シンタキシン

Scientific Reports volume 12、記事番号: 14483 (2022) この記事を引用

1073 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

虚血性脳卒中（IS）を含むいくつかの神経疾患の血液バイオマーカー発見への関心が高まっており、血液サンプル中での血液バイオマーカーの同定は革新的であり、迅速かつより優れた病理予測や転帰を可能にし、患者の回復に関する情報を収集できると考えられる。 脳梗塞後の血液脳関門の透過性の増加により、血流中の脳タンパク質の検出が可能になります。 この研究では、末梢血単核球 (PBMC)、血清、および神経由来細胞外小胞 (NDE) における 2 つのシナプスタンパク質シンタキシン (STX)-1a およびシナプトソーム関連タンパク質 25 kDa (SNAP-25) の発現レベルを分析しました。 ) の IS 患者、年齢と性別が一致した健康対照 (HC) と若年 HC (Y-HC)。 興味深いことに、PBMC の細胞質で STX-1a タンパク質が同定され、STX-1a と SNAP-25 の両方の発現レベルが、対照被験者と比較してすべての IS 患者の血液分画で有意に増加していました。 さらに、STX-1a 血中濃度は、IS 臨床スケールである国立衛生研究所脳卒中スケール (NIH-SS) および修正バーセル指数 (BI) と相関していました。 これらの結果から、STX-1a および SNAP-25 の血液変動は虚血性発作後の脳損傷を示しており、それらの血液検出は新規で利用可能な IS バイオマーカーを表す可能性があると推測されました。

虚血性脳卒中は、脳への血液供給を減少させる血栓性イベントまたは塞栓性イベントに起因する重篤な病状です1。 これは先進国における死因の第 3 位であり (IS 患者の 40 ～ 60% は虚血性イベント後 5 年以内に死亡します)、認知症の原因として第 2 位に多いものです 2,3。 現在の治療法と患者の管理は、脳卒中後の平均余命を延ばすのに十分ではありません4,5。 通常の治療で遭遇する主な障害の 1 つは、病理の不均一性と患者の個人差であることは確かです。 実際、患者ごとに特定の治療法を調整する可能性は、医療上の満たされていないニーズです6。

脳卒中イベントの影響を受けた脳組織には、血流が完全になくなり数分以内に神経細胞死が起こる虚血性コアと、血流が適度にあるペナンブラとして識別できる 2 つの異なる損傷領域が存在します。脳組織は機能的には損なわれているものの、依然として半生存状態にある7。 虚血コア領域に位置するニューロンは、主に ATP (アデノシン三リン酸) の欠如、イオンおよびグルタミン酸濃度の上昇、組織アシドーシスなどの壊死メカニズムを通じて死滅します 8。 対照的に、血流（したがって酸素とグルコースの供給）が短時間内に回復しない場合、虚血性周縁部のニューロンは同様の運命をたどります。 周辺領域のニューロンは、細胞内への Ca2+ の増加によって引き起こされるアポトーシス経路の強力な活性化により死滅し、過剰なグルタミン酸放出により細胞死を引き起こします9。

グルタミン酸のオーバーフローとシナプス間隙におけるグルタミン酸の残留は、「興奮毒性」として知られる生化学的事象のカスケードを誘発します。これには、グルタミン酸受容体の長期活性化が含まれ、細胞内 Ca2+ イオン濃度の上昇と異常なグルタミン酸放出との間に悪循環が形成されます。 、最後には虚血現象の影響が悪化して神経細胞の損失につながります10。

グルタミン酸を含む神経伝達物質の放出は、SNAREと呼ばれる複合体を形成する、グルタミン酸のシナプス放出に関与するタンパク質群が関与する、よく研究された分子機構に依存しています。 実際、SNARE複合体形成の破壊は、特に重要なSNARE複合体タンパク質であるSNAP-25の切断によって神経伝達物質放出障害を誘発することが報告されている11、12、13、14。

SNARE 複合体の形成に不可欠なもう 1 つのパートナーは、シナプス前膜に固定されたタンパク質である STX-1a です。STX-1a は、SNAP-25 に結合して神経伝達物質の放出に関与するために、閉じた構造から開いた構造への切り替えを必要とします 15。

STX-1a と SNAP-25 の両方が IS に関与していることを強調する証拠はほとんどありませんでしたが、それでも、この病理に対する STX-1a と SNAP-25 の寄与を理解するにはさらなる研究が必要です。 実際、STX-1a のタンパク質レベルは、IS のラットモデルの皮質で顕著に上方制御されており、おそらく脳虚血後にニューロンのシナプス機能を保存しようとする脳の試みを示唆しています 16。 SNAP-25 と IS の相関関係は明らかではありません。SNAP-25 の mRNA (メッセンジャー リボ核酸) レベルは、誘導された一過性虚血が 5 分間続いた後、最大 7 日間アレチネズミの苔状線維層で増加することが判明しています 17。ラットモデルでの研究では、IS がタンパク質の減少を誘導したことが示されています 18。

GFAP (グリア線維酸タンパク質)、S100β (S100 カルシウム結合タンパク質 B)、NSE (ニューロン特異的エノラーゼ)、Lp-PLA 2 (リポタンパク質関連ホスホリパーゼ A2)、MMP-9 (マトリックス メタロプロテイナーゼ 9) などのいくつかのタンパク質、D ダイマーおよび HSP70 (ヒート ショック プロテイン 70)19,20 は、IS の臨床バイオマーカーとして提案されていますが、いずれも臨床使用に成功していません。 代わりに、シナプスタンパク質レベルの変化がアルツハイマー病の病理学的バイオマーカーとして提案されており 21、したがって、ヒト体液サンプル中のこれらのタンパク質の検出は科学的関心を高めています。

最近、患者の血液サンプルから単離された細胞外小胞は、病理学的バイオマーカーを同定するための貴重な生体サンプルとして注目されています 22。 細胞外小胞、特にエキソソームは、生物学的活性分子（遺伝物質、タンパク質、脂質など）を運ぶエンドソーム由来の小さな膜小胞（サイズ 30 ～ 150 nm）であり、隣接する細胞と相互作用して、その荷物を細胞から細胞に伝達します。したがって、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしています23,24。 ニューロンを含む脳細胞も細胞外小胞を細胞外環境に放出し、その後、隣接する細胞に取り込まれるか、脳脊髄液や血液に移行します 25,26。 最近の研究では、患者の血液中に存在する神経由来のエクソソームが神経疾患に関連する物質を保有していることが報告されています27。

興味深いことに、シナプス前タンパク質として知られる STX-1a は、多数のシンタキシンが見つかったヒトの血液細胞で潜在的に発現していることが実証されています 28。 さらに、STX-1a mRNA はヒト CD8 + T 細胞で検出されましたが、STX-1b および SNAP-25 の mRNA は検出されません 29。 一方、SNAP-25 はヒト血清中で評価されています 30 が、PBMC でのその発現は検出されていません 29,31。 最近では、STX-1a と SNAP-25 の両方が神経由来のエキソソームで測定され、神経変性疾患の潜在的なバイオマーカーとして提案されています 30,32。 しかし、IS 患者の血液サンプルにおけるこれら 2 つのタンパク質の発現はまだ記載されていません。

したがって、この研究では、ヒトの血液画分（血清、PBMC、NDE）に STX-1a と SNAP-25 の両方が存在することを示しました。 次に、臨床的に特徴付けられた IS 患者、HC および Y-HC 被験者のコホートにおける血液成分中のそれらの発現レベルを分析します。

すべての方法は、ヘルシンキ宣言の原則およびミラノの倫理委員会によって付与された臨床プロトコル（サンプル収集については番号 285_2019 bis、実験研究については番号 729-2021）に従って実施されました。 すべての被験者はインフォームドコンセントに署名しました。

血液サンプルは、Casa di Cura Privata del Policlinico (CCPP) に入院している IS 患者 30 人から採取され、診断、性別、年齢、治療に基づいて選択されました。 IS患者は、脳卒中の重症度および機能的転帰を定量化するために使用されるNIH-SS33およびBI34スケールに基づいて評価された。 年齢が一致した健康な IS コントロール 30 名と Y-HC コントロール 15 名を性別と年齢で階層化しました。 ISとHCの被験者は、医学的疾患（高血圧、血管疾患、呼吸器疾患、肝臓疾患、腎臓疾患、内分泌代謝疾患など）および精神疾患（認知症、うつ病、不安、精神疾患など）を測定するCIRS（累積疾病評価スケール）を通じて、病理学的併存疾患について検査された。高齢者における障害（興奮および精神病）35、および認知機能に関するMMSE（ミニメンタルステート検査）36。 私たちは、将来的により良好な回復が期待できる軽度または中等度の脳卒中転帰（NIHSS 15 まで）の登録患者を使用することにしました。そのため、より重度の病状を有する患者よりもバイオマーカーがより有用になる可能性があります。 すべての臨床スケールは採血と同じ日に投与されました。 患者の59％が抗血小板療法を受けており、41％が抗血小板療法と抗凝固療法の両方を受けていました。 除外基準は、神経学的併存疾患、精神医学的または腫瘍学的病状、および最近の感染症であった。

血清を凝固活性化チューブに収集し、室温 (RT) で 1500 × g で 15 分間遠心分離しました。 血漿を K2EDTA でプレコートされたチューブに収集し、室温で 2000 × g で 15 分間遠心分離しました。 PBMC を K2-EDTA チューブに収集しました。血液をグルタミンを含まない RPMI-1640 (Euroclone) で希釈し、Ficoll-Histopaque (Ficoll-PlaqueTM Plus、GE HealthCare) 上に層にし、800 × g で 30 分間遠心分離し、室温でブレーキオフしました。 ＰＢＭＣペレットを収集し、カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ）で洗浄した。 血小板を洗浄し、室温、200×gで10分間遠心分離することによって除去した。 血液サンプルは CCPP Biobank 内で -80 °C で保存されました。

ThermoScientificTMPierceTM Removal Kit37 を使用して、アルブミンと IgG を血清から除去しました。 「結合/洗浄緩衝液」で希釈した約500μgの血清を、「シバクロンブルー/プロテインAゲル」で予め固定化したスピンカラムにロードし、オービタルシェーカー上で室温で10分間インキュベートした。 サンプルを 10,000 × g、室温で 1 分間遠心分離し、回収した濾液を樹脂ベッドに再度適用しました。 10,000 × g、室温で 1 分間の遠心分離に適した 10 分間のインキュベーション後、75 μL の「結合/洗浄バッファー」をカラムにロードし、室温で 10,000 × g で 1 分間の遠心分離後にサンプルを回収しました。 カラムを100μLの「結合/洗浄バッファー」で洗浄し、フロースルーを100μLのLaemmliローディングバッファー1×で回収した。

タンパク質濃度の測定は、Coomassie Protein Assay (Thermo Scientific) によって実行されました。 すべてのサンプルを Laemmli Loading Buffer (WVR Life Science) で希釈しました。 免疫反応性シグナルは、2 つの異なるウサギ ポリクローナル抗 STX-1a、ウサギ ポリクローナル抗 ERp57、ウサギ ポリクローナル抗 CD9、ウサギ ポリクローナル抗 SNAP-25 を使用して、Super SignalTMWest Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) によって検出されました。 ウサギポリクローナル抗ラミン A/C、ウサギモノクローナル抗 SV2A、ウサギモノクローナル抗 GFAP、ウサギモノクローナル抗 PSD95、マウスモノクローナル抗 β-アクチン (ACTB)、ウサギポリクローナル抗 APO A1、ウサギポリクローナル抗 NSE 、マウスモノクローナル抗GM130およびマウスモノクローナル抗CD107a。 使用したすべての抗体の情報は、オンラインの補足表 1 に報告されています。 画像は、Azure C300 Gel Imaging System (Bio-System) を使用して取得し、WB 濃度分析は Image J ソフトウェア (Meida Cyber​​netics) を使用して実行しました。

単離後、細胞をDMEM (Biowest LLC、FBSなし、Corning)で洗浄し、10% FBSおよび1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMに再懸濁しました。 500 μL の細胞懸濁液 (1 × 106 細胞/mL) を 24 ウェル細胞培養プレートに播種しました。 プレートに付着している細胞は単球集団ですが、浮遊している細胞はリンパ球です 38。 分析の各時点で細胞を回収し、Laemmli Loading Buffer (1 × 104 細胞/μL) に再懸濁し、超音波処理し、各サンプル 20 μL を WB 分析に使用しました。

SH-SY5Y ヒト神経膠芽腫細胞 (ATCC CRL-2266) を、10% FBS、2 mM l-グルタミンおよび 1% ペニシリン/ストレプトマイシンを含む DMEM 中で 37 °C、5% CO2 インキュベーター内で維持しました。

ＰＢＭＣの免疫染色のために、丸いガラスのカバースリップをポリ−Ｌ−リジン０．１ｍｇ／ｍＬ溶液（Ｓｅｒｖａ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＧｍＢＨ）でコーティングした。 凍結 PBMC を 100 μL の PBS に再懸濁し、コーティングされたカバースリップ上に 4 °C で 1 時間播種しました。 細胞を 1% p-ホルムアルデヒド (Thermo Scientific) 中で 4 °C で 15 分間固定しました。

STX-1aとβ-アクチンまたはGM130との間のPBMCの共局在解析を5人のHC被験者に対して実施し、5人のIS被験者および5人のHC被験者においてSTX-1a発現レベルを測定した。

SH-SY5Y 細胞を丸いガラスのカバースリップ上に播種し、24 時間インキュベートした後、洗浄し、4% p-ホルムアルデヒドで 4 °C で 15 分間固定しました。

両方の細胞タイプを透過処理し、ブロックし、一次抗体（2 つの異なるウサギ ポリクローナル抗 STX-1a、ウサギ ポリクローナル抗 SNAP-25、マウス モノクローナル抗 β-アクチン、およびマウス モノクローナル抗 GM130）とともに 4 °C でインキュベートしました。 使用したすべての抗体の情報は、オンラインの補足表 1 に報告されています。 次に細胞を洗浄し、抗ウサギ TRITC および抗マウス FITC (1:400、Jackson Immuno Research) とともにインキュベートし、続いて 0.1 μg/mL の DAPI (PanReac AppliChem) とともにインキュベートしました。

蛍光画像は、蛍光顕微鏡 (Nikon Eclipse Ti2-E) を使用し、NIS-Elements Basic Research ソフトウェアを使用して取得しました。 Image J ソフトウェアを使用して、各被験者の少なくとも 15 個の単離細胞における蛍光強度を評価し、各グループの 5 人の被験者の分析によって平均を計算しました。

共局在パラメータは、共局在領域の割合とピアソン係数を測定することによって推定されました。 ピアソンの係数分析では、JACoP プラグインが使用されました。

STX-1a レベルの定量化のために、核、細胞質および STX-1a の蛍光強度を計算しました。 STX-1a レベルの定量は、そのシグナルの値を、核の蛍光を差し引いた β-アクチンのシグナルの値で割ることによって得られました。

細胞ペレットを低張緩衝液（10 mM Hepes/NaOH pH 7.5、250 mM スクロース、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.5% Triton X-100、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、Thermo Scientific 製）で溶解し、細胞質画分を分離しました。 4 °C、2000 × g で 5 分間の遠心分離により核を除去します。 ペレットを 100 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA pH 7.5、および 500 mM NaCl、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤に再懸濁し、4 °C で 10 分間インキュベートし、希釈して (1:10)、4 °C で 15 分間インキュベートしました。 10 mM Tris-HCl pH 7.4、1 mM EDTA pH 7.5、0.5% NP-40、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を加え、4 °C、150 × g で 5 分間遠心分離しました39,40。 両方の画分を9倍量のエタノールを加えて沈殿させ、-80℃で2時間冷却し、その後4℃、18,400×gで30分間遠心分離しました。 ペレットを 30 μL の Laemmli Loading Buffer 1x に再懸濁し、4 μL の各サンプルを WB 分析用にロードしました。

サイトゾル STX-1a レベルの分析は、IS 被験者 10 名、HC 被験者 10 名、Y-HC 被験者 5 名で実施されました。

500 μL の血清を、推奨濃度の 3 倍のプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む 500 μL の PBS に添加し、4000 × g で 20 分間、4 °C で遠心分離しました。 上清を 250 μL の ExoQuick (System Biosciences) と混合し、4 °C で 1 時間インキュベートし、1500 × g で 4 °C で 20 分間遠心分離しました。 ペレットをプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む 500 μL の超純水 (Lonza Bioscience Solution) に再懸濁し、室温で 2 時間インキュベートしました。 次に、100 μL のサンプルを保存しました (総細胞外小胞タンパク質、T)。 NDE を、PBS 中の 3% BSA 45 μL 中で 4 μg のマウス抗ヒト CD171 (L1 細胞接着分子 [L1CAM]) ビオチン化抗体 (eBioscience 製) で免疫沈降し、回転ホイール内で 4 °C で 1 時間インキュベートし、その後インキュベートしました。 40 μL の 3% BSA 中の 13.5 μL のストレプトアビジン-アガロース Ultralink 樹脂 (Thermo Scientific) を回転ホイール上で 4 °C で 30 分間反応させます。 サンプルを 4 °C、200 g で 10 分間遠心分離しました。 上清は NDE を除去した総細胞外小胞画分 (T-N) を表し、ペレットは 160 µl の 0.1 M グリシン、pH 2.5-3 に再懸濁し、4500 × g、4 °C で 5 分間遠心分離しました。 NDE 画分 (N) を表す上清に、13.5 μL の 1 M Tris-HCl、pH 8、PBS 中の 3% BSA 22.5 μL、およびプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む RIPA 緩衝液 234 μL を添加しました41。 サンプルは 2 回の凍結融解サイクルと超音波処理にさらされました。

NDE における STX-1a 発現レベル、および全細胞外小胞と NDE の両方における SNAP-25 の発現レベルの分析を、10 人の IS 被験者と 10 人の HC 被験者で実施しました。

細胞外小胞を 2% パラホルムアルデヒドで固定し、ホルムバールカーボンでコーティングした銅グリッドに吸着させ、1% グルタルアルデヒドで 5 分間インキュベートし、脱イオン水で洗浄した後、2% シュウ酸ウラニル (pH 7) で 5 分間染色し、メチルセルロース/ウラニル、4 °C で 10 分間。 グリッドは、加速電圧 80 kV の TEM (FEI Morgagni268D) で観察されました。 デジタル画像は、Mega View イメージング ソフトウェア 42 を使用して撮影されました。

一元配置 ANOVA 分析とそれに続く事後 Tukey 有意性検定を使用して、STX-1a および SNAP-25 の発現レベルを評価しました (Kaleidagraph ソフトウェア - Synergy Software)。

臨床スケールとタンパク質レベルの間の相関は、ピアソンおよびスピアマンの相関係数 r または rs によってそれぞれ決定され、Jamovi ソフトウェア (バージョン 1.2) を使用すると 95% でした。 相関の強さは、British Medical Journal のガイドラインに従って分類されました43。

ヒト血液分画における STX-1a および SNAP-25 の存在を確認するために、まず健康なドナーからのさまざまなヒト血液成分 (つまり、PBMC、血清および血漿) を WB によって分析しました。 PBMC では、STX-1a に対応するバンドが予測分子量 33 kDa で見つかり、これは陽性対照としてロードされたマウス脳皮質溶解物で観察されたバンドと同等でした。 一方、予想通り、SNAP-25 では特異的なシグナルは検出されませんでした (図 1a)。 これらの結果は、陽性対照として使用された神経様細胞SH-SY5Yで観察されたシグナルと同様に、STX-1aが核の周囲に発現していることが判明した免疫蛍光分析によっても確認されました（図1b）（オンラインの補足図S1a） ）。 一方、SNAP-25 特異的シグナルは PBMC には完全に存在せず (図 1b)、したがって我々の WB 結果を裏付けています。 また、免疫蛍光実験でアイソフォーム 1a に特異的な抗体を使用することにより、PBMC における STX-1a の存在を確認しました（オンラインの補足図 S1b）。

健康なドナーの末梢血における STX-1a および SNAP-25 の検出。 (a) 血液成分中の SNARE タンパク質の WB 分析。 PBMC、血清 (SE)、血漿 (PL)、およびマウス脳皮質溶解物 (CTX、ポジティブコントロールとしてロード) は、STX-1a および SNAP-25 抗体で免疫染色されています。 STX-1a はすべての血液成分で検出されましたが、予測された MW の PBMC でのみ検出されました。一方、SNAP-25 は血清と血漿で観察されましたが、血球では検出されませんでした。 (b) PBMC における STX-1a および SNAP-25 の免疫蛍光分析。 PBMC の蛍光分析では、STX-1a の存在は確認されますが、SNAP-25 の存在は確認されません (赤色のチャネル)。 核はマーカー DAPI (青色のチャネル) で標識されています。 元の倍率: 60 倍。 バーは 10 μm に相当します。 (c) IgG およびアルブミンを除去した血清および血漿中の STX-1a および SNAP-25 の WB 分析。 血清および血漿から IgG およびアルブミンを除去した後 (クーマシー ブルー染色で示される)、STX-1a (シフトした分子量で) と SNAP-25 の両方の免疫認識シグナルが持続します。 WB 分析では、100 μg の血液成分、0.5 μg のマウス脳皮質溶解物、および 10 μL のフロースルーを各レーンにロードしました。 (a) および (c) の切り取られていない WB およびクーマシー染色は、オンラインの図 S4 で報告されています。

STX-1a タンパク質と SNAP-25 タンパク質は両方とも血清と血漿で発現しましたが、STX-1a の免疫反応性バンドは高分子量 (約 50 kDa) でシフトしているようです (図 1a)。 血清/血漿サンプルにおけるSTX-1aの予期せぬ移動は、タンパク質の異なるエピトープを標的とする別の抗体を使用することによって確認されました（オンラインの補足図S1c）。 それでも、より高い STX-1a バンドの実体を解明するには、さらなる研究が必要です。

ヒトの血液サンプルの分析は、総血清タンパク質の 70% を占める可能性がある高濃度のアルブミンと IgG の存在によって複雑になることがよくあります 37。 このため、血清および血漿サンプルは、IgG およびアルブミンの除去後に再プローブされています。 実際、STX-1a (高分子量) と SNAP-25 シグナルの両方が依然として観察されました (図 1c)。 IgG / アルブミン除去からのフロースルーサンプルを分析したところ、両方のタンパク質について非常にかすかなバンドが示され（オンラインの補足図S1d）、プローブされたタンパク質に対する抗体の特異性が確認されました。

蛍光画像は、STX-1aが主に核の外側で発現し（図1b）、細胞質内での局在性が高く、細胞質マーカーであるβ-アクチンと強く共局在していることを示しました（図2a）。 この相互作用は、共局在領域 (60.0 ± 7.7%、図 2b) およびピアソン係数 (0.605 ± 0.141、図 2c) 分析によっても確認されます。 さらに、STX-1aとゴルジ体の特異的マーカー（GM130）の部分的な共局在が観察されました（図2a）。その共局在面積（14.8±4.2％、図2b）とピアソン係数が計算されました（ 0.380 ± 0.076; 図 2c)。 これらの結果は、STX-1a が外部から取り込まれるのではなく、PBMC によって合成される可能性があることを示唆しています。

健康なドナーの PBMC における STX-1a の細胞内および細胞局在の分析。 (a) PBMC における STX-1a の細胞分布の IF 分析。 PBMC は、細胞質マーカー β-アクチン (上のパネル) またはゴルジ体マーカー GM130 (下のパネル) (緑色のチャンネル) および STX-1a (赤色のチャンネル) で免疫染色されています。 マージ画像では、STX-1a と β-アクチンの明らかな共局在が明らかであり、PBMC における SNARE タンパク質の細胞質局在を示しています。 STX-1a と GM130 の部分的な共局在も示されています。 元の倍率: 60 倍。 バーは 10 μm に相当します。 (b) 共局在解析。 総蛍光領域と比較した共局在領域の割合を示すヒストグラム。 (c) ピアソン係数。 ピアソン係数を示すヒストグラム。 緑色の点とヒストグラムは、β-アクチンと比較した STX-1a の共局在領域の % (b) とピアソン係数 (c) を表し、オレンジ色の点とヒストグラムは共局在領域の % (b) とピアソン係数 (c) を表します。 STX-1aのGM130との比較。 (d) PBMC の細胞内画分分析。 WB 分析により、PBMC における STX-1a の細胞質局在が確認されました。 PBMC の核 (Nc) と細胞質画分 (Cyto) の分離が成功したことは、核マーカーであるラミン A/C が核画分にのみ存在し、β-アクチンが細胞質画分にのみ存在することによって証明されます。 （ e ）STX-1aは、培養中の両方の主要なPBMCサブタイプで発現されます。 WB 分析により、STX-1a が単球 (M) とリンパ球 (L) の両方で発現され、その発現が培養細胞内で長期間維持されることが明らかになりました。 IF 分析では、各被験者 (n = 5) について少なくとも 15 個の細胞が分析されました。 WB 分析では、4 μL の PBMC 細胞内画分 (つまり Nc および Cyto)、100 μg の全 PBMC、0.5 μg のマウス脳皮質ライセート、および 2 × 105 個の培養 PBMC を各レーンにロードしました。 バーは中央値 ± SD を表します。 (d) と (e) のクロップされていない WB は、オンラインの図 S5 で報告されています。

次に、PBMC における STX-1a の細胞質ゾル局在を確認するために、細胞内分画実験を行ったところ、STX-1a は可溶性細胞質画分に存在するが、核区画には存在しないことがわかりました。 β-アクチンとラミンA/Cは、分画法の品質をテストするために、それぞれ細胞質と核の区画のマーカーとして使用されています（図2d）。

PBMC は主に単球とリンパ球で構成されているため、最終的に STX-1a が両方の細胞サブタイプで発現しているか、または 1 つの特定のサブ集団で発現しているかを分析しました。 このため、PBMC は死ぬまでの可能な最長期間である 9 日間培養され、STX-1a の発現がさまざまな時点でモニタリングされ、分析の各時点で単球とリンパ球の両方で STX-1a が発現していることが示されました (図.2e)。

2 つの SNARE タンパク質の存在を確認するために、健康なドナーの血清から NDE を精製しました。 調製された画分は、総細胞外小胞 (T)、NDE (N)、および NDE が枯渇した総画分 (TN) です。 まず、品質を確認するために調製物を検査しました。実際、すべての細胞外小胞画分は純粋であり、ゴルジ体 (GM130)、小胞体 (ERp57)、リソソーム (CD107a) および核 (ラミン) などの他の細胞小器官による汚染がありませんでした。エアコン) (図 3a)。 さらに、細胞外小胞の調製では、エキソソーム集団に特異的な CD9 抗体が陽性となりましたが、PBMC、血清、マウス脳皮質には存在しませんでした（図 3a-c）。 リポタンパク質粒子は循環中に非常に豊富に存在し、細胞外小胞画分と一緒に精製されることがよくあります44。 私たちの調製物では、WB分析は、他の2つの細胞外小胞画分（TおよびTN）と比較した場合、その後の精製ステップでアポリポタンパク質の汚染が減少したNDE画分（N）を取得することに成功したことを示しました（図3a）。 神経タンパク質が豊富に含まれる精製 NDE 画分は、主要な神経マーカー NSE および SV-2a (シナプス小胞糖タンパク質 2a) に対して陽性の免疫反応性を示しましたが、アストロ サイトのマーカー GFAP およびシナプス後マーカー PSD95 (シナプス後密度) に対しては陰性でした。タンパク質95）（図3b）、したがって、これらの小胞の神経起源がシナプス前である可能性があることが確認されました。 次に、STX-1a と SNAP-25 の両方について臨死体験を調査しました。 興味深いことに、STX-1a は 33 kDa の典型的な分子量で T 細胞外小胞および NDE にも存在していましたが、TN には存在しませんでした。 特に、STX-1a は、T 細胞外小胞と比較して NDE 画分に著しく富んでいるようですが、TN の画分では検出されませんでした。 SNAP-25はTおよびN細胞外小胞画分に存在し、程度は低いですがTNにも存在しました（図3c）。

健康なドナーの血清からの代表的な NDE 精製の WB 分析。 (a) 細胞外小胞調製物の品質分析。 細胞外小胞サンプルは、ゴルジ体 (GM130)、小胞体 (Erp57)、リソソーム (CD107) および核 (ラミン A/C) によって汚染されません。 HDL マーカー APO A1 の存在は、全細胞外小胞 (T) および NDE が枯渇した全細胞外小胞 (TN) の両方で検出可能ですが、NDE 画分 (N) では消失します。 CD9 は一般的なエクソソーム マーカーです。 (b) 臨死体験の特徴付け。 WB 分析では、他の 2 つの細胞外小胞画分と比較して、NDE における神経マーカー (NSE および SV-2a) の濃縮が示されています。 さらに、NDE サンプルは、星状細胞およびシナプス後マーカー GFAP および PSD95 に対してそれぞれ陰性です。 (c) STX-1a および SNAP-25 は NDE 画分に富んでいます。 両方の SNARE タンパク質のレベルは、他の 2 つの細胞外小胞画分と比較して、NDE では増加します。 (d) 臨死体験の代表的な EM 解析。 NDE の超微細構造分析では、直径が 70 ～ 100 nm の範囲の丸い形の小胞の存在が示されています。 バーは 50 nm に相当します。 WB 分析では、100 μg の全 PBMC、50 μg の血清 (SE)、細胞外小胞画分 (T、N、TN) および 0.5 μg のマウス脳皮質溶解物を各レーンにロードしました。 (a)〜(c)のクロップされていないWBは、オンラインの図S6で報告されています。

最後に、NDE調製物をTEM分析したところ、典型的な直径範囲70〜100 nmのナノサイズの丸い形状の小胞の存在が示され、これは血清単離されたNDEに明確に対応する可能性があります（図3d）。

STXの発現レベルを研究するために、30人のIS患者（平均年齢70.0±11.5歳、50％が女性）と30人の年齢と性別が一致した健康な対照（HC、平均年齢72.1±7.3歳、50％が女性）からなる集団が選択されました。血清中の-1a および SNAP-25、血清から分離された PBMC および NDE。 SDS-PAGE（ドデシル硫酸ナトリウム – ポリアクリルアミドゲル電気泳動）では、通常より高い分子量で血清 STX-1a が移動するため、SNAP ではなく、PBMC と NDE のみでの STX-1a の発現レベルを分析することにしました。 PBMC には存在しないため、血清および NDE で分析しました。 さらに、15 人の健康な若い被験者 (Y-HC、平均年齢 32.6 ± 4.0、女性 60%) がこの研究に登録され、STX-1a および SNAP-25 の発現レベルが加齢によって変化するかどうかを評価しました。 表 1 は、研究対象となった集団の人口統計学的特徴と臨床的特徴を示しています。

年齢または性別の分布は、IS と HC の人口グループ間で均一でした。 一過性脳虚血発作（TIA）および出血性脳卒中を患っている患者は研究から除外されている。 すべての IS 患者の血液サンプルは、虚血性イベントから 14 ～ 51 日（平均 30.3 ± 12.1 日）の間に採取されました。これは IS の後急性期の始まりと考えられており、脳卒中イベントの大部分は、虚血性イベントから発生しました。前方循環 (46.7%)。 分散分析は、IS患者の採血時間とNIH-SSの間に相関がないことを示しています（p = 0.786、補足図S2online）。 特定の脳卒中臨床スケール、つまり NIH-SS と修正 BI の平均はそれぞれ 4.9 ± 2.8 と 59.4 ± 20.0 でしたが、MMSE は 25.6 ± 8.8 対 HC 集団の 29.1 ± 1.4 でした。

まず第一に、PBMC における STX-1a の発現レベルと血清における SNAP-25 の発現レベルが、IS 患者、HC および Y-HC 被験者における WB 分析とその後の濃度測定によって分析されました。 我々の分析により、HC または Y-HC と比較して、IS 患者では両方の SNARE タンパク質が有意に増加していることが明らかになりました (図 4)。 また、IS患者の血清中のSTX-1aの「変化した」移動（約50 kDa、オンラインの補足図S3a）と、PBMC中のSNAP-25の付随的な欠如（オンラインの補足図S3b）も確認します。

分析されたすべての集団におけるPBMC中のSTX-1aおよび血清中のSNAP-25の定量分析。 （a、e）ISおよびHC対象におけるPBMC中のSTX-1a（a）および血清中のSNAP-25（e）の代表的なWB分析。 PBMC は STX-1a について免疫染色され (a)、血清は SNAP-25 について免疫染色されます (e)。 各サンプルについて、STX-1a 濃度測定値は β-アクチンの濃度に正規化され、SNAP-25 濃度測定値はクマシー ブルー染色によって明らかになった総血中タンパク質含有量の値に正規化されます。 (b) 濃度測定分析 PBMC における STX-1a 発現レベル。 STX-1a 発現レベルは、事後 Tukey 検定を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。STX-1a は、HC および Y-HC 被験者と比較して IS 患者の PBMC で有意に増加しましたが (p ≤ 0.0001)、差はありませんでした。対照群間で観察されました (p = 0.97)。 (c、d)IS PBMCにおけるSTX-1aの発現と臨床脳卒中スケールとの間のピアソンの相関分析。 IS 患者の PBMC における STX-1a レベルは、NIH-SS と中程度の負の相関を示し (p = 0.03) (c)、BI と中程度の正の相関を示します (d) (p = 0.03)。 (f) 血清中の濃度測定分析 SNAP-25 発現レベル。 SNAP-25 発現レベルは、事後 Tukey 検定を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。SNAP-25 レベルは、HC および Y-HC 被験者と比較して、IS 患者の血清中で有意に増加しています (p ≤ 0.0001)。 SNAP-25 発現の有意な増加も、Y-HC 対象と比較して HC で観察されます (p ≤ 0.0001)。 (g) IgG およびアルブミンを除去した血清中の SNAP-25 の WB 分析。 IS 患者における SNAP-25 レベルの増加は、血清タンパク質の存在には影響されません。 WB 分析では、100 μg の全 PBMC と血清 (SE) が各レーンにロードされています。 定量的グラフ（パネル b および f）では、フレーム内の各点は 1 人の被験者（n = 30 人の IS 患者、30 人の HC 被験者、および 15 人の若い HC 被験者）の値を示し、バーは中央値 ± SD を表します。 ***p ≤ 0.001。 パネル (b) と (f) では、水色の点とヒストグラムは Y-HC 被験者に対応し、青の点とヒストグラムは HC 被験者に対応し、赤い点とヒストグラムは IS 患者に対応します。 (a)、(e)、(g) の切り取られていない WB およびクーマシー染色は、オンラインの図 S7 で報告されています。

興味深いことに、濃度測定分析では、HC および Y-HC 被験者の両方と比較して、IS 患者の PBMC における STX-1a の発現レベルの増加が示されました (HC および Y-HC では、それぞれ 1.5 ± 0.5 対 0.97 ± 0.3 および 0.94 ± 0.2、p = 0.0002; 図 4a、b)。 次に、PBMC におけるタンパク質発現レベルと NIH-SS、BI、および MMSE の臨床スケールとの間の可能性のある相関関係を分析しました。 ピアソンの相関分析を使用することにより、NIH-SSスケール（-0.407）との中程度の負の相関（図4c）、およびBIスコア（0.400）との中程度の正の相関（図4d）を発見しました。 これらの相関関係はどちらも統計的に有意です (p = 0.03)。 これらの関連性は、相関関係が確認されたスピアマン相関分析でも計算されましたが、結果は弱いものでした（NIH-SSの場合は-0.314、p = 0.05、BIの場合は0.362、p = 0.03）（補足図3c、dオンライン）。 一方、IS PBMCで測定されたSTX-1a濃度とMMSEの間に有意な相関は見出されませんでした（補足図S3e）。

さらに、SNAP-25の発現レベルは、HCおよびY-HC対象の両方に関してIS対象の血清中で有意に増加していることが判明した（HCおよびY-HCについてそれぞれ0.47±0.07対0.28±0.12および0.09±0.02、 p = 0.00004;図 4e、f)。 注目すべきことに、この場合、SNAP-25はY-HC被験者と比較してHC集団に有意に豊富に存在する。 それにもかかわらず、これらのデータと前述の 3 つの臨床尺度の間のピアソンの分析では、統計的に有意な結果は得られませんでした（オンラインの補足図 S3f–h）。

最後に、SNAP-25発現は3つの分析された集団の血清で観察されているが（図4g）、シグナルは検出されていないため、IS血清中のSNAP-25発現レベルの増加はIgGおよびアルブミン含有量の影響を受けなかったことを実証します（図4g）。フロースルーサンプルで観察されました（オンラインの補足図S3i）。

IS患者、HCおよびY-HC被験者の部分集団からのPBMCに対して行われた細胞内分画実験により、分析されたコホートのPBMCの細胞質にSTX-1aが存在することが確認されました（図5a）。 さらに、IS患者のPBMCの細胞質では、HC被験者（1.6±0.6 vs 0.59±0.1、p = 0.0002、図5b）およびY-HC（0.77±0.3）と比較して、STX-1a発現レベルが有意に高いことが判明しました。 、ｐ＝０．００２７；図５ｂ）。 2 つの対照グループ、HC と Y-HC の間に有意差は観察されませんでした (p = 0.70) (図 5b)。

HC対象と比較したIS患者のPBMCにおけるSTX-1aレベルの増加の確認。 (a) PBMC 細胞質画分における STX-1a 発現レベルの代表的な WB。 PBMC の細胞質および核画分の代表的な WB 分析。 各サンプルについて、STX-1a 濃度測定値は β-アクチンの濃度に対して正規化されています。 PBMC の核 (Nc) と細胞質画分 (Cyto) の分離が成功したことは、核画分には核マーカーであるラミン A/C が存在し、細胞質には β-アクチンが存在することによって証明されます。 (b) 細胞質 STX-1a の定量分析。 STX-1a 発現レベルは、事後 Tukey 検定を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。STX-1a は、HC (p ≤ 0.0001) および Y-HC (p ≤ 0.003) の被験者と比較して、IS 患者の PBMC で有意に増加しました。一方、2 つの対照群の間に差は観察されません (p = 0.7)。 (c) IS 患者および HC 被験者の PBMC における STX-1a の代表的な免疫蛍光分析。 PBMC は、β-アクチン (緑色) と STX-1a (赤色) で標識されています。 STX-1a 蛍光強度は、その強度の測定値を、核の測定値 (DAPI 免疫染色) から差し引いた β-アクチンの強度で割ることによって正規化されています。 (d) PBMC における STX-1a レベルの定量分析。 正規化された STX-1a 発現レベルは、事後 Tukey 検定を伴う一元配置分散分析を使用して分析されました。STX-1a レベルは、HC 被験者と比較して IS 患者の PBMC で有意に増加しています (p = 0.005)。 元の倍率: 60X。 バーは 10 μm に相当します。 WB 分析の場合、4 μL の各画分 (Nc および Cyto) と 100 μg の全 PBMC が各レーンにロードされています。 IF 分析では、各被験者につき少なくとも 15 個の細胞が分析されています。 定量的グラフ（パネル b および d）では、フレーム内の各点は単一の被験者の値を示しています（（b）および（ d) 一方、バーは中央値 ± SD を表します **p ≤ 0.005; ***p ≤ 0.001 a) のトリミングされていない WB は図 S8 オンラインで報告されています。

IS患者の部分集団からのPBMCの免疫蛍光分析により、HC被験者と比較してこのグループではSTX-1aシグナルの存在が高いことが確認されました（図5c）。 実際、STX-1a発現の蛍光分析により、STX-1aがIS患者で有意に増加したことが確認されました（107±15.4対73.1±12.9、p = 0.005;図5d）。

STX-1a および SNAP-25 タンパク質の含有量は、IS 患者および HC 被験者の部分集団の血清から単離された細胞外小胞の画分で分析されています。 すべての細胞外小胞画分は、エキソソーム マーカー CD9 および神経マーカー NSE について検査されています (図 6)。 STX-1aシグナルは、総細胞外小胞画分ではほとんど見えませんでしたが定量化できず（図6a）、NDEを枯渇させた総細胞外小胞画分（TN）ではまったく存在しませんでしたが（図6f）、大幅に増加しました。 HCに関するIS患者由来のNDE数（1.8±0.3対1.1±0.3、p=0.00005、図6c、d）。 一方、SNAP-25はSTX-1aと比較して総細胞外小胞画分において強い結果をもたらしましたが、SNAP-25発現の差は上記の2つの集団間で有意ではありませんでした（p = 0.91）（図6a、b） ）。 ただし、SNAP-25発現レベルは、HC被験者よりもIS患者から分離されたNDEの方が統計的に高かった（4.1±0.9対2.9±0.9、p = 0.02;図6c、e）。

ISおよびHC被験者の細胞外小胞におけるSNAREの分析。 (a、c、f) 血清由来の細胞外小胞における STX-1a および SNAP-25 の発現レベルの代表的な WB 分析。 総 (T) 細胞外小胞 (a)、NDE (N) (c)、および NDE を除去した総細胞外小胞 (TN) (f) 画分の代表的な WB 分析。 各サンプルは、CD9 (総エキソソーム マーカー)、NSE (NDE マーカー)、STX-1a、および SNAP-25 に対してテストされています。 総細胞外小胞画分における SNAP-25 濃度測定値は CD9 の濃度測定値に正規化されており (a)、NDE における STX-1a および SNAP-25 濃度測定値は NSE の濃度測定値に正規化されています (c)。 (b、d、e) 細胞外小胞における STX-1a および SNAP-25 の濃度測定分析 T 細胞外小胞における正規化された SNAP-25 レベル (b)、および STX-1a (d) と SNAP-25 の両方のレベル (e)臨死体験におけるデータは、一元配置分散分析と事後テューキー検定を使用して分析されました。 STX-1aとSNAP-25の両方の発現レベルは、HC被験者と比較してIS患者のNDEで有意に増加しています（STX-1a（d）およびSNAP-25（e）についてそれぞれp ≤ 0.0001およびp ≤ 0.02）。 SNAP-25 では T 画分で差異が観察されます (p = 0.91) (b)。 (g、h)IS NDEにおけるSTX-1aの発現と臨床的脳卒中との間のピアソンの相関分析。 IS 患者の NDE における STX-1a レベルは、NIH-SS と中程度の正の相関関係 (p = 0.003) (g)、BI との中程度の負の相関関係 (p = 0.02) (h) を示します。 WB 分析では、50 μg の各細胞外小胞画分と 0.5 μg のマウス脳皮質溶解物を各レーンにロードしました。 定量的グラフ (パネル b、d、および e) では、フレーム内の各点は 1 人の被験者 (n = 10 人の IS 患者および 10 人の HC 被験者) の値を示し、バーは中央値 ± SD を表します。 *p ≤ 0.05; ***p ≤ 0.001。 パネル (b)、(d)、および (e) では、青い点とヒストグラムは HC 被験者に対応し、赤い点とヒストグラムは IS 患者に対応します。 (a)、(c)、(f) のクロップされていない WB は、オンラインの図 S9 で報告されています。

最後に、臨死体験における SNARE タンパク質含有量は、ピアソン相関分析を通じて臨床スケールと相関しており、STX-1a のみが有意な結果を示しました。 特に、STX-1aとNIH-SSスケールの間の中程度の正の相関（0.521）（図6g）、およびBIスコアとの中程度の負の相関（-0.431）（図6h）が見つかりました。 どちらの相関も統計的に有意です (NIH-SS スケールと BI スケールでは、それぞれ p = 0.003 と p = 0.02)。 スピアマンテストで実行された同じ分析では、強い相関関係が得られました（NIH-SSの場合は0.65、p = 0.03、BIの場合は-0.622、p = 0.04）（オンラインの補足図S4a、b）。 一方、STX-1aとMMSEの間（オンラインの補足図S4c）、およびSNAP-25 NDEの濃度と臨床スケール（オンラインの補足図S4d–f）の間には相関関係は観察されていません。 最後に、NDE 内の 2 つの SNARE タンパク質のレベルでさえ、互いに統計的に相関していません（オンラインの補足図 S4g）。

ISの血液ベースのバイオマーカーの同定は、虚血性イベントの結果をより正確に予測することが不確実であること、および侵襲性が非常に低く相対的で低コストであるという利点を備えた各患者に合わせた個別の治療法を同定するための基本的なステップとなるであろう。 新たな証拠は、エキソソームが IS45 後の脳の細胞間コミュニケーションを調節していることを示しており、このため、末梢血から NDE を分離する技術の開発により、IS バイオマーカーの同定の分野に興味深い機会が開かれています 41。 実際、臨死体験は神経変性疾患の診断に有用であることが実証されています 30,32,41。 重要なことは、EV は血液脳関門 (BBB) を通過できるため、末梢血からの神経起源が豊富な EV の分離は、神経病理学的変化を動的に反映し追跡できる可能性がある 41。 さらに、末梢レベルに存在する PBMC は、IS バイオマーカーの別の供給源となる可能性があります。 これらの細胞は選択的に遊走して虚血脳組織に浸潤し 46、IS 患者ではその遺伝子発現プロファイルの変化が観察されています 47。 実際、BBB が破壊されるとタンパク質が血流に漏出し、血清学的検出が可能になります。 興味深いことに、一部の脳タンパク質が IS 患者の血液サンプル中に放出され、検出されることが実証されています 19。

この研究では、シナプス前側からの神経伝達物質の放出に基本的な役割を果たす SNARE 複合体のメンバーである STX-1a と SNAP-25 の 2 つのタンパク質の IS 末梢発現レベルとその濃度を調べました。 IS動物モデルの脳組織では変化している16、17、18。 最近、両方のタンパク質が血清から単離された NDE で検出され、その発現レベルの低下がアルツハイマー病やパーキンソン病に関連していると考えられています 30,32。 さらに、両方のタンパク質は好中球 28、50、51 や血小板 52、53 などの血液細胞でまだ報告されていますが、PBMC では STX-1a の mRNA のみが検出されました (SNAP-25 の mRNA は検出されません)。

現在知られている回復の生物学に関連する脳卒中後の定義された重要な時点を考慮して、我々は、内因性可塑性の重要な時期である亜急性期の初期（7～60日）に焦点を当て、以下を反映するシナプスバイオマーカーを検出することを決定した。脳卒中回復とリハビリテーション円卓会議からのコンセンサスに基づく中心的な推奨事項によると、根底にある生物学的メカニズム55。 ただし、IS後30日（平均）の患者を考慮したため、研究で分析した母集団にはある程度の制限がある可能性があることは承知していますが、将来の研究でバイオマーカーの有効性のより完全な枠組みを得るために初期段階と後期段階の IS 人口も含めます。

まず第一に、我々は両タンパク質の末梢レベルでの存在を確認し、すでに文献で報告されているように、SNAP-25 は血清、全細胞外小胞および NDEs ライセートの両方に存在するが、PBMC には存在しないことを発見しました 29,31。 一方、PBMC および NDE では STX-1a 発現が観察されましたが、細胞外小胞全体では WB 分析ではほとんど検出できませんでした。 これらの結果から、両方の SNARE タンパク質がヒト血清中の NDE を介して輸送される可能性があると推測されます。 さらに、EV における STX-1a と SNAP-25 の分布パターンの差異（つまり、全 EV とニューロン EV の両方で SNAP-25 が存在するのに対し、NDE では STX-1a のみ）は、EV における SNAP-25 の発現レベルが高いためである可能性があります。 STX-1a に関する末梢血。 STX1a mRNA が PBMC29 に存在することは報告されていましたが、これらの細胞におけるそのタンパク質発現についてはここで初めて記載されました。 PBMC における STX1a の役割について利用可能なデータはまだありませんが、これらの細胞がサイトカインを放出できることは知られているため 56、潜在的にシンタキシンタンパク質ファミリーがこれらの細胞の放出機構に役立つ可能性があります。 興味深いことに、血清サンプルと血漿サンプルの両方で、タンパク質の 2 つの異なるエピトープを認識する 2 つの異なる抗体を使用することにより、STX-1a に対応する分子バンドが古典的な 33 kDa よりも高い分子量にシフトしていることがわかりました。これはおそらく翻訳後修飾またはタンパク質二量体化イベントによるものであり、さらなる調査が必要です。

STX-1a の細胞分布に関しては、免疫蛍光および細胞内分画実験により、STX-1a が主にサイトゾルで発現していることが観察されました。 興味深いことに、STX-1a と GM130 ゴルジ装置マーカーが部分的に共局在することにより、STX-1a はその in situ 合成中にゴルジ小器官によってプロセシングされる可能性があると考えられました。 さらに、PBMC に STX-1a が存在する原因に関する別の仮説は、STX-1a が血流中を自由に移動するタンパク質の引用から細胞に取り込まれるというものである可能性があります。 興味深いことに、我々は、PBMC の 2 つの主要な細胞亜集団である単球とリンパ球の両方が STX-1a を発現することを実証しました。 我々の結果と一致して、STX-1aではなくシンタキシンタンパク質が、ATP結合カセットトランスポーターA1に結合することにより、単球のアポリポタンパク質AI（apoA-I）へのコレステロールおよびコリンリン脂質の細胞放出において重要な役割を果たすことが報告された。 (ABCA1)57、さらに STX-11 はリンパ球媒介分泌および細胞毒性を調節することが判明しました 58。

われわれは、古典的な IS 臨床スケールである NIH-SS および BI、ならびに MMSE36 および CIRS35 によって特徴づけられた IS 患者のコホートにおける STX-1a および SNAP-25 の末梢発現を分析し、患者の認知機能も評価しました。併存疾患レベルが低い患者を選択することもできます。 私たちのデータは、分析されたすべての血液成分において、両方の SNARE タンパク質のレベルが 2 つの対照集団 (HC および Y-HC) と比較して IS 患者で有意に高いことを示しました。 特に、本発明者らは、IS患者のPBMCにおいてSTX-1aのレベルが増加していることを実証し、HC被験者とY-HC被験者の間に有意差は観察されなかったことから、発現タンパク質レベルの変動が虚血事象ではなく虚血事象に関連していると推測した。老化の過程へ。 これらの結果は、例えばパーキンソン病患者のα-シヌクレイン59やIL-1（インターロイキン）ベータ、IL-8などのmRNAの増加など、他の脳の病状がPBMC内のタンパク質の上方制御を刺激することを示す報告されたデータと一致しています。 、脳虚血中の PBMC における IL-17 mRNA 60。 同様に、IS患者の血清中のSNAP-25レベルは、同年齢の健常被験者と比較して有意に増加しており、興味深いことに、HC被験者はSNAP-25血清が有意に高いことが特徴であったため、その発現レベルは老化プロセスにも影響を受けるようである。若年層に対するレベル。 老化におけるSNAP-25の役割はこれまでのところ調査されていないが、我々の発見は、その末梢レベルが老化中に起こる脳シナプスの生理学的変化を反映している可能性があることを示唆している。

さらに、IS 患者の血清から精製された NDE では、STX-1a レベルと SNAP-25 レベルの両方が有意に濃縮されました。 細胞外小胞におけるニューロンタンパク質の放出は、シナプス前SNAREタンパク質複合体（すなわち、STX-1a、SNAP）について、SNAP-2530の場合はアルツハイマー病やパーキンソン病などのさまざまな病態のバイオマーカーとしてその定量化が使用できる可能性を示すことが報告されています。 -25 および VAMP-2)32。 さらに、STX-1a は中枢神経系からのエクソソーム放出の制御に重要な役割を果たしていることが実証されており 61、興味深いことに、他のシンタキシンアイソフォームは主に異なる細胞型からのエクソソーム分泌に役割を果たしていることが判明しました 62。

PBMC と NDE の両方における STX-1a レベルのピアソンとスピアマンの相関分析により、STX-1a の存在は最も高いものの 1 つである NIH-SS 臨床スケールと関連しているため、STX-1a の存在が IS 病理と相関しているという仮説が立てられました。多くの場合、臨床的および人口統計的スケールは脳卒中死亡率 33 と、日常生活活動のパフォーマンスを測定する BI に関連しています 34。 しかし、MMSE は IS の特定の臨床スケールではなく、認知機能の評価である 36 との相関は観察されませんでした。 注目に値するのは、STX-1a レベルは常に臨床スケールと相関しますが、PBMC と NDE では逆の相関関係にあります。 NDE では、STX-1a レベルは NHI-SS と正の相関があり、BI と負の相関があり、STX-1a 発現は患者の臨床フレームの悪化とともに増加するが、PBMC では逆であることが示されています。 実際、我々の結果は、STX-1aがPBMC29によって合成される可能性があることを示唆している（このタンパク質は部分的にゴルジ体と共局在しており、STX-1a mRNAがこれらの細胞で以前に報告されている）が、その生理学的または病理学的役割はまだ解明されていない。 まとめると、これらの結果は、STX-1a が病状の発症に関連しているだけでなく、その重症度にも相関しており、臨床スケールでより重篤なスコアを持つ患者ほど STX-1a が高いことを示しています。 一方で、SNAP-25のレベルは、臨床スケールと比較した場合、統計的な差異をまったく示さなかった。おそらく、これらのタンパク質の存在は、ISの重症度と厳密には関係していない（実際、加齢に伴う血中蓄積も観察された） ）、しかしその末梢レベルの増加はいずれにしても脳虚血病理に関連しています。

これらすべての発見は、観察された STX-1a と SNAP-25 の生物学的修飾が潜在的に脳損傷の程度を表す可能性があり、その結果、IS の潜在的な予後バイオマーカーとして研究できる可能性があると提案するきっかけとなりました。

私たちは、脳卒中の重症度を評価するツールとして、また患者の転帰の優れた予測因子として検証されている NIHSS を使用しましたが 33,63、実施された研究の限界として考えられるのは、研究対象の集団に関連する神経画像データが不足していることです。 この研究のもう 1 つの制限は、脳卒中後の採血の時間によって表されます。 したがって、脳画像に関する情報と、病理学の初期および後期段階でバイオマーカーによって測定された神経学的進化の予測値の分析は、将来の研究に確実に含まれる必要があります。

私たちの研究は、SNAREタンパク質であるSTX-1aおよびSNAP-25がヒトの血液画分に存在することを実証しており、私たちの知る限り、ニューロンのSTX-1aタンパク質がPBMCで観察されたのはこれが初めてです。 それらの発現レベルの分析により、分析された 2 つの SNARE タンパク質の両方が、IS 患者、HC および Y-HC 被験者のコホートの血液画分で増加していることが示されました。 興味深いことに、PBMC と NDE の両方における STX-1a の増加は、IS 臨床スケール NIH-SS および BI を使用して評価される病状の重症度と常に相関しています。 実際、これらの発見は、虚血性発作後のシナプス可塑性の変化を末梢レベルで、STX-1a および SNAP-25 とともに、今後発見される他のマーカーとともに、IS 後の早期に測定されるか、IS 後の早期に測定されるかを研究するための基礎となる可能性があります。長期的な観察は、IS の影響を受ける集団に対するリハビリテーション介入の効果を理解するための潜在的な予後バイオマーカーと考えられる可能性があります。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。

ATP結合カセットトランスポーターA1

アポリポタンパク質AI

アデノシン三リン酸

血液脳関門

バーテル指数

ウシ血清アルブミン

ポリクリニックの有料老人ホーム

累積疾病評価スケール

ダルベッコ改良イーグル培地

ウシ胎児血清

グリア原線維酸性タンパク質

健全なコントロール

ヒートショックプロテイン70

免疫グロブリンG

インターレルキン

虚血性脳卒中

エチレンジアミン四酢酸-K2

L1 細胞接着分子

リポタンパク質関連ホスポリパーゼ A2

マトリックスメタロプロテイナーゼ 9

メッセンジャーリボ核酸

ミニ精神状態検査

神経由来細胞外小胞

国立衛生研究所の脳卒中スケール

ニューロン特異的エノラーゼ

オーバーナイト

末梢血単核球

リン酸緩衝生理食塩水

シナプス後密度タンパク質 95

ポリ二フッ化ビニリデン

放射性免疫沈降アッセイバッファー

ロズウェルパーク記念研究所の培地

室温

S100 カルシウム結合タンパク質 B

ドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動

シナプトソーム関連タンパク質、25 kDa

可溶性 N-エチルマレイミド感受性融合タンパク質結合タンパク質受容体

シンタキシン

シナプス小胞 糖タンパク質 2a

一過性脳虚血発作

トリス緩衝生理食塩水

透過電子顕微鏡法

ウエスタンブロット

若い健康なコントロール

Deb, P.、Sharma, S. & Hassan, KM 急性虚血性脳卒中の病態生理学的メカニズム: 血栓溶解を超えた治療上の重要性に重点を置いた概要。 病態生理学 17(3)、197–218。 https://doi.org/10.1016/j.pathophys.2009.12.001 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bakhai、A. 冠動脈疾患、脳血管疾患、末梢動脈疾患の負担。 薬学経済学 22(補足 4)、11-18。 https://doi.org/10.2165/00019053-200422004-00004 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

ロマン、G.ら。 脳卒中後の長期相対生存率: ディジョン脳卒中登録。 神経疫学 54(6)、498–505。 https://doi.org/10.1159/000505160 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

イリノイ州カツァンら。 急性虚血性脳卒中に対する静脈内組織プラスミノーゲン活性化因子の利用。 アーチニューロール。 61(3)、346–350。 https://doi.org/10.1001/archneur.61.3.346 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

Wang、DZ、Rose、JA、Honings、DS、Garwacki、DJ、Milbrandt、JC OSF 脳卒中ネットワークの経験による静脈内 tPA による急性脳卒中患者の治療。 ストローク 31(1)、77 ～ 81。 https://doi.org/10.1161/01.str.31.1.77 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lin, Y.、Li, Z.、Liu, C.、Wang, Y. 虚血性脳卒中および一過性脳虚血発作における精密医療を目指して。 フロント。 生物科学。 23(7)、1338–1359。 https://doi.org/10.2741/4647 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

Astrup, J.、Siesjo, BK & Symon, L. 脳虚血の閾値 - 虚血性ペナンブラ。 ストローク 12(6)、723 ～ 725。 https://doi.org/10.1161/01.str.12.6.723 (1981)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lo、EH、Moskowitz、MA & Jacobs、TP 刺激的、過激、自殺的: 脳卒中後に脳細胞がどのように死ぬか。 ストローク 36(2)、189 ～ 192。 https://doi.org/10.1161/01.STR.0000153069.96296.fd (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

Sims, NR & Muyderman, H. ミトコンドリア、酸化代謝と脳卒中における細胞死。 ビオチム。 生物物理学。 アクタ。 1802(1)、80–91。 https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2009.09.003 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Belov-Kirdajova, D.、Kriska, J.、Tureckova, J.、Anderova, M. グリア細胞の観点から見た虚血誘発グルタミン酸興奮毒性。 フロント。 細胞神経科学。 14、1–27。 https://doi.org/10.3389/fnsel.2020.00051 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Kustanovich、V.ら。 注意欠陥多動性障害におけるSNAP-25リスク対立遺伝子の偏った父系伝達。 モル。 精神科。 8(3)、309–315。 https://doi.org/10.1038/sj.mp.4001247 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

中村和也 ほか遺伝子解析および発現解析により、高機能自閉症におけるシンタキシン 1A (STX1A) の発現上昇が明らかになりました。 内部。 J. Neuropsychopharmacol. 11(8)、1073–1084。 https://doi.org/10.1017/S1461145708009036 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Etain、B. et al. SNAP25 プロモーターの変異体は、若年性双極性障害と脳内の高い発現レベルに関連しています。 モル。 精神医学 15(7)、748–755。 https://doi.org/10.1038/mp.2008.148 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wang, C. et al. カルパインの阻害は、マウスのシナプトソームにおけるマンガン誘発性神経伝達物質放出障害を保護します: SNARE 複合体とシナプス小胞融合の関与。 科学。 議員7(1)、1-11。 https://doi.org/10.1038/s41598-017-04017-9 (2017)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Acuna, C. et al. 神経伝達物質放出のマイクロ秒解剖: SNARE 複合体の構築が速度と Ca2+ 感度を決定します。 ニューロン 82(5)、1088–1100。 https://doi.org/10.1016/j.neuron.2014.04.020 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cao, F.、Hata, R.、Zhu, P.、Niinobe, M.、Sakanaka, M. ラットの永久局所虚血後の虚血皮質におけるシンタキシン 1 の上方制御。 脳解像度 1272、52–61。 https://doi.org/10.1016/j.brainres.2009.03.047 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Martí, E.、Ferrer, I.、Ballabriga, J. & Blasi, J. スナネズミの一過性前脳虚血後の乱雑な線維における SNAP-25 免疫反応性の増加。 アクタニューロパトール。 95(3)、254–260。 https://doi.org/10.1007/s004010050795 (1998)。

論文 PubMed Google Scholar

チェン、HY 他メラトニンは、ラットの一過性局所脳虚血後のシナプス前タンパク質、SNAP-25、発現および樹状突起スパイン密度を改善し、機能的および電気生理学的回復を促進します。 J.松果体研究所。 47(3)、260–270。 https://doi.org/10.1111/j.1600-079X.2009.00709.x (2009)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Maestrini, I. et al. 脳虚血の初期段階における血液バイオマーカー。 ニューロール牧師。 (パリ) 172(3)、198–219。 https://doi.org/10.1016/j.neurol.2016.02.003 (2016)。

記事 CAS Google Scholar

Choi、JIL、Ha、SK、Lim、DJ、Kim、SD & Kim、SH S100β、マトリックスメタロプロテイナーゼ-9、D-ダイマー、およびヒートショックプロテイン 70 は、一過性 MCA 閉塞のマウスモデルにおける急性脳梗塞の血清学的バイオマーカーです。 J.韓国脳神経外科。 社会 61(5)、548–558。 https://doi.org/10.3340/jkns.2017.0200 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kvartsberg, H. et al. アルツハイマー病患者および健康な対照からの脳脊髄液および血漿サンプルのペアにおけるシナプス後タンパク質ニューグラニンの特性評価。 アルツハイマー病研究所それで。 7(1)、40。https://doi.org/10.1186/s13195-015-0124-3 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

松本 明 ほかマクロファージによる静脈内注射された B16BL6 由来エキソソームの認識および取り込みにおけるホスファチジルセリン由来の負の表面電荷の役割。 Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 科学。 106(1)、168–175。 https://doi.org/10.1016/j.xphs.2016.07.022 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lai、CPK & Breakefield、XO 神経系におけるエキソソーム/微小胞の役割と新しい治療法での使用。 フロント。 生理。 3、1～14。 https://doi.org/10.3389/fphys.2012.00228 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

Colombo, M.、Raposo, G. & Théry, C. エキソソームおよびその他の細胞外小胞の生合成、分泌、細胞間相互作用。 アンヌ。 セル開発担当牧師バイオル。 30(1)、255–289。 https://doi.org/10.1146/annurev-cellbio-101512-122326 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フォーレ、J. et al. エキソソームは培養皮質ニューロンによって放出されます。 モル。 細胞神経科学。 31(4)、642–648。 https://doi.org/10.1016/j.mcn.2005.12.003 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Colombo, E.、Borgiani, B.、Verderio, C. & Furlan, R. 微小胞：神経疾患の新規バイオマーカー。 フロント。 生理。 3、1～6。 https://doi.org/10.3389/fphys.2012.00063 (2012)。

記事 CAS Google Scholar

チェン、KH 他異種脂肪由来間葉幹細胞（ADMSC）およびADMSC由来エキソソームを静脈内投与すると、急性虚血性脳卒中後のラットの脳梗塞体積が顕著に減少し、神経機能が維持された。 オンコターゲット 7(46)、74537 ～ 74556。 https://doi.org/10.18632/oncotarget.12902 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Martín-Martín, B.、Nabokina, SM、Lazo, PA & Mollinedo, F. 好中球および分化中の HL-60 細胞におけるいくつかのヒトシンタキシン遺伝子の共発現: バリアントアイソフォームとシンタキシン 1 の検出。 J. Leukoc. バイオル。 65(3)、397–406。 https://doi.org/10.1002/jlb.65.3.397 (1999)。

論文 PubMed Google Scholar

Pattu, V. et al. ヒト細胞傷害性 T リンパ球における SNARE タンパク質の発現と局在。 ユーロ。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 42(2)、470–475。 https://doi.org/10.1002/eji.201141915 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アグリアルディ、C.ら。 血清中の SNAP-25 は神経由来のエキソソームによって運ばれ、アルツハイマー病の潜在的なバイオマーカーです。 モル。 ニューロビオール。 56(8)、5792–5798。 https://doi.org/10.1007/s12035-019-1501-x (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Spessott, WA、Sanmillan, ML、McCormick, ME、Kulkarni, VV & Giraudo, CG SM タンパク質 Munc18-2 は、T リンパ球の細胞毒性におけるシンタキシン 11 媒介脂質混合から完全融合への移行を促進します。 手順国立アカドサイエンス。 米国 114(11)、E2176 ～ E2185。 https://doi.org/10.1073/pnas.1617981114 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アグリアルディ、C.ら。 神経由来の末梢細胞外小胞にあるオリゴマーα-Syn および SNARE 複合体タンパク質は、パーキンソン病のバイオマーカーです。 ニューロビオール。 ディス。 148、105185。https://doi.org/10.1016/j.nbd.2020.105185 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アダムス、HP Jr. 他ベースライン NIH 脳卒中スケール スコアは脳卒中後の転帰を強く予測します: 急性脳卒中治療における Org 10172 の試験 (TOAST) の報告。 神経学 53(1)、126–131。 https://doi.org/10.1212/wnl.53.1.126 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ohura, T.、Hase, K.、中島 Y.、中山 T. 脳卒中患者のための修正 Barthel Index に基づくパフォーマンス評価ツールの有効性と信頼性。 BMC医学。 解像度メソドール。 17(1)、1-8。 https://doi.org/10.1186/s12874-017-0409-2 (2017)。

記事 Google Scholar

Linn, BS、Linn, MW & Gurel, L. 累積疾病評価スケール。 混雑する。 ジェリアトル。 社会 16(5)、622–626。 https://doi.org/10.1111/j.1532-5415.1968.tb02103.x (1968)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フォルスタイン、MF、フォルスタイン、SE、マクヒュー、PR 「ミニ精神状態」。 臨床医が患者の認知状態を評価するための実用的な方法。 J.精神科医。 解像度 12(3)、189–198。 https://doi.org/10.1016/0022-3956(75)90026-6 (1975)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ラリー・スパークス、D. 他タウは AD 血漿中で減少しており、使用された ELISA 法の検証を行っています。 午前。 J. ニューロデジェネー。 ディス。 1(1)、99–106 (2012)。

Google スカラー

パンダ、SK & ラビンドラン、B. ヒト PBMC の分離。 バイオプロトック。 3(3)、e323。 https://doi.org/10.21769/BioProtoc.323 (2013)。

記事 Google Scholar

ガンダッカー、N. 他知識ベースのプロテオーム プロファイリング: 同定されたタンパク質を考慮して 2-D PAGE による分離効率を評価します。 電気泳動 27(13)、2712–2721。 https://doi.org/10.1002/elps.200500964 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

モール、T.ら。 IL-1βおよびVEGF活性化ヒト臍帯静脈内皮細胞におけるプロテオームプロファイリングにより、炎症と血管新生の間の相互関係が明らかになります。 PLoS ONE 12(6)、1–23。 https://doi.org/10.1371/journal.pone.0179065 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

ムスタピック、M.ら。 神経起源が濃縮された血漿細胞外小胞: 脳の病理学的プロセスへの潜在的な窓。 フロント。 神経科学。 11、1～12。 https://doi.org/10.3389/fnins.2017.00278 (2017)。

記事 Google Scholar

ボレッリ、C. et al. 薬物誘発性老化多発性骨髄腫細胞は、直接またはエキソソーム媒介の IL15 トランス提示によって nk 細胞の増殖を誘発します。 がん免疫。 解像度 6(7)、860–869。 https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-17-0604 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

(2022) https://www.thebmj.www.bmj.com/about-bmj/resources-readers/publications/statistics-square-one/11-correlation-and-regression。

カリミ、N.ら。 リポタンパク質から分離した後の血漿細胞外小胞プロテオームの詳細な分析。 細胞モル。 生命科学。 75(15)、2873–2886。 https://doi.org/10.1007/s00018-018-2773-4 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、ZG & Chopp、M. 脳卒中の病因と治療におけるエクソソーム。 Ｊ．クリン． 投資する。 126(4)、1190–1197。 https://doi.org/10.1172/JCI81133 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

コチャネック PM およびハレンベック JM 脳虚血および脳卒中の病因における多形核白血球および単球/マクロファージ。 ストローク 23(9)、1367 ～ 1379 年。 https://doi.org/10.1161/01.str.23.9.1367 (1992)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ムーア、DF 他末梢血単核細胞を使用した急性虚血性脳卒中の遺伝子発現プロファイルの決定: パイロット研究。 回覧 111(2)、212–221。 https://doi.org/10.1161/01.CIR.0000152105.79665.C6 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Hou, Q. et al. 海馬 CA1 領域の SNAP-25 は記憶の固定に関与しています。 ユーロ。 J. Neurosci. 20(6)、1593–1603。 https://doi.org/10.1111/j.1460-9568.2004.03600.x (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

藤原 哲 他シナプス可塑性の発現における HPC-1/シンタキシン 1A の役割を決定するためのノックアウト マウスの分析。 J. Neurosci. 26(21)、5767–5776。 https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0289-06.2006 (2006)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nabokina, S.、Egea, G.、Blasi, J. & Mollinedo, F. ヒト好中球における SNAP-25 の細胞内位置。 生化学。 生物物理学。 解像度共通。 239(2)、592–597。 https://doi.org/10.1006/bbrc.1997.7515 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Nuyanzina, VA & Nabokina, SM 慢性骨髄性白血病患者の末梢血好中球におけるエキソサイトーシスメディエータータンパク質の同定。 ブル。 経験値バイオル。 医学。 137(4)、361–363。 https://doi.org/10.1023/b:bebm.0000035130.80245.13 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Reed, GL、Houng, AK & Fitzgerald, ML ヒト血小板には、SNARE タンパク質と、シンタキシン 4 と相互作用し、トロンビン活性化後にリン酸化される Sec1p ホモログが含まれています: 血小板分泌への影響。 血液 93(8)、2617–2626。 https://doi.org/10.1182/blood.V93.8.2617 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

レドンド、PC 他ヒト血小板におけるストア媒介性Ca2+流入におけるVAMPではなくSNAP-25の役割。 Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 558(1)、99–109。 https://doi.org/10.1113/jphysiol.2004.064899 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ベルンハルト、J. et al. 脳卒中回復研究における新しい基準に関する合意された定義と共有ビジョン: 脳卒中回復およびリハビリテーション円卓会議タスクフォース。 内部。 J ストローク。 12(5)、444–450。 https://doi.org/10.1177/1747493017711816 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

ボイド、L.ら。 脳卒中回復のバイオマーカー: 脳卒中回復およびリハビリテーション円卓会議からのコンセンサスに基づく中心的な推奨事項。 内部。 Ｊ．ストローク。 12(5)、480–493。 https://doi.org/10.1177/1747493017714176 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Friberg, D.、Bryant, J.、Shannon, W. & Whiteside, TL 免疫能力または活性化状態の尺度としての、正常なヒト末梢血単核細胞によるインビトロサイトカイン産生。 クリン。 診断します。 ラボイミュノール。 1(3)、261–268。 https://doi.org/10.1128/cdli.1.3.261-268.1994 (1994)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maa-Bared, S. et al. ABCA1とシンタキシン13およびフロチリン-1の結合、およびタンジール細胞における貪食作用の増強。 モル。 バイオル。 細胞。 15、5399–5407。 https://doi.org/10.1091/mbc.e04-03-0182 (2004)。

記事 Google Scholar

アーネソン、LNら。 最先端: シンタキシン 11 は、リンパ球を介した分泌と細胞毒性を制御します。 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 179(6)、3397–3401。 https://doi.org/10.4049/jimmunol.179.6.3397 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pei, Y. & Maitta, RW 造血と免疫におけるアルファシヌクレイン。 ヘリヨン 5(10)、e02590。 https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2019.e02590 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Kostulas, N.、Pelidou, SH、Kivisakk, P.、Kostulas, V. & Link, H. 前向き虚血性脳卒中研究で観察された血液単核細胞における IL-1 ベータ、IL-8、および IL-17 mRNA 発現の増加。 ストローク 30(10)、2174 ～ 2179。 https://doi.org/10.1161/01.str.30.10.2174 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Budnik, V.、Ruiz-Canada, C. & Wendler, F. 細胞外小胞は神経系のコミュニケーションを完全にします。 ナット。 神経科学牧師。 17(3)、160–172。 https://doi.org/10.1038/nrn.2015.29 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ピーク、TC et al. シンタキシン 6 を介したエキソソーム分泌は、前立腺がんにおけるエンザルタミド耐性を制御します。 モル。 カルシノグ。 59(1)、62–72。 https://doi.org/10.1002/mc.23129 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

フランケル、MR 他脳卒中後の予後の予測: 国立神経障害・脳卒中研究所によるプラセボ群分析 rt-PA 脳卒中試験。 神経学 55(7)、952–959。 https://doi.org/10.1212/wnl.55.7.952 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

統計分析にご協力いただいた Peppino Tropea 博士と、患者サンプルの選択について神経内科医としてご協力いただいた Elda Judica 博士に感謝いたします。

この研究は、Casa di Cura Privata del Policlinico di Milano から資金提供を受けました。

カンビズ・ハッサンザデ

現在の住所: ピサーナ科学財団 (FPS)、イタリア、ピサ

神経リハビリテーション科学部、Casa Cura Policlinico、ミラノ、イタリア

パメラ・カペレッティ、メラニア・フィラレティ、マッシモ・コルボ、マルコ・フェリジョーニ

ローマ大学「サピエンツァ」実験医学科、ローマ、イタリア

ローラ・マスエリ

ローマ大学「トール・ヴェルガータ」、ローマ、イタリアの臨床科学およびトランスレーショナル医学学部

ロベルト・ベイ

欧州脳研究所 (EBRI) リタ・レヴィ・モンタルチーニ財団、Viale Regina Elena 295、00161、ローマ、イタリア

カンビズ・ハッサンザデ & マルコ・フェリジョーニ

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

MFがこのプロジェクトを発案した。 PC は調査、データ分析を実行し、原稿の草稿を書きました。 LM と RB は TEM 検査を実施し、MF は血液サンプルと分画を準備しました。 MCとKHが原稿をレビューし編集しました。 MF が原稿を読み、編集し、完成させました。 MFが監修しました。

マルコ・フェリジョーニへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

カペレッティ、P.、フィラレティ、M.、マスエリ、L. 他虚血性脳卒中患者の血液サンプルでは、​​シンタキシン-1a および SNAP-25 の発現レベルが増加しています。 Sci Rep 12、14483 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-18719-2

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 4 月 26 日

受理日: 2022 年 8 月 18 日

公開日: 2022 年 8 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18719-2

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。