のマウスを使用して、性別による反応の潜在的な差異を排除しました。実験は、合計74匹の10～15週齢のwtマウス、10匹の10～15週齢のcTnI-G203Sマウス、16匹の30～50週齢のwtマウス、および45匹の30～15週齢のwtマウスで行われた。 50週齢のcTnI-G203Sマウス。すべての動物を無作為に治療グループに割り当てました。すべての動物研究は、科学的目的のための動物の管理と使用に関するオーストラリア実践規範 (NHMRC、第 8 版、2013) に従って、西オーストラリア大学の動物倫理委員会によって承認されました。

成体の心筋細胞は、以前に記載されているように、wt マウスおよび cTnI-G203S マウスから単離されました 16、17、49。マウスをペントバルビトンナトリウム（２４０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射）で麻酔し、次いで心臓を切除し、大動脈を介してランゲンドルフ装置にカニューレを挿入した。心臓を、(mM) 120 NaCl、25 NaHCO3、4.8 KCl、2.2 MgSO4、1.2 NaH2PO4 および 11 グルコース (pH = 7.35、37 °C で O2/CO2 を使用) を含むクレブス・ヘンゼライト緩衝液 (KHB) で以下の条件で灌流しました。 37℃で1分間、次に2.4 mg/mlコラゲナーゼBの存在下で3分間、次に40μMカルシウムの存在下で8分間。灌流後、心室組織を引き裂き、粉砕して筋細胞を懸濁液に解離させた。筋細胞懸濁液を20分間静置し、上清を廃棄し、筋細胞を、5.3 KCl、0.4 MgSO4・7H2O、139 NaCl、5.6 Na2HPO4・2H2O、5 グルコースを含むカルシウムフリーHepes緩衝液（HBS）に再懸濁しました（mM）。、20 Hepes、および 2 グルタミン (37 °C で pH = 7.4)、3 mM EGTA の存在下または非存在下 (0 mM カルシウム実験の場合)。カルシウムを含む実験では、最終細胞外濃度が 1.8 mM になるようにカルシウムを滴定し直しました。筋細胞懸濁液をヒドロゲル上にプレーティングし、実験前に 37 °C で少なくとも 3 時間インキュベートしました。すべての in vitro 研究は、37 °C で新たに単離した静止筋細胞で実施されました。

細胞は、以前に記載された方法 7,16 に基づいて共焦点イメージング用に準備されました。プレーティングおよびインキュベーション後、H9C2 細胞または成人心筋細胞を、mM: 13 KCl、7.35 KH2PO4、0.69 NaCl、40.4 および 40.4 Na2HPO4・7H2O (pH = 7.4) を含むリン酸緩衝食塩水 (PBS) で 3 回洗浄し、固定しました。 4% パラホルムアルデヒド (PBS 中の PFA、15 分間) で処理し、0.3% Triton X-100 (15 分間) で透過処理しました。透過処理後、細胞を 5% ヤギ血清および 5% ウマ血清 (PBS 中) を含むブロッキング溶液中で 37 °C で 1 時間インキュベートしました。次に細胞を、5％BSA中で一次抗体ラミンA（1：400、Abcam、ab26300）およびビンキュリン（1：200、Abcam、ab130007）とともにインキュベートしました（PBS中、37℃で1時間）。次に細胞をローダミンファロイジン (TRITC、1:400、ThermoFisher、R415)、ヤギ F(ab) 抗ウサギ IgG H&L (FITC、1:200、Abcam ab7050)、およびヤギ抗マウス IgG H&L (Alexa Fluor®) とインキュベートしました。 647、1:200、Abcam ab150115) 5% BSA 溶液 (PBS、37 °C で 1 時間)。あるいは、細胞を 5% BSA 中で β1 インテグリン一次抗体 (1:100、ThermoFisher MA1-06906) (PBS 中、37 °C で 1 時間) とインキュベートし、続いてヤギ抗マウス IgG H&L (Alexa Fluor® Plus) とインキュベートしました。 488、1:400、ThermoFisher A32723) 5% BSA 溶液 (PBS、37 °C で 1 時間)。最後に、細胞を核酸染色 DAPI (PBS 中 1:200、Sigma-Aldrich D9542) とともに室温で 10 分間インキュベートした後、イメージングのためにスライドガラスにマウントしました。細胞は、Olympus IX71倒立蛍光顕微鏡で倍率60倍で画像化されました。

5,5',6,6'-テトラクロロ-1,1',3,3'-テトラエチルベンズイミダゾリルカルボシアニンヨージド (JC-1) は、Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) から購入しました。シアン化カルボニル-4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (FCCP)、コルヒチン、ラトランキュリン A、ニソルジピン、(S)-(-)-Bay K8644 (BayK(-)) およびシアン化ナトリウム (NaCN) は、Merck (Kenilworth、News) から購入しました。米国ジャージー州）。ジャスプラキノリドは、Cayman Chemical (米国ミシガン州アナーバー) から購入しました。 (R)-(+)-Bay K8644 (BayK(+))、BioVision (米国カリフォルニア州ミルピタス) 製。およびＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国ニュージャージー州フランクリン・レイクス）からのＣＤ−２９。 AID-TAT ペプチドは、6-アミノヘキサン酸 (AusPep、Tullamarine、Victoria、AUS) を介して結合された細胞透過性 TAT 配列 (RKKRRQRRR) を含むアミノ酸配列 QQLEEDLKGYLDWITQAE を使用して合成されました。 AHNAK-P4N-TATペプチドは、前述のようにTAT配列に連結されたアミノ酸配列KGKHGKLKFGTFGGLGGSKSKGHYEVTを使用して合成した(Mimotopes Pty Ltd、ビクトリア、オーストラリア)。

ミトコンドリア膜電位 (Ψm) は、蛍光指示薬 JC-1 (200 nM、インキュベーション期間 = 3 時間、ex = 480 nm、em = 580/535 nm、間隔 = 2 分、露出 = 50 ms) を使用して評価されました 16,17。各実験の最後に、ミトコンドリアの電子輸送ブロッカーであるシアン化ナトリウムを適用して Ψm を崩壊させ、JC-1 シグナルが Ψm (NaCN、40 mM) を示していることを確認しました。ミトコンドリアのフラボタンパク質の酸化は、以前に記載されているように筋細胞の自己蛍光を記録することによって評価されました（ex = 480 nm、em = 535 nm、間隔 = 1 分、露出 = 250 ms）16,17。ミトコンドリア電子伝達系脱共役剤 FCCP (50 μM) を各実験の最後に添加してフラボタンパク質の酸化を増加させ、シグナルがミトコンドリア起源であることを確認しました。すべての in vitro 蛍光は、倒立 Nikon TE2000-U 顕微鏡に取り付けられた Andor Zyla SCMOS 5.5 MP カメラで測定されました。レシオメトリックな JC-1 またはフラボタンパク質の蛍光画像は、Metamorph 7.10 を使用して定量化されました。筋細胞を含む領域を手動で追跡して、各細胞の蛍光シグナルを取得しました。細胞を含まない同等の領域をバックグラウンドとして使用し、各細胞について差し引いた。治療に対する反応は、治療前（基礎）平均からの増加または減少の割合として報告されました。

すべてのサンプルのタンパク質濃度は、BSA を標準として使用するブラッドフォードタンパク質アッセイを使用して定量されました。 25 µg のサンプルをプレキャスト 10% BIO-RAD Mini-PROTEAN® TGX Stain-FreeTM SDS ポリアクリルアミドゲル (Bio-RAD Laboratories) にロードし、電気泳動によって 0.2 µm ニトロセルロースメンブレン (Trans-Blot® TurboTM Transfer Pack、Bio-RAD Laboratories) に転写しました。 RAD Laboratories)、Bio-RAD Trans-Blot® TurboTM Transfer System を使用。ブロットは、（mM単位で）トリスHCl pH 6.8：62.5、2-メルカプトエタノール：100、2％SDS、50℃で30分間）からなるストリッピング緩衝液を使用して、各再プローブステップの間にストリッピングしました。定量的濃度測定は、Chemidoc イメージングシステム (Bio-rad) および ImageJ ソフトウェアを使用してキャプチャされた画像に対して実行されました。データは、同じブロットで検出されたローディングコントロールに対して正規化されたタンパク質発現の光学密度として表示されます。

免疫ブロット分析は、5匹の10〜15週齢および30〜50週齢のwtおよびcTnI-G203Sマウスのグループからプールされた全心臓ホモジネートに対して実施されました。簡単に説明すると、急速凍結した心臓の重量を量り、乳鉢と乳棒を使用して液体窒素中で微粉末に粉砕し、NaCl 150、Tris 50、Na4P2O7 20、Na3VO4 2、NaF からなる 1:4 RIPA バッファー (mM) 中でホモジナイズしました。 1、0.5% デオキシコール酸 Na、1 % Triton X-100、0.1 % SDS、pH 7.4、cOmplete™、Mini、EDTA フリープロテアーゼ (Roche、4693159001)、および PhosStopTM ホスファターゼ (Roche、4906837001、1:100 希釈) を添加）阻害剤錠剤。次に、全心臓ホモジェネートを 4 °C、10,000 g で 5 分間遠心分離しました。ブロットは次の一次抗体でプローブされました: ウサギポリクローナル抗 CaV1.2 (Alomone、ACC-003、1:200) またはウサギモノクローナル抗 β1 インテグリン (D6S1W) (Cell Signaling Technology 34971、1:1000)。ウサギモノクローナル抗 GAPDH (Cell Signaling Technology、2118、1:1000) をローディングコントロールとして使用しました。次いで、ブロットをポリクローナルヤギ抗ウサギ IgG H&L (HRP) に事前に吸収させた二次抗体 (Abcam、ab97080、1:10,000) でプローブしました。

細胞内画分は、cOmplete™ を添加した NE-PERTM 核および細胞質抽出キット (ThermoFisher Scientific、78833) を使用して、10 ～ 15 週齢および 30 ～ 50 週齢の野生型心臓および cTnI-G203S 心臓の 5 つのグループから調製しました。、ミニ、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ（Ｒｏｃｈｅ、４６９３１５９００１）およびＰｈｏｓＳｔｏｐＴＭホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ、４９０６８３７００１）阻害剤錠剤（製造業者のプロトコルに従って）。ブロットは以下の一次抗体でプローブされました: Total mTOR、mTOR (7C10) ウサギ mAb (Cell Signaling Technology、2983、1:1000)。活性型 mTOR、phospho-mTOR (Ser2448) (D9C2) XP® Rabbit mAb (Cell Signaling Technology、5536、1:1000)。総 SRP6、S6 リボソームタンパク質 (5G10) ウサギ mAb (Cell Signaling Technology、2217、1:1000)。活性型 SRP6、ホスホ S6 リボソームタンパク質 (Ser235/236) (2F9) ウサギ mAb (Cell Signaling Technology、4856、1:1000)。次の一次抗体をローディングコントロールに使用しました: β-チューブリン抗体 (Cell Signaling Technology、2146、1:500)。ヒストン H2B (D2H6) ウサギ mAb (Cell Signaling Technology、12364、1:1000)。ブロットは、ヤギ抗ウサギ IgG H&L (HRP) に事前吸着された二次抗体 (Abcam、ab97080、1:10000) でプローブされました。同じ抗体を使用して、細胞質および核画分の純度を確認しました（補足図5）。

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結果は平均±SEMとして報告されます。ノンパラメトリックデータの場合、多重比較にマンホイットニー検定 (両側) またはクラスカルウォリス検定 (一元配置) を使用して、P < 0.05 で統計的有意性が認められました。パラメトリックデータについては、Brown-Forsythe and Welch ANOVA 検定 (一元配置) (GraphPad Prism バージョン 9.1.2) を使用して、P < 0.05 で統計的有意性が認められました。反復回数と統計的比較は数値で指定されます。

動物間変動および動物内変動を考慮してサンプルサイズを決定するために、検出力およびサンプルサイズソフトウェア（PS）が使用されました。これにより、実験グループの母集団平均が確率/検出力 0.95 に等しいという帰無仮説を棄却するには、各マウス系統/遺伝子型の 10 匹のマウスで応答を研究する必要があることが判明しました (タイプ I 過誤確率 = 0.05）。注目すべきことに、すべての in vitro データから得られた p 値の範囲は p < 0.0001 ～ p < 0.0216 であり、利用したサンプルサイズが設定された有意水準を超えるのに十分であることを示しています。

生細胞から得られたデータは除外されませんでした。生細胞内での複製の試みはすべて成功しました。インビトロ研究では、異なるアゴニスト/アンタゴニストの使用を伴う実験が、異なる実験日にランダムに実施されました。さらに、2 人の個人が 2 つの異なる蛍光実験装置で同時に実験を実行しました。 1 人は、正しい薬剤が正しい順序で適用されていることを確認するために、適用されているアゴニスト/アンタゴニストを把握していました。もう一人は失明しました。すべての場合において、データは個人間で確実に複製されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (および補足情報ファイル) に含まれています。ソースデータは補足データファイルで取得できます。

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mTOR イムノブロットデータの取得と処理における Sarah Wong 氏の技術的支援に感謝いたします。オーストラリア国立健康医学研究評議会プロジェクト助成金 APP1143203 (HMV)。オーストラリア国立保健医療研究評議会プロジェクト助成金 APP1098449 (YSC)。オーストラリア国立健康医学研究評議会上級研究フェローシップ APP1117366 (LCH)。オーストラリア心臓財団未来リーダーフェローシップ 101930 (HMV)。心臓財団オーストラリア未来リーダーフェローシップ 101173 (YSC)。オーストラリア政府研究研修プログラム奨学金 (ILC)。オーストラリア国立健康医学研究評議会の研究者助成金 APP1173015 (DS)。

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リヴィア・C・ホール

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概念化: HMV、LH データキュレーション: HMV、CR、TS、ILC、HCS、SS、DS 形式分析: HMV、ILC、YSC、HCS、SS、DS 調査: HMV、CR、TS、ILC、HCS、SS、DS方法論: HMV、YSC プロジェクト管理: HMV 監督: HMV、YSC、HCS、MC、LH 検証: HMV、YSC、MC ビジュアライゼーション: HMV 執筆—原案の準備: HMV 執筆—レビューおよび編集: HMV、CR、TS、ILC 、YSC、HCS、SS、DS、MC、LH

Helena M. Viola または Livia C. Hool との通信。

MC、SS、DS、および LH は、出願済みの特許 (オーストラリア出願番号 2021900252) の発明者です。他のすべての著者は、競合する利益を持っていないことを宣言します。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な編集者: Nicholas Kurniawan と Christina Karlsson Rosenthal。

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転載と許可

ヴィオラ、HM、リッチワース、C.、ソロモン、T. 他。細胞外マトリックスと細胞骨格の間の不適応フィードバック機構は、肥大型心筋症の病態生理学に寄与しています。 Commun Biol 6、4 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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受信日: 2022 年 2 月 22 日

受理日: 2022 年 11 月 17 日

公開日: 2023 年 1 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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細胞外マトリックスと細胞骨格間の不適応フィードバック機構が肥大型心筋症の病態生理学に寄与する