MLKL

Cardiovascular Diabetology volume 21、記事番号: 165 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

心筋細胞死は糖尿病の心臓病理の一因となります。研究により、糖尿病の心臓ではRIPK3/MLKL壊死シグナル伝達が活性化されることが示されています。 RIPK3 の欠失は、ストレプトゾシン (STZ) 誘発糖尿病マウスの心筋損傷および心機能不全を軽減することが報告されており、糖尿病性心筋症におけるネクロプトーシスの潜在的な役割が示唆されています。この研究は、糖尿病の心臓における心筋細胞壊死症を特徴づけ、MLKL媒介壊死症が糖尿病における心臓保護の標的であるかどうかを調査した。

1 型糖尿病は、RIPK3 ノックアウト、MLKL ノックアウト、および野生型マウスで誘発されました。秋田 1 型糖尿病マウスに MLKL の shRNA を注射しました。心筋機能は心エコー検査によって評価されました。免疫組織学的分析により、心臓の心筋細胞死と線維化が判定されました。培養成体マウス心筋細胞を、さまざまな薬物の存在下、高グルコースでインキュベートしました。細胞死とRIPK3およびMLKLのリン酸化を分析しました。

われわれは、STZ誘発性1型糖尿病マウス、アキタマウス、および1型糖尿病サルの高グルコース刺激を受けた心筋細胞および心臓では、非糖尿病対照と比較して、リン酸化RIPK3およびMLKLのレベルがより高いことを示した。 RIPK3 の薬理学的阻害剤や遺伝子欠失、または MLKL 欠失による RIPK3 の阻害により、高グルコース誘発性の MLKL リン酸化が防止され、心筋細胞の壊死症が軽減されました。 STZ誘発1型糖尿病マウスでは、血清中の心筋トロポニンIの上昇およびMLKLオリゴマー化とともに心筋細胞壊死症が存在し、リン酸化MLKLと共局在していた。 STZを注射したマウスでは、RIPK3またはMLKLを欠失させると、MLKLリン酸化と心臓壊死症が予防され、血清心筋トロポニンIレベルが低下し、心筋コラーゲン沈着が減少し、心筋機能が改善された。さらに、shRNA を介した MLKL の下方制御により、akita マウスの心筋細胞壊死症が減少しました。興味深いことに、抗糖尿病薬 (エンパグリフロジンおよびメトホルミン) とインキュベートすると、RIPK3 および MLKL のリン酸化が防止され、高グルコース誘導性心筋細胞の細胞死が減少しました。

我々は、糖尿病の心臓には心筋細胞壊死症が存在し、MLKL媒介性心筋細胞壊死症が糖尿病性心筋症の一因となるという証拠を提供した。これらの発見は、糖尿病における心臓保護の標的としてMLKL媒介壊死症を強調している。

糖尿病の心血管合併症は、糖尿病患者の罹患率と死亡率の主な原因として認識されています。心不全は、糖尿病の最も一般的な初期の心臓合併症として浮上しています[1]。糖尿病人口は、心筋梗塞後に心不全を発症する割合が顕著に高い[2、3、4]。さらに、冠状動脈疾患やその他の心血管疾患がない糖尿病では心筋機能不全が報告されており、この状態は心臓の構造的、機能的、代謝的変化を伴う糖尿病性心筋症と呼ばれています[5]。しかし、糖尿病性心筋症の発症機序は完全には理解されていません。糖尿病状態は、さまざまな形態の心筋細胞死を誘発することが報告されています[6]。心筋細胞の損失は、心不全につながる有害な心筋リモデリングのカスケードを引き起こす基本的な病理学的プロセスです[7]。したがって、心筋細胞死の阻害は、糖尿病の心臓合併症を軽減するための効果的な戦略となる可能性があります。

心筋細胞のアポトーシスとパイロトーシスは、糖尿病性心筋症に関係していると考えられています[8、9、10、11、12、13、14、15]。しかし、糖尿病性心筋症における他の形態の細胞死の役割に関する実験的証拠は限られています。壊死症は、心筋梗塞 [16] およびドキソルビシン誘発性心毒性 [17] における重要なメカニズムとして浮上しています。ネクロトーシスは、受容体相互作用プロテインキナーゼ 1 (RIPK1)、RIPK3、および混合系統キナーゼドメイン様シュードキナーゼ (MLKL) によって制御されます。 RIPK1 と RIPK3 は相互作用し、交差リン酸化します。次に、RIPK3 は MLKL をリン酸化し、これにより細胞膜内への MLKL の動員が可能になり、致死的な細孔が形成され、膜破裂が誘導されます [18、19、20、21]。最近、RIPK3 および MLKL 壊死症シグナル伝達が、糖尿病状態下の心筋細胞および心臓で活性化されることが報告されています [22、23、24、25、26]。最近の研究では、RIPK3 の欠失により、ストレプトゾシン (STZ) 誘発糖尿病マウスにおける心筋損傷および心臓機能不全の血清メーカーが弱まることが示されました [27]。これらの以前の研究は、糖尿病性心筋症における壊死症の潜在的な役割を示唆しています。しかし、糖尿病の心臓における心筋細胞壊死症の特徴は十分に解明されていません。さらに、MLKLは、多くの細胞型でネクロトーシスを実行する際のRIPK3の最もよく確立された基質であるが、RIPK3は、心筋梗塞、ドキソルビシン誘発性心毒性およびツニカマイシン誘発性小胞体ストレスにおいて、MLKL非依存性機構を介して心筋細胞ネクロプトーシスを媒介することも報告されている。 [17、28]。それにもかかわらず、糖尿病における心筋細胞壊死症および心機能不全におけるMLKLの役割は依然として解明されていない。

この研究では、糖尿病の心臓における心筋細胞壊死症の特徴を明らかにし、糖尿病性心筋症における MLKL 媒介壊死症の役割を調べました。さらに、高血糖誘発性壊死症における抗糖尿病薬（エンパグリフロジンおよびメトホルミン）の効果が測定されました。

この調査は、米国国立衛生研究所が発行した実験動物の管理と使用に関するガイド (NIH 出版物、第 8 版、2011 年) に準拠しています。すべてのマウス実験手順は、カナダのウェスタンオンタリオ大学 (プロトコル番号: 2021-054) および中国の東州大学 (プロトコル番号: 2017-0043) の動物使用小委員会によって承認されました。 C57BL/6 マウスと秋田 1 型糖尿病マウスの交配ペアを Jackson Laboratory から購入しました。 RIPK3 ノックアウトマウスは Xiaodong Wang 博士 (国立生物科学研究所、中国、北京) のご厚意により提供され、MLKL ノックアウトマウスは Cyagen Biosciences (中国、蘇州) から購入しました。すべての動物は、温度と湿度が管理された施設で、12 時間の明暗サイクルで水と餌を自由に与えて飼育されました。

すべてのアカゲザル実験は、中国四川大学西中国病院実験動物センターの動物管理使用委員会によって承認されました (プロトコル番号: 2014004A)。

1 型糖尿病は、5 日間連続のストレプトゾシン (STZ、50 mg/kg/日、Sigma、オンタリオ州、オンタリオ州、カナダ) の腹腔内注射によって成体マウス (雄、生後 2 か月) に誘発されました [29]。 STZ の最後の注射から 72 時間後に、マウスの尾静脈から全血を採取し、OneTouch Ultra 2 血糖モニタリングシステム (LifeScan, Inc.、ペンシルベニア州マルバーン、米国) を使用してランダムな血糖値を測定しました。マウスは糖尿病であるとみなされ、STZ注射の72時間後に血糖値が15mmol/L以上の場合にのみ研究に使用されましたが、クエン酸緩衝液を注射したマウスは正常血糖対照（血糖値<12mmol/L）として使用されました。

STZの最後の注射直後に、GSK'872(5mg/kg/日、腹腔内)またはビヒクルをマウス(各群10匹のマウス)に合計2か月間投与した[30]。 MLKL の MISSION®shRNA を含むプラスミド DNA (pshMLKL、60 μg、Sigma、オークビル、オンタリオ州、カナダ) または空のプラスミドを、GenJet を使用して秋田マウス (雄、生後 2 か月、各グループ 6 匹) に尾静脈から注射しました。 ™ Plus DNA in vivo トランスフェクション試薬は製造元の指示に従ってください (SignaGen® Laboratories、Frederick、MD、USA)。 3日後(3日目)、2回目のpshMLKLまたは空のプラスミド注射を同じマウスに与えた。次に、最後のプラスミド注射の 2 日後 (5 日目) にマウスを屠殺し、さらなる分析のために心臓組織と血液を収集しました。

前述のように、6 頭のアカゲザル (雄、3～5 歳) に STZ (80 mg/kg、Sigma-Aldrich、上海、中国) を単回静脈内投与して糖尿病を誘発させた [31]。すべての糖尿病アカゲザルの空腹時血糖値を 7 ～ 8 年間 15 ～ 20 mmol/L に維持するためにインスリンが使用されました。 6 匹のアカゲザルに標準食を 1 日 2 回与えました。彼らの心臓組織はウェスタンブロット分析のために収集されました。

マウスを吸入イソフルラン（1％）で麻酔し、前臨床超音波システム（Vevo 2100、FUJIFILM Visual Sonics、トロント、オンタリオ州、カナダ）に取り付けられた40 MHzリニアアレイトランスデューサーを使用して、公称面内空間解像度40μmで画像化しました。 (軸方向) × 80 μm (横方向)。乳頭筋レベルでの M モードおよび 2-D 胸骨傍短軸スキャン (133 フレーム/秒) を使用して、左心室 (LV) 収縮終期内径、LV 拡張終期内径、LV の変化を評価しました。拡張末期および収縮末期の後壁の厚さ、駆出率（EF）および短縮率（FS）。拡張機能を評価するために、拡張期の初期（E）および後期（A）の最大伝達速度のパルス波ドップラー測定を、僧帽弁流入部にカーソルを置いて心尖部ビューで取得しました。

EBD (Sigma、カナダ、オンタリオ州オークビル) を生理食塩水に溶解し、マウスに注射しました (100 mg/kg 体重、腹腔内)。 24時間後、マウスは、ケタミン（100 mg/kg）/キシラジン（5 mg/kg、腹腔内、Sigma、オークビル、カナダ、オンタリオ州）の混合物による麻酔下で頚椎脱臼により安楽死させた。皮膚の針刺しに反応します。心臓を採取し、最適切断温度 (OCT) 化合物 (Sakura、VWR International、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ) に包埋し、液体窒素で瞬間凍結し、5 μm の凍結切片に切断しました。核は、メーカーの指示に従って Hoechst 33342 を使用して染色しました (Thermo Fisher Scientific Inc.、バーリントン、オンタリオ、カナダ)。 EBD の取り込み (赤色) は、以前に記載されているように蛍光顕微鏡で視覚化されました [32]。細胞死は、各心臓の 3 つの異なる断面からの総核に対する EBD 陽性細胞の核の比率として定量化されました。

心臓組織の凍結切片を、リン酸化 MLKL および心筋トロポニン I に対する一次抗体 (New England Biolabs Ltd.、カナダ、オンタリオ州ウィットビー) とインキュベートし、次に二次抗体 (フルオレセインイソチオシアネート結合ロバ抗ウサギ IgG 抗体 [FITC]、 Santa Cruz Biotechnology Inc.（米国テキサス州ダラス）、または Alexa Fluor Plus 405 と結合したロバ抗ウサギ IgG 二次抗体、Thermo Fisher Scientific Inc.（カナダ、オンタリオ州バーリントン））。正常ウサギ IgG (New England Biolabs Ltd.、ウィットビー、オンタリオ州、カナダ) を抗リン酸化 MLKL 抗体および抗心筋トロポニン I のネガティブコントロールとして使用しました。細胞膜は FITC 結合小麦胚芽凝集素 (WGA、Sigma) で染色しました。 Aldrich、オークビル、オンタリオ州、カナダ) 前述のとおり [29]。シグナルは、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して取得されました。

心臓組織を 4% パラホルムアルデヒド (Sigma、カナダ、オンタリオ州、オークビル) 中で 4 °C で 48 時間固定し、その後日常的に処理し、ワックス包埋し、切片化しました。処理後、組織切片 (厚さ 5 μm) を、コラーゲン沈着測定のために 1% シリウスレッド (カナダ、オンタリオ州、オークビル、オークビルの Sigma) を含む飽和ピクリン酸溶液で染色しました [29、34]。

血清中の CK-MB レベルは、BBI Life Sciences Corporation (中国、上海) のアッセイキットを使用して測定し、血清心筋トロポニン I レベルは、Biomatik Corporation (Kitchener、Ontario、Canada) の市販キットを使用して、メーカーの指示に従って測定しました。それぞれ。

成体マウスの心室心筋細胞は、RIPK3 ノックアウト、MLKL ノックアウト、および野生型マウス (C57BL/6) から単離され、我々の最近の研究 [11、35] に記載されているように培養されました。

心臓組織または心筋細胞をホモジナイズし、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いました。タンパク質を PVDF 膜に転写した後、ウェスタンブロット分析により、特異的抗体（1:1000 希釈、New England Biolabs Ltd. 、ウィットビー、オンタリオ州、カナダ）。西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 結合ヤギ抗マウス IgG (H + L) 二次抗体は BOSTER Biological Technology (カタログ番号: BA1051、武漢、中国) から購入し、HRP 結合ヤギ抗ウサギ IgG (H + L) ）は、Jackson ImmunoResearch（カタログ番号：136080、West Grove、PA、USA）から購入しました。

MLKL オリゴマー化は、以前に記載されているように決定されました [36]。

心筋細胞溶解物中のカスパーゼ-3 活性は、カスパーゼ-3 蛍光アッセイキット (Biomol Research Laboratories, Inc.、米国ペンシルバニア州プリマス) を製造者の指示に従って使用して測定しました。

心筋細胞の壊死はヨウ化プロピジウム（PI）染色アッセイによって判定し、核はメーカーの指示に従ってHoechst 33342で染色した（Thermo Fisher Scientific Inc.、バーリントン、オンタリオ、カナダ）。細胞死（アポトーシスおよび壊死）は、メーカーの指示に従ってアネキシン V 染色アッセイ（Thermo Fisher Scientific Inc.、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）によって評価しました。

市販のキット（Takara Bio USA, Inc.、米国カリフォルニア州サンノゼ）を製造業者の指示に従って使用し、培養培地中の乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）のレベルを測定し、細胞損傷または細胞死を判定しました。

データは平均値 ± SD として表されます。スチューデントの t 検定を使用して、2 つのグループ間のデータを比較しました。複数グループの比較のために、ANOVA に続いて Newman-Keuls 検定を実行しました。 0.05 未満の AP 値は有意であるとみなされました。

成体マウス心筋細胞を、浸透圧対照として高グルコース (25 mmol/L) またはマンニトール (25 mmol/L) とともに 24 時間インキュベートしました。ウェスタンブロット分析により、マンニトールで刺激された心筋細胞と比較して、高グルコースではより高いレベルのリン酸化RIPK3およびMLKLが明らかになりました（図1a）。 STZ誘発1型糖尿病のマウスモデルでは、最後のSTZ注射から2か月後の糖尿病心臓では、偽マウスと比較してリン酸化RIPK3およびMLKLタンパク質のレベルが高かった（図1b）。同様に、秋田 1 型糖尿病マウスでは、偽動物と比較して、心臓内のリン酸化 RIPK3 および MLKL のレベルが高かった（図 1c）。ただし、RIPK3 と MLKL の総タンパク質レベルは、偽グループと糖尿病グループの間で同様でした。

RIPK3 と MLKL のリン酸化。 a 成体マウスの心筋細胞を高グルコースまたはマンニトール (25 mmol/L) とともに 24 時間インキュベートしました。リン酸化 RIPK3 (p-RIPK3) および MLKL (p-MLKL) のレベルは、ウェスタンブロット分析によって決定されました。左パネル: p-RIPK3、p-MLKL、およびそれらの総タンパク質、ならびに GAPDH の代表的なウェスタンブロット。右の 2 つのパネル: それぞれの総タンパク質に対する p-RIPK3 および p-MLKL の定量。 b〜dストレプトゾトシン（STZ）を注射したマウス（b）、秋田マウス（c）、およびサル（d）の心臓におけるp-RIPK3およびp-MLKLのレベルをウェスタンブロットによって分析しました。左パネル：各グループの5〜6個の異なる心臓のうち3個のp-RIPK3およびp-MLKL、総RIPK3、総MLKLおよびGAPDHの代表的なウェスタンブロット。右 2 つのパネル: p-RIPK3 および p-MLKL (WT: 野生型) の定量。データは平均値 ± SD、n = 5 ～ 6。 * P < 0.05 対マンニトール、偽または WT (t 検定)

上記の観察の翻訳的重要性を探るために、我々は、STZ 注射により誘発された 1 型糖尿病アカゲザルの心臓組織におけるリン酸化 RIPK3 および MLKL のレベルを測定しました。図1dに示すように、1型糖尿病サルの心臓は、偽サルと比較して、より高いレベルのリン酸化RIPK3およびMLKLタンパク質を示しました。これらの結果は、糖尿病状態が心臓内の RIPK3 および MLKL 壊死症シグナル伝達を活性化することを示しています。

MLKL のリン酸化と壊死における RIPK3 の役割を決定するために、RIPK3 阻害剤 GSK'872 (5 μmol/L) またはビヒクルと組み合わせた高グルコースまたはマンニトールで心筋細胞を 24 時間インキュベートしました。ウェスタンブロット分析により、GSK'872が高グルコース誘導性のMLKLリン酸化を防止することが示されました（図2a）。 LDH放出アッセイにより、高グルコースが心筋細胞死を誘導することが明らかになり(図2b)、これはPI染色アッセイによって確認された(図2c)。 GSK'872処理は、高グルコース刺激心筋細胞におけるLDH放出およびPI染色陽性細胞を有意に減少させた(図2b、c、d)。これらの結果は、RIPK3 が高グルコース誘発性心筋細胞壊死症を媒介することを示唆しています。高グルコースは心筋細胞のアポトーシスを誘導することも報告されています。これと一致して、我々は、カスパーゼ-3阻害剤であるAc-DEVD-CHO（5μmol/L、VWR International、ミシソーガ、カナダ、オンタリオ州）とのインキュベーションにより、高グルコース誘発性LDH放出が減弱されることを示しました（図2e）。アポトーシスの関与。アポトーシス細胞が適時に除去されないと、二次壊死が進行することが知られています[37]。 RIPK3 またはカスパーゼ 3 の阻害により、高グルコース刺激を受けた心筋細胞の細胞死が部分的に防止されたため、壊死がアポトーシスに続発する可能性があります。そのような可能性を排除するために、GSK'872とAc-DEVD-CHOによってネクロトーシスとアポトーシスをそれぞれ同時に抑制しました。 GSK'872およびAc-DEVD-CHOとの共インキュベーションは、心筋細胞における高グルコース誘導性LDH放出を完全に阻害し（図2f）、高グルコースがネクロトーシスとアポトーシスの両方を誘導することを示している。

心筋細胞の細胞死に対するRIPK3阻害の影響。 RIPK3 ノックアウト (RIPK3-KO) および野生型マウス (WT) から単離した成体マウス心筋細胞を、GSK'872 および CHO の単独または組み合わせの存在下、高グルコースまたはマンニトール (25 mmol/L) とともに 24 時間インキュベートしました。 a リン酸化 MLKL のレベルは、ウェスタンブロット分析によって決定されました。上のパネル: リン酸化 MLKL (p-MLKL)、総 MLKL、および GAPDH の代表的なウェスタンブロット。下のパネル: 総 MLKL に対する p-MLKL の定量。 b LDH は培地中で測定されました。 c 壊死性細胞死は、PI 染色を使用して評価されました。 PI 染色陽性細胞 (赤)、核 Hoechst33342 染色 (青)、および細胞膜の FITC-WGA 染色 (緑) の代表的な顕微鏡写真。 d 壊死性細胞死の定量化。 eおよびf LDHは培地中で測定されました。 g MLKL のリン酸化レベルを WT および RIPK3-KO 心筋細胞で測定しました。上のパネル：p-MLKL、総MLKL、およびGAPDHの代表的なウェスタンブロット。下のパネル: 総 MLKL に対する p-MLKL の定量。 h LDH は培地中で測定されました。データは平均値 ± SD、n = 5 つの異なる文化。 *マンニトール + ビヒクルまたはマンニトール + WT に対して P < 0.05、および † HG + ビヒクルまたは HG + WT に対して P < 0.05 (ANOVA)

RIPK3 の役割を検証するために、RIPK3 ノックアウト心筋細胞を使用しました。図2g、hに示すように、高グルコースは野生型マウス心筋細胞ではリン酸化MLKLレベルを増加させましたが、RIPK3ノックアウトマウス心筋細胞では増加させず、高グルコース誘発性LDH放出は野生型マウス心筋細胞と比較してRIPK3ノックアウトマウスでははるかに少なかったです。総合すると、これらの結果は、RIPK3 媒介ネクロトーシスが糖尿病条件下の心筋細胞における MLKL 活性化と関連していることを示唆しています。

糖尿病の心臓では、RIPK3 および MLKL ネクロトーシスシグナル伝達の活性化が最近報告されていますが [22、23、24、25、26、27]、心臓では心筋細胞ネクロトーシスの直接的な証拠が不足しています。心臓における心筋細胞壊死症をその場で特徴付けるために、我々はまず、STZ 誘発 1 型糖尿病マウスの心臓における壊死を測定しました。エバンスブルーアッセイでは、糖尿病の心臓では壊死細胞が示されましたが、偽マウスの心臓では壊死細胞は示されませんでした（図3a、b）。次に、心筋トロポニン I に対する抗体を使用した免疫蛍光アッセイによって、STZ を注射したマウスの心筋細胞の壊死細胞の局在を特定しました (追加ファイル 1:図 S1)。糖尿病マウスにおける心筋細胞壊死の存在は、心筋損傷の十分に確立されたバイオマーカーである血清心筋トロポニンIの増加と相関していた（図3c）。リン酸化RIPK3およびMLKLレベルの増加（図1b）に加えて、心臓組織におけるMLKLオリゴマー化をウェスタンブロットによってさらに分析しました。図3dに示すように、STZを注射したマウスの心臓ではMLKLオリゴマーが観察されましたが、偽マウスの心臓では観察されませんでした。これは、糖尿病が心臓でMLKLオリゴマー化を誘導することを示しています。対照的に、MLKL モノマーは、偽のマウス心臓と STZ を注射したマウス心臓の間で同等でした。同様に、秋田1型糖尿病マウスでは、非糖尿病同腹子対照マウスと比較して、心筋細胞壊死症が多く、血清心筋トロポニンIレベルが高く、MLKLオリゴマー化が高かった（図3e、f、g、h）。これらの結果は、1 型糖尿病マウスの心臓における心筋細胞壊死症を強く示しています。

心臓における心筋細胞壊死症の特徴付け。 aおよびe 壊死性細胞死は、エバンスブルー染色アッセイによって評価されました。代表的な顕微鏡写真は、STZ を注射したマウスと秋田マウスの心臓ではエバンスブルーで染色された壊死性細胞死 (赤) を示していますが、シャム動物ではそうではありません。核はHoechst33342により青色に染色された。 b および f 心臓におけるエバンスブルー染色された壊死性細胞死の定量化。 c および g 血清心筋トロポニン I. d および h MLKL オリゴマー化。各グループの 4 つの異なる心臓から得た代表的なウェスタンブロットでは、STZ を注射した心臓と秋田犬の心臓では MLKL オリゴマー化の存在が示されましたが、シャムマウスの心臓では存在しませんでした。 i 共焦点顕微鏡。代表的な顕微鏡写真は、エバンスブルーで染色された壊死細胞 (赤) がリン酸化 MLKL (p-MLKL、青) とともに提示されていること、および p-MLKL の点状染色が WGA-FITC (シアン) と共局在していることを示しています。データは平均値 ± SD、n = 5 ～ 6。 * P < 0.05 対シャムまたは WT (t 検定)

心筋細胞壊死症を裏付ける in situ 証拠を提供するために、リン酸化 MLKL に対する抗体を使用した免疫蛍光アッセイにより、糖尿病の心臓におけるリン酸化 MLKL を測定しました。図3iおよび追加ファイル1：図S2に示すように、心筋細胞の壊死は、壊死（EBDによる赤色）とリン酸化MLKL（図3iの青色または追加ファイル1の緑色）の二重染色によって同定されました。 S2)。特に、共焦点顕微鏡検査により、リン酸化MLKLの点状染色とFITC結合WGA（シアン色）による細胞膜染色の共局在が明らかになり、MLKL膜転座が示唆されました（図3i）。対照的に、抗リン酸化MLKL抗体を正常ウサギIgGに置き換えた場合、シグナルは検出されませんでした（追加ファイル1：図S2）。これらの結果は、糖尿病が心筋細胞壊死症を誘導し、これがMLKL活性化と関連していることを示す最初の現場証拠を提供する。

MLKLリン酸化および糖尿病性心筋症におけるRIPK3の役割を決定するために、我々はRIPK3ノックアウトマウスおよび野生型マウスにSTZ注射により1型糖尿病を誘発した。 STZ 注射から 2 か月後、死亡は観察されませんでした。 MLKL リン酸化は野生型マウスの心臓で増加しました。しかし、そのレベルはRIPK3ノックアウトマウスの心臓でははるかに低く（図4a）、RIPK3が糖尿病の心臓におけるMLKL活性化を媒介することを示しています。 RIPK3の欠失は、エバンスブルー染色によって決定されるように心筋細胞壊死症を予防し（図4b）、FS％およびEF％の低下によって証明されるように心筋機能不全を軽減し（図4c、d、追加ファイル1：表S1）、心筋コラーゲン沈着の減少STZを注射したマウスでは（図4e）、心筋損傷の血清バイオマーカー（CK-MBおよびトロポニンI）が減少しました（図4f、g）。 RIPK3を標的にすることが糖尿病性心筋症を軽減する治療法であるかどうかを調べるために、我々はRIPK3の薬理学的阻害剤であるGSK'872を高血糖誘発直後のSTZ注射マウスに合計2か月間投与した。同様に、RIPK3の薬理学的阻害は、MLKLリン酸化を防止し（図5a）、心筋コラーゲン沈着を軽減し（図5b）、心筋細胞壊死症を減少させ（図5c）、血清中のCK-MBおよびトロポニンIのレベルを減少させました（図5d、 e）、STZを注射したマウスの心筋機能が改善されました（図5f、g、追加ファイル1：表S2）。 RIPK3 欠失も GSK'872 も、偽マウスおよび糖尿病マウスの血糖および体重に影響を与えませんでした (追加ファイル 1: 表 S1 および S2)。通常の条件下では、RIKP3 ノックアウトまたは GSK'872 はマウスの心筋機能に影響を与えませんでした (追加ファイル 1: 表 S1 および S2)。

ストレプトゾシン（STZ）誘発性糖尿病心臓におけるRIPK3ノックアウトの影響。 RIPK3 ノックアウト (RIPK3-KO) および野生型マウス (WT) は、STZ 注射によって糖尿病になりました。 a 心臓におけるリン酸化 MLKL (p-MLKL) のレベルをウェスタンブロットによって分析しました。上のパネル: 上のパネル: 各グループの 6 つの異なる心臓のうち 2 つからの p-MLKL および総 MLKL の代表的なウェスタンブロット。下のパネル: 総 MLKL に対する p-MLKL の定量。 b 心臓における壊死性細胞死は、エバンスブルー染色アッセイによって測定されました。上のパネル: 心臓の壊死細胞の代表的な顕微鏡写真。下のパネル: 壊死性細胞死の定量化。 c および d 心筋機能の心エコー検査分析。 e 心筋線維症は、心臓内のコラーゲンの沈着によって評価されました。上のパネル: 心臓内のコラーゲン沈着の代表的な顕微鏡写真 (赤)。下のパネル: コラーゲン沈着の定量化。 f および g 心筋損傷のバイオマーカー: 血清 CK-MB (f) および心筋トロポニン I (g)。データは平均値 ± SD、n = 5 ～ 6。 *P < 0.05 対 Sham + WT および †P < 0.05 対 STZ + WT (ANOVA)

ストレプトゾシン（STZ）誘発性糖尿病心臓におけるGSK'872の効果。 STZ注射により野生型マウスを糖尿病にし、糖尿病の誘導後、GSK'872を合計2か月間投与した。 a 心臓におけるリン酸化 MLKL (p-MLKL) のレベルをウェスタンブロットによって分析しました。上のパネル: 各グループの 6 つの異なる心臓のうち 2 つからの、p-MLKL および総 MLKL についての代表的なウェスタンブロット。下のパネル: 総 MLKL に対する p-MLKL の定量。 b 心筋線維症は、心臓内のコラーゲンの沈着によって評価されました。上のパネル: 心臓内のコラーゲン沈着の代表的な顕微鏡写真 (赤)。下のパネル: コラーゲン沈着の定量化。 c 心臓における壊死性細胞死は、エバンスブルー染色アッセイによって測定されました。上のパネル: 心臓の壊死細胞の代表的な顕微鏡写真。下のパネル: 壊死性細胞死の定量化。 d および e 心筋損傷のバイオマーカー: 血清心筋トロポニン I (e) および CK-MB (d)。 f および g 心筋機能の心エコー検査分析。データは平均値 ± SD、n = 5 ～ 6。 * 擬似 + ビヒクルに対して P < 0.05、および †P < 0.05 対 STZ + ビヒクル (ANOVA)

MLKL の役割を決定するために、我々はまず MLKL ノックアウト心筋細胞と野生型マウス心筋細胞を高グルコースまたはマンニトールとインキュベートしました。 24時間後のLDH放出アッセイにより、高グルコースインキュベーション後のMLKLノックアウト心筋細胞と比較して、培地中のLDHレベルが野生型ではるかに高いことが明らかになり（図6a）、高血糖におけるMLKL欠損の保護効果が示唆されています。グルコース刺激された心筋細胞。次に、STZ の注射により MLKL ノックアウトマウスと野生型マウスに 1 型糖尿病を誘発しました。 STZ注射から2か月後、死亡は観察されず、心エコー検査により、MLKLノックアウトマウスでは心筋機能が比較的維持されていることが明らかになりました（図6b、c、追加ファイル1：表S3）。 MLKLの欠失は、エバンスブルーアッセイによって決定された心筋細胞壊死を防止し（図6d）、血清中のCK-MBおよびトロポニンIレベルを低下させ（図6e、f）、STZを注射したマウスの心筋コラーゲン沈着を減少させました（図6g）。。血糖値と体重は、正常または糖尿病のいずれの条件下でも、MLKLノックアウトマウスと野生型マウスの間で同等でした。 MLKLの欠失は、偽動物の心筋機能と線維症に変化を与えませんでした（図6g、追加ファイル1：表S4）。

ストレプトゾシン（STZ）誘発性糖尿病心臓におけるMLKKLノックアウトの影響。 a MLKL ノックアウト (MLKL-KO) および野生型マウス (WT) から単離された成体心筋細胞を、高グルコースまたはマンニトール (25 mmol/L) とともに 24 時間インキュベートしました。 LDHは培地中で測定されました。 b-g MLKL-KO および WT マウスは STZ 注射により糖尿病になりました。 b および c 心筋機能の心エコー検査分析。 d 心臓における壊死性細胞死は、エバンスブルー染色アッセイによって測定されました。上のパネル: 心臓の壊死細胞の代表的な顕微鏡写真。下のパネル: 壊死性細胞死の定量化。 e および f 心筋損傷のバイオマーカー: 血清 CK-MB (e) および心筋トロポニン I (f)。 g 心筋線維症は、心臓内のコラーゲンの沈着によって評価されました。上のパネル: 心臓内のコラーゲン沈着の代表的な顕微鏡写真 (赤)。下のパネル: コラーゲン沈着の定量化。データは平均値 ± SD、n = 5 ～ 6。 *P < 0.05 対 Sham + WT および †P < 0.05 対 STZ + WT (ANOVA)

糖尿病における心筋細胞壊死症におけるMLKLの役割を裏付けるさらなる証拠を提供するために、我々は、MLKLに対するshRNA（pshMLKL）の全身送達によって秋田犬1型糖尿病マウスの心臓においてMLKLをノックダウンした。空のプラスミドを対照として使用した。 shRNAの送達により、秋田マウスの心臓におけるMLKLタンパク質のレベルが減少し、MLKLのノックダウンが成功したことが示されました（図7a）。秋田マウスは心筋細胞壊死を示し（図７ｂ）、これは血清心筋トロポニンＩレベルの増加と相関していた（図７ｃ）。心臓におけるMLKLのノックダウンは、akitaマウスにおいて心筋細胞壊死を減少させ、血清心筋トロポニンIレベルを低下させた(図7b、c)。しかし、MLKLをノックダウンしても、秋田マウスの体重と血糖値は変化しませんでした（図7d）。

ストレプトゾシン（STZ）誘発性糖尿病心臓におけるMLKLノックダウンの効果。秋田マウスには、それぞれ0日目と3日目にMLKLに対するshRNAを2回に分けて投与した。野生型マウス (WT) をシャムとして使用しました。対照の秋田マウスには同量の空のプラスミドを投与した。 5日目にマウスを屠殺した。 a 心臓における MLKL タンパク質のレベルをウェスタンブロットによって分析しました。上のパネル: MLKL および GAPDH について、各グループの 6 つの異なる心臓のうち 4 つからの代表的なウェスタンブロット。下のパネル: GAPDH タンパク質に対する MLKL の定量。 b 心臓における壊死性細胞死は、エバンスブルー染色アッセイによって測定されました。上のパネル: 心臓の壊死細胞の代表的な顕微鏡写真。下のパネル: 壊死性細胞死の定量化。 c 心筋損傷のバイオマーカー: 血清心筋トロポニン I. d 0 日目および 5 日目の秋田マウスの体重および血糖値。データは平均 ± SD、n = 6。*P < 0.05 対対照および †P < 0.05 対対照 + 秋田 (t 検定および ANOVA)

次に、抗糖尿病薬が糖尿病条件下での心筋細胞壊死症に影響を与えるかどうかを調べました。エンパグリフロジンはナトリウム-グルコース共輸送体-2の阻害剤であるため、2型糖尿病の成人患者を治療するための抗糖尿病薬として使用されています[38]。心不全の予防にも役立つと報告されています[39]。成人心筋細胞を、エンパグリフロジン (1 μmol/L、Cedarlane、バーリントン、カナダ、オンタリオ州) [40] またはビヒクルの存在下、高グルコースまたはマンニトール (25 mmol/L) で 24 時間インキュベートしました。エンパグリフロジンとの共インキュベーションにより、心筋細胞における高グルコース誘発性のリン酸化RIPK3およびMLKLレベルが大幅に減少し（図8a〜c）、ネクロプトーシスに対するエンパグリフロジンの阻害効果が示唆されました。これは、LDH 放出およびアネキシン V 染色アッセイによって裏付けられました。図8d、eに示すように、高グルコースはLDH放出を誘導し、細胞死を増加させましたが、両方ともエンパグリフロジンによって弱められました。同様に、臨床で確立された抗糖尿病薬であるメトホルミン（500μmol/L、Cedarlane、オンタリオ州バーリントン）とのインキュベーションは、高グルコース誘発性心筋細胞の壊死症に対して同様の抑制効果をもたらしました（図8f-h）。、j、k）。一貫して、AMPKの十分に確立された活性化因子であるメトホルミンは、その活性化を示すリン酸化AMPKのレベルを増加させ、心筋細胞における高グルコース誘導性のAMPKの減少を防止した（図8f、i）。これらの結果は、エンパグリフロジンとメトホルミンが抗糖尿病効果に加えて、糖尿病条件下での心筋細胞壊死症に対する直接的な阻害効果があることを強く示唆しています。

心筋細胞の壊死症に対する抗糖尿病薬の影響。成体マウス心筋細胞を、エンパグリフロジン (EMP、1 μmol/L)、メトホルミン (MET、500 μmol/L) またはビヒクル (Veh) の存在下で高グルコース (HG) またはマンニトール (25 mmol/L) と 24 時間インキュベートしました。。 a リン酸化 RIPK3 (p-RIPK3) および MLKL (p-MLKL) とそれらの総タンパク質、および GAPDH の代表的なウェスタンブロット。 bおよびc; それぞれの総タンパク質に対する p-RIPK3 および p-MLKL の定量。 d および j LDH は培地中で測定されました。 (eおよびk)細胞死はアネキシンV染色によって評価されました。 f p-RIPK3、p-MLKKL、リン酸化AMPK (p-AMPK)、およびそれらの総タンパク質、ならびにGAPDHの代表的なウエスタンブロット。 g – i それぞれ、総タンパク質に対する p-MLKL、p-RIPK3、および p-AMPK の定量。データは平均値 ± SD、n = 5 つの異なる文化。 *マンニトール + Veh に対して P < 0.05、および †P < 0.05 対 HG + Veh (ANOVA)

心筋細胞の喪失は心不全につながる有害な心筋リモデリングのカスケードを引き起こすため、心筋細胞の死は糖尿病の心臓合併症に寄与する基本的なメカニズムです[7]。 2 つの形態の細胞死 (すなわち、アポトーシス [8、9、11、12、13] およびパイロトーシス [10、14、15]) が糖尿病の心臓合併症に関与していると考えられています。最近の研究では、壊死症も糖尿病の心臓合併症に関与している可能性があることが示唆されています。 H9c2 細胞では、高グルコースはネクロトーシスシグナル伝達 RIPK1/RIPK3/MLKL のタンパク質レベルを増加させることが報告されており、ネクロスタチン-1 による RIPK1 の阻害により高グルコース誘発細胞死が減少した [22、41、42]。高グルコースはまた、新生児ラット心筋細胞におけるRIPK1/RIPK3/MLKLシグナル伝達のタンパク質レベルの増加を誘導し、これは細胞死に関連していた[23、24、26]。これらの in vitro 研究では、高グルコース誘発性心筋細胞死における壊死症シグナル伝達が関与しています。 STZ注射誘発1型糖尿病マウス[27]、高脂肪食誘発前糖尿病ラット[25]、高脂肪食+STZ誘発2型糖尿病ラット[43]およびdb/を含む糖尿病の動物モデルにおいて。 db 2 型糖尿病マウス [27] では、総および/またはリン酸化 RIPK1/RIPK3/MLKL のタンパク質レベルが心臓内で上昇しており、糖尿病の心臓合併症における壊死症の潜在的な役割を示唆しています。実際、これは、RIPK3の欠失がSTZを注射したマウスの心筋損傷と機能不全を軽減することを示した最新の研究によって裏付けられている[27]。しかし、糖尿病の心臓における心筋細胞壊死症は十分に特徴づけられていません。我々が示したように、RIPK3とMLKLは、STZ誘発マウスとサル、秋田マウスを含む3つの異なる1型糖尿病モデルで活性化されており、確立されたバイオマーカーである血清中の心筋トロポニンIの上昇と関連している。心筋細胞損傷では、STZ誘発1型糖尿病マウスと秋田マウスの両方の心臓において、壊死（エバンスブルー染色）とリン酸化MLKLの二重染色によって壊死性心筋細胞を同定し、心筋細胞は心筋トロポニンIを染色することによって可視化した。ネクロトーシス、MLKL のリン酸化によりオリゴマー化、膜移行、膜破壊が開始されます [44]。これと一致して、我々は糖尿病の心臓におけるMLKLのオリゴマー化を示し、免疫蛍光共焦点顕微鏡分析により、糖尿病の心臓におけるリン酸化MLKLの膜の点状染色を実証した。重要なことに、我々は、1型糖尿病の心臓には心筋細胞壊死症が存在し、RIPK3またはMLKLを標的とすることによる心筋細胞壊死症の阻害は、1型糖尿病マウスにおける心筋コラーゲンの沈着と心臓機能不全を軽減するという生体内証拠を提供した。心筋コラーゲン沈着の減少は、通常、心筋細胞の喪失が線維芽細胞によって置き換えられるため、糖尿病の心臓における心筋細胞壊死症の減少に起因すると考えられる。成体マウスの心筋細胞では、RIPK3の欠失、MLKLの欠失、RIPK3の薬理学的阻害剤などのアプローチを組み合わせて、糖尿病状態（すなわち高血糖）が壊死を誘発することを確認した。したがって、我々のデータは、アポトーシスとパイロトーシスに加えて、心筋細胞壊死症も 1 型糖尿病性心筋症の病因に重要な寄与をしており、糖尿病における心臓保護の標的であることを示しています。今回の研究は1型糖尿病に焦点を当てていたが、db/db 2型糖尿病患者の心臓では壊死シグナル伝達RIPK3とMLKLが活性化されていたため、心筋細胞壊死症も2型糖尿病の心臓病理に関与している可能性があると推測している。マウス [27] および高脂肪食と STZ 誘発 2 型糖尿病ラット [43]。それにもかかわらず、2 型糖尿病モデルを使用して、心臓病理における壊死症とその RIPK3/MLKL シグナル伝達の役割を明らかにするために、将来の研究が保証される。

RIPK1 による RIPK3 のリン酸化により、多くの細胞型で壊死性細胞死の際に MLKL が活性化されることはよく知られています [44]。しかし、心筋細胞では、RIPK3 の下流のシグナル伝達経路もネクロトーシスの媒介において MLKL から独立している可能性があることが最近の研究で示されています [17、28]。今回の研究の重要な発見は、1型糖尿病性心筋症におけるRIPK3媒介壊死にはMLKLが必要であるということである。いくつかの証拠がこの結論を裏付けています。まず、高グルコース誘発心筋細胞と糖尿病の心臓では、RIPK3 と MLKL が同時に活性化されました。第二に、遺伝子欠失または薬理学的阻害剤によるRIPK3の阻害は、糖尿病条件下の心筋細胞およびマウス心臓におけるMLKL活性化をブロックした。第三に、MLKL の欠失またはノックダウンは、心筋細胞およびマウスの心臓における糖尿病状態によって誘発される壊死を軽減しました。一方、トランスヒノール A 刺激を受けた肺がん細胞では、壊死は MLKL によって媒介されるが、RIPK1/RIPK3 シグナル伝達とは独立している可能性があることが報告されている [45]。さらに、MLKLはRIPK3非依存性経路を通じて活性化されてエンドソームタンパク質の輸送と分解を促進する可能性があり[46]、これによりオートファジーの流れが調節され[47]、MLKLのネクロトーシス非依存性機能が示唆されている。しかし、今回の研究は、RIPK3が糖尿病条件下での心筋細胞壊死症の促進においてMLKL活性化を媒介することを示唆している。

注目すべきことに、現在の研究にはいくつかの翻訳的な意味合いがある。まず、抗糖尿病薬であるエンパグリフロジンとメトホルミンが心筋細胞における高血糖誘発性壊死症を予防するという最初の証拠を提供し、抗糖尿病薬の抗糖尿病効果に加えて、糖尿病の心臓合併症に対するこれらの薬の直接的な有益な効果が裏付けられました。メトホルミンの抗壊死作用は、AMPKがRIPK1-RIPK3複合体形成を阻害することが報告されている一方で、心筋細胞における高グルコース誘発性のAMPK活性化の低下を防ぐため、AMPK活性化と関連している可能性がある[48]。糖尿病状態の心筋細胞におけるエンパグリフロジンの抗壊死作用は現在不明ですが、さらなる研究の価値があります。第二に、1型糖尿病のサルモデルの使用により、壊死シグナル伝達物質であるRIPK3とMLKLが糖尿病の心臓で活性化され、糖尿病の心臓合併症の新たな治療標的となる可能性があるというトランスレーショナル証拠が得られた。第三に、RIPK3の薬理学的阻害は、1型糖尿病のマウスモデルにおける心筋細胞死と心臓病理を軽減し、糖尿病の心臓合併症に対する有用な治療介入としてネクロトーシスシグナル伝達の薬理学的阻害の可能性を示した。最後に、shRNA を介した MLKL のノックダウンは、ネクロトーシスシグナル伝達を標的とすることで、糖尿病性心筋症を軽減する in vivo の遺伝子治療の可能性をもたらしました。ただし、いくつかの制限があります。たとえば、RIPK3 と MLKL の全体的なノックアウト、または MLKL に対する shRNA の全身送達は、他の臓器に交絡的な影響を与える可能性があります。それにもかかわらず、培養成人心筋細胞を用いた我々の in vitro 研究は、心筋細胞壊死症における RIPK3/MLKL の役割を実証しています。 RIPK3 と MLKL の欠失は、正常マウスと糖尿病マウスの血糖値に影響を及ぼさなかったことに言及することが重要です。

要約すると、我々は、心筋細胞壊死症が 1 型糖尿病の心臓病理の媒介において重要な役割を果たしており、MLKL 媒介壊死症が糖尿病性心筋症に寄与しているという証拠を提供しました。したがって、ネクロプトーシスを標的とすることは、糖尿病の心臓合併症に対する心臓保護戦略として機能する可能性がある。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

混合系統キナーゼドメイン様シュードキナーゼ 1

受容体相互作用プロテインキナーゼ 3

ストレプトゾシン

エバンスブルー染料

光切断温度

クレアチンキナーゼMB

左心室

分数短縮

駆出率

乳酸脱水素酵素

ヨウ化プロピジウム

ホースラディッシュペルオキシダーゼ

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この研究は、中国国立自然科学財団（TC への助成金 NO. 82000359）、カナダ心臓脳卒中財団（TP への G-17-0018361 および G-19-0026380）、および Lawson Internal Research からの助成金によって支援されました。基金。資金提供者はこの研究では何の役割も果たしませんでした。

Ting Cao と Rui Ni は同様にこの作品に貢献しました

蘇州大学生物学医学研究所（中国蘇州）

ティン・カオ & ディン・ウェイミン

Lawson Health Research Institute、London Health Sciences Centre、VRL 6th Floor、A6-140、800 Commissioners Road、ロンドン、ON、N6A 5W9、カナダ

Rui Ni、Xiaoyun Ji、Zhuxu Zhang、Tianqing Peng

カナダ、オンタリオ州、ロンドン、ウェスタン大学病理学および臨床検査医学部門

Rui Ni、Xiaoyun Ji、Zhuxu Zhang、Tianqing Peng

NHFPC、移植工学および免疫学の主要研究室、および四川大学西中国病院再生医療研究センター（中国成都）

ラン・リー、リャオ・グアンネン、ルー・ヤンロン

米国オハイオ州シンシナティのシンシナティ医科大学薬理学およびシステム生理学部門

ファン・グオチャン

ウェスタン大学医学部、ロンドン、オンタリオ州、カナダ

Zhuxu Zhang & Tianqing Peng

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TC は実験を設計し、データを調査および分析し、原稿を作成し、提出されたバージョンを承認しました。 RN はデータを調査および解釈し、原稿を作成し、提出されたバージョンを承認しました。 WD はデータを調査および収集し、提出されたバージョンを承認しました。 XJ はデータを調査および収集し、提出されたバージョンを承認しました。 LL はデータを調査し、糖尿病のサルモデルを作成し、提出されたバージョンを承認しました。 GL はデータを調査し、サルの糖尿病モデルを作成し、提出されたバージョンを承認しました。 YL はディスカッションと実験計画に貢献し、原稿をレビュー/編集し、提出されたバージョンを承認しました。 G-CF は設計と議論に貢献し、原稿をレビュー/修正し、提出されたバージョンを承認しました。 ZZ はデザインとディスカッションに貢献し、原稿をレビュー/修正し、提出されたバージョンを承認しました。 TP は研究を設計し、データを分析し、原稿を作成/修正し、最終版を承認/提出しました。 TPはこの作品の保証人です。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Tianqing Peng への対応。

すべてのマウス実験手順は、カナダのウェスタンオンタリオ大学 (プロトコル番号: 2021-054) および中国の東州大学 (プロトコル番号: 2017-0043) の動物使用小委員会によって承認されました。すべてのアカゲザル実験は、中国四川大学西中国病院実験動物センターの動物管理使用委員会によって承認されました (プロトコル番号: 2014004A)。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

補足の図と表。

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転載と許可

Cao、T.、Ni、R.、Ding、W. 他。 MLKL 媒介壊死症は、1 型糖尿病のマウスモデルにおける心臓保護の標的です。 Cardiovasc Diabetol 21、165 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s12933-022-01602-9

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受信日: 2022 年 4 月 27 日

受理日: 2022 年 8 月 16 日

公開日: 2022 年 8 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12933-022-01602-9

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